全 文 ：第3 5 卷第 1 期
2 0 0 6 年 2 月
上海师范大学学报( 自然科学版 )
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拟南芥雄性不育基因 d s 25 4 的定位及其表达模式
张 森
( 上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 20 234 )
摘 要 : 通过 Ac/ D , 转座子 系统的诱变 , 得到拟 南芥突变体 D 2S 54 . 它的发育进程 比野生型
慢 ,植株比野生型矮小 ,连座叶柄比野生型的短 ,花芭数 目比野生型的多 ,分枝的数量比野生型
的多 ,且雄性不育 . 遗传分析表明突变体属于隐性单基因突变 ,稳定遗传 , 并且与 sD 是紧密连
锁的 ,可能是 sD 插入直接引起的突变 . TA IL 一 P CR 的方法将该基因定位在第 4 条染色体上 .
D s 上携带的 G U S 基因表达的初步分析表明 , G US 基因在突变体的花药和连座叶中表达 ,说明
该塞因也可能在这些部位表达 . 突变体的表型分析结果说明该基因可能在植物的许多发育过
程中起作用 .
关键词 : 拟南芥 ;雄性不育突变体 ; sD ; G US ; p 一 葡糖醛酸酶
中图分类号 : 9Q 43 . 2 文献标识码 : A 文章编号 : 10 一 l5 37( 2o6 ) 01 胡 o 仍
0 引 言
雄性不育是高等植物生命活动中的一个普遍现象 ,与雄蕊 , 花药和花粉的发育密切相关 . 雄性不育
基因的克隆有利于人们对这些组织和器官发育的深人研究 . 雄性不育又是生产上杂交育种的基础 , 因此
雄性不育现象的研究及不育基因的克隆既具有理论意义 ,又有潜在的应用价值 .
拟南芥基因组小 ,生长周期短 ,结子量大 ,已经作为模式植物用于功能基因的分离 . 拟南芥全基因组
测序的完成川 , 加快了人们对基因功能的研究 . 目前已从拟南芥中分离出 20 多个雄性不育基因包括
a t p l [ ’ J
, ” n l {’ ] , 。 y 7P 4 a [` ] , m以 [ , ] , 。 m s 一〔6 ]以及 m s l ( , 3基因等 . 据文献报道大约有 3 50 个基因在拟南芥
花药中表达 ,其中 60 一 10 个基因为花药发育所必需 ,任何一个基因的突变都可能会导致雄性不育 t吕 ] .
因此 ,拟南芥中尚有许多不育基因未得到克隆 .
本文通过农杆菌介导 的 Ac/ D s 转座子系统诱变拟南芥植株 , 分离得到了一棵雄性不育突变体
D 2S 5 4
,并对该突变体进行了表型分析 ,所得结果为进一步阐明植物雄性不育的机理奠定了基础 .
1 材料与方法
1
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1 材料
1
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1
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1 植物材料
拟南芥以 肠dn sbe gr e er c at (肠 r ) )为遗传背景 ,植物的培养方法见文献【9 ] .
1
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1
.
2 含有 D s 因子的 T 一D NA 结构
D s
一
T
一
DN A 结构见文献【9] . 它带有卡那霉素抗性基因 Np T l l ,用来筛选转基因植物 . 含有潮霉素抗
收稿日期 : 20 -5 1 折
基金项目 : 上海市教育委员会科学研究项目课题资助 ( N O , 05 D及2 ) ,上海师范大学博士启动基金资助 ( P匕 24 ) ,
作者简介 : 张森 ( 19 63 一 ) , 男 ,博士 ,上海师范大学生命与环境科学学院讲师 .
第 1期 张 森 :拟南芥雄性不育基因 d 2 s 4 5的定位及其表达模式
性基因 aph 4的 Ds因子插在 3 5 5启动子和氯磺隆抗性基因 AL S之间 ,氯磺隆抗性基因 A玲 可用来检测
D s 因子的转座事件 .
1
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2
1
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2
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1
方法
单拷贝 D s 一 T 一 DN A 植株与 A c 植株的杂交及杂交结果的鉴定
单拷贝 sD 一 T 一 DN A 插人植物的筛选 ,具体方法见文献【9 ] . 以 A c 纯合子植株为母本 , sD 一 T -
D NA 植株为父本 ,进行杂交 . 杂交后的果荚成熟后 ,单荚收子得到 lF 种子 . A 。 植株具有卡那霉素抗性 ,
而 D s 一 T 一 D N A 植株除了具有卡那霉素抗性外 ,还有潮霉素抗性 . 因此 ,将 lF 种子种在含有卡那霉素
和潮霉素的 PN S 固体培养基上 ,萌发后能正常生长 ,根较长的绿苗为杂交成功的植株 1F 植物 . 将这些
杂交成功的 lF 植株移人土中 ,生长至成熟 ,然后单株收种子 ,得到 兄 种子 .
1
.
2
.
2 突变体的筛选和分析
将上述兄 种子均匀的涂布在含有潮霉素和氯磺隆的 P NS 固体培养基上 ,把抗潮霉素和抗氯磺隆
且生长正常的幼苗移栽到土中生长 , 同时观察有否出现表型有变化的植株 ,成熟后单株收子 , 得到 3F 种
子 . 将 F’3 代种子播种于土中生长 , 同时观察记录出现表型变化的植物 . 用解剖显微镜分析野生型和突变
体整体植物或器官 ,用数码相机给植物拍照 ,
1
.
2
.
3 TA IL
一 PC R 的方法定位 sD
T A IL 一 P e R 依照 u u 等的方法〔’ 。 ] . n , 5 ,端引物序列是 : n s s ’ 一 1 , e e e T’ 门{ A e C GT r 竹G TA T A T C
C C G ; D s s
’ 一 2 , C G T CT C GT T C G T I
,
1
,
I
,
TA C C
;和 D s ` 一 3 , GGT C G G T A C G G A AT T C T C C C . D s 3 ’弓!
物序列是 : D s 3 ’ 一 l , CG A rI’T A C C G T AT 竹A T C C C GT T CG ; D s 3 ` 一 2 , C C G G T A T A T C C C G TT T T C G ;和
D s3
’ 一 3 , G TT A CC G A C CGT T l
,
r C AT C C
.
D s s
’端和 sD 3 ’ 端的 3 个引物分别与 3 个随机引物 ADI , A DZ
和 AD 3[ ’ “ ,川 当中的 l 个配对组合进行 PC R ,扩增 D s 两端旁临序列 . TA IL 一 P C R 产物于 1 . 5% 的琼脂糖
凝胶上电泳进行分析 . TA IL 一 P CR 产物的回收方法 ( DN A 片段快速纯化 / 回收试剂盒 , 北京鼎国生物技
术有限责任公司 ) . AT IL 一 p C R 产物进行测序 ,其序列与 N C B I ( 即 : ht e N a ti o n a l C e n t e r fo r B i o te c h n o l o盯
Ifon mr
a it o n )中 G e n b a n k 数据库和拟南芥数据库 ( S at n fo r d U n i v e r s i t y , S t a n fo dr , CA )中基因组全序列进行
比对 , 即可找到 sD 在拟南芥基因组中的位置 .
1
.
2
.
4 G U S 染色
将 D2S 54 突变体生长不同时期的组织器官取下 , 放在离心管中 , 加人适量的 G u s 染色液 〔” ] . 在
37 ℃放置 4 8 h 后 ,显微镜下观察 G U S 的表达 .
2 结果与分析
2
.
1 D 2S 5 4 突变体的表型分析
D S 2 5 4 突变体是我们从 A c/ D 。 转座子系统诱变野生型拟南芥得到的 一个以 aL dn sb e gr e er ct a
( eL
r
) )为遗传背景的 sD 插人突变体 , 主要表型是突变体生长发育慢 ,野生型植物已开始抽苔 ,而突变
体还没有抽苔 (图 I A ) ;花序的花苞数目比野生型的多 ,平均多 10 个花苞 ,花苞紧凑 ( co m p ac t flo w er s )
(图 I B ) ;连座叶柄短 ,株型紧凑 (图 I A , C ) ;植株矮小 ,一般是野生型的一半高 ;分枝多 ,平均比野生型
的多 2 个分枝 ;雄性不育性 ( 图 I D ) .
2
.
2 D S 2 54 突变体的遗传分析
以 D 2S 54 突变体为母本 , 野生型 玩 r 为父本杂交后 , 得到的 lF 代全部为野生型表型 . IF 代 自花受
粉得到兄 代种子 . 将这些种子种下后得到 兄 的植物群体 ,统计发现其中野生型与突变体表型呈 3 , 1
分离 ,说明 D2S 54 突变体是隐性单基因突变 ,
2
.
3 D s2 5 4 突变体中 D s 定位
D2S 54 突变体是 Ds 插人突变体 ,用 T IA L 一 P CR 的方法 ,扩增了 sD 因子的旁临序列 ,对 sD 因子进
行了定位 . 结果表明 D S 254 突变体中 sD 旁临序列与第 4 条染色体上 B A C 克隆 1T 96F 的一段序列匹配 ,
上海师范大学学报 (自然科学版 )X ) 2 6 (年
人 ; 02d龄野生型 (左 )和突变体 (右 )幼苗 ;B :成熟早期野生型 (左 )和 D S 2 54突变体〔右 )的花序 ;
:
02d龄野生型 (左 )和突变体 (右 )连座叶 ;D :成熟期野生型 (左 )和突变体 (右 )的植物 .图中短线都代表 s m m .
图 1D s 254突变体和野生型植物形态比较
并且与该克隆上的 A t 49 24 1 1 0基因的序列匹配 ,说明其 sD 因子插人第 4 条染色体的 B AC 克隆 1T 9 6F
上 , 而且是位于该克隆上的 A t4 夕4 1 or 基因中 .
2
.
4 DS 和突变位点之间的连锁分析及基因 山业5 4 的定位
我们在 玩 r x D 2S 54 突变体杂交凡 代群体中分单株提取 12 0 个 D2S 54 突
变体表型植物的 DN A ,在 D 。 插人位点的两边设计一对相向的引物 ,再加上 sD
3端或 5端的引物 , 以野生型 DN A 和突变体 D N A 为对照进行 P C R ,结果 120 个
D S25 4 突变体表型单株的 P C R 产物条带都与突变体的 P CR 产物条带大小相
同 ,说明这些突变体的表型和 sD 因子是一起遗传的 ,因此可以说 sD 和突变位
点之间是紧密连锁的 .
连锁分析的实验结果证明控制 D S 254 突变体表型的 d s 254 基因和 D s 因
子是紧密连锁的 , 所以如果定位出 sD 因子的位置 ,也就相应地找到了 d s2 54
基因的位置 . d s2 54 基 因可能就是第 4 条染色体上 B A C 克隆 1T 9 6F 上 的
A 4t g24 l or 基因 (图 2 ) .
2
.
5 D s2 5 4 突变体中 G sU 基因的表达
sD 因子上含有 G U S 报告基因 ,在插人基因组以后 , GU S 必须依靠基因组
中基因的启动子才能表达 . 因此 , 可以通过 G U S 基因的表达来研究基因的表
达 . 取突变体幼苗以及不同时期植物的根 、茎 、 叶 、花 、 花序和果英进行 G u S 染
色 ,结果发现在突变体的花药和连座叶中都有 GU S 染色 ( 图 3) .
— I一 人C
! 14 一 .一 I)5 2弘
12 一 .一形书汾
竖的粗线段表示拟南芥
第四条染色体 . 紧靠竖的
粗线段左边的数字代表染
色体上的位置 (单位 :
10
减灿 ) . 竖的粗线段
右边的文字中斜体字 AC
和 R飞2 是两个 m a浅 er
基因 .
图 2 D s2 54 基因在染色体
上定位物理图
A
. 连座叶 ; B . 花
图 3 Ds2 5 4突变体 G U S 染色
第 1期 张 森 :拟南芥雄性不育基因 d以 4 5的定位及其表达模式
3讨 论
3
.
1雄性不育基因 d 2 s4 5的定位
通过 A/ cD s转座子系统诱变 ,筛选分离到有单基因控制的突变体 ,实验结果证明该突变体是由 sD
直接插人造成的 ,并且突变表型与 sD 是紧密连锁的 , 因此可以利用 TA IL 一 PC R 的方法定位基因 . 最终
把雄性不育基因定位在第 4 条染色体上 BA C 克隆 IT 96F 上 (图 2 ) ,而且很可能就是 A t4 解41 10 基因 . 根
据拟南芥数据库网站
~
.
a ar ib d叩 is . ogr 上提供的信息及生物信息学分析 , A t4 薛4 1 10 基因是一个功
能未知的基因 ,因此 , 我们所发现的雄性不育基因 d s2 54 是一个尚未被克隆的新基因 .
3
.
2 雄性不育基因 d口 5 4 时空表达模式
D s 结构中带有 GU S 报告基因 ,该报告基因需要基因组中基因的启动子才能表达 . 因此 GU S 基因的
表达模式即代表了 D s 因子所插人基因的表达模式 〔” , ’ 4 〕 . 本实验的结果表明 d s2 54 基因在突变体花药和
连座叶中都有表达 ( 图 3 ) . 说明 d s2 54 基因可能在植物的这些部位产生作用 ,或者说 d s 254 基因调控了
以上这些部位的生长发育 〔` , ] . 目前我们在准备克隆该基因 ,并进一步分析其在生长发育过程中的功能 .
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