全 文 ：基因组学与应用生物学，2011年，第 30卷，第 1期，第 21-26页
Genomics and Applied Biology, 2011, Vol.30, No.1, 21-26
研究报告
A Letter
Col生态型拟南芥 AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建
范丙友 1* 高水平 2 侯小改 1 胥华伟 1 史国安 1 孔祥生 1
1河南科技大学农学院,洛阳, 471003; 2河南科技大学林学院,洛阳, 471003
*通讯作者, fanbingyou2005@163.com
摘 要 隶属于 MADS-Box基因家族的拟南芥花器官 B类特征基因 APETALA3 (AP3)在花瓣和雄蕊中特
异性地表达；AP3基因编码转录因子，与 A类和 C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。
研究表明 AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此，AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与
花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据 GenBank数据库报道的 Ler生态型拟南芥(Arabido-
psis thaliana) AP3基因启动子序列(U30729)设计了一对特异性扩增引物，基于 PCR技术，用高保真的 KOD-
plus DNA聚合酶扩增了长度为 1 767 bp的 Col生态型拟南芥 AP3基因启动子，并命名为 pAtAP3，其 Gen-
Bank登录号为 FJ619533。Bl2seq在线分析表明 pAtAP3与 U30729序列的相似性达 98%，与 Col生态型拟南
芥 BAC克隆 T12E18 (AL132971) 9 264~11 030之间的碱基序列相似性达 100%，且该段序列的下游基因编
码 AP3蛋白(CAB81799)，说明克隆序列为 Col生态型拟南芥 AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明
pAtAP3 具有基本的启动子元件 TATA-box 和 CAAT-box，还包含大量与花特异表达相关的顺式元件
CArG1、CArG2、CArG3和 anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体 pAtAP3::GUS，为该启动子的功
能鉴定奠定了基础。
关键词 拟南芥, Col生态型, APETALA3启动子,植物表达载体构建
Molecular Cloning of Promoter of AP3 Gene from Arabidopsis thaliana (E-
cotype Col) and Construction of Plant Expression Vector
Fan Bingyou 1* Gao Shuiping 2 Hou Xiaogai 1 Xu Huawei 1 Shi Guoan 1 KongXiangsheng 1
1 College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang, 471003; 2 College of Forestry, Henan University of Science and
Technology, Luoyang, 471003
* Corresponding author, fanbingyou2005@163.com
DOI: 10.3969/gab.030.000021
Abstract Belonging to MADS-Box gene family, Arabidopsis floral organ identity B gene APETALA3 (AP3) is
expressed in petals and stamens specifically. AP3 gene which encodes a transcription factor controls the develop-
ment of petals and stamens of dicotyledons, in combination with the class A and C genes, respectively. It indicated
that the promoter of AP3 gene was a flower-specific expression promoter. Therefore, cloning and characterization
of AP3 gene promoter from Arabidopsis thaliana will have significant effects on the oriented improvement of the
commercial traits related to the flowers of ornamental plants. Here, a pair of specific PCR primers was designed
according to promoter sequence of AP3 gene of Arabidopsis thaliana (ecotype Ler) reported in GenBank (U30729).
A 1 767 bp long sequence of AP3 gene promoter was isolated from Arabidopsis thaliana (ecotype Col) by using
PCR technique with high-fidelity DNA polymerase KOD-plus. The GenBank accession of pAtAP3 is FJ619533.
Online Bl2seq analysis indicated that the sequence similarity between pAtAP3 and U30729 was 98% . It also
showed that the sequence similarity between pAtAP3 and the base from 9 264 to 11 030 of BAC clone T12E18
(AL132971) of Arabidopsis thaliana (ecotype Col) was up to 100%, and its downstream sequence encoded AP3
基金项目：本研究由国家自然科学基金(30740013)和河南省高等学校青年骨干教师资助计划(2010GGJS-075)共同资助
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
protein (CAB81799), which approved that the cloned sequence was promoter of AP3 gene of Arabidopsis thaliana
(ecotype Col). Online PLACE analysis revealed that pAtAP3 contained basic cis-elements of promoter such as
TATA-box and CAAT-box. It also comprised of several cis-elements like CArG1, CArG2, CArG3 and anther-box,
which were all related to flower-specific expression. Moreover, plant expression vector of pAtAP3::GUS was suc-
cessfully constructed, laying the foundation for functional characterization of the AP3 promoter of Arabidopsis
thaliana (ecotype Col).
Keywords Arabidopsis thaliana, Ecotype Col, Promoter of APETALA3, Construction of plant expression vector
基于对拟南芥 (Arabidopsis thaliana)和金鱼草
(Antirrhinum majus L.)花同源异型突变体的研究，
Coen和 Meyerowitz (1991)提出了花发育的 ABC模
型，随后该模型被 Angenent和 Colombo (1996)进一
步扩充为 ABCD模型。在花发育的遗传网络中，花器
官特征基因(floral organ identity gene)决定花器官原
基发育成萼片、花瓣、雄蕊或心皮。植物花器官 B类
特征基因 APETALA3 (AP3)编码转录因子，隶属于
MADS-Box基因家族。AP3基因在花瓣和雄蕊中特
异性地表达，与 A类特征基因和 C类特征基因协同
作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育(Krizek 和
Meyerowits, 1996)。启动子表达特性的分析显示了
AP3基因启动子为花器官特异表达启动子(Verdonk
et al., 2008)。
应用生物技术对植物的重要商业性状进行遗传
改良时，如果导入的异源基因在 CaMV 35S等组成
型启动子介导下表达，就可能抑制转基因植物的生
长和发育；而在花特异表达启动子的调控下，外源基
因可特异性地在花器官中表达，一方面可增加区域
表达量，另一方面也不会对转基因植株的发育带来
不良影响；因此花特异表达启动子对园林植物商业
性状的定向改良具有极其重要的应用价值(Fan et al.,
2010;高水平等, 2010)。目前 Ler生态型拟南芥的 AP3
启动子已经被克隆(Koch et al., 2001)，特异位点突变分
析 (site-specific mutagenesis)表明 CArG1、CArG2 和
CArG3 等顺式元件与 AP3 基因的花特异性表达密
切相关(Tilly et al., 1998)。在 Ler生态型拟南芥 AP3
启动子的调控下，异源的农杆菌(Agrobacterium tume-
faciens) ipt (isopentenyltransferase, 异戊烯基转移酶)
基因能够在转基因矮牵牛(Petunia hybrida)花器官中
特异性地表达，结果表明转基因矮牵牛花朵的直径
及鲜重得到显著增加，而营养体的大小与非转基因
植株相当(Verdonk et al., 2008)，该研究为进一步应用
花特异表达启动子定向改良园林植物与花器官相关
的商业性状提供了理论和实践依据。在拟南芥众多
生态型中最常用的 3 个是 Landsberg erecta (Ler)、
Columbia (Col)和Wassilewskija (Ws），这些生态型在
形态发育和生理反应方面存在很大差异(张振桢等,
2006)。到目前为止，Col生态型拟南芥 AP3基因启动
子尚未见报道，为此我们克隆了 Col生态型拟南芥
AP3基因启动子(GenBank序列号 FJ619533)并进行
了生物信息学分析，构建了 pAtAP3::GUS植物表达
载体，以期为深入阐明 Col生态型拟南芥 AP3基因
启动子的功能和机制奠定基础，并最终为定向改良
园林植物与花相关的商业性状积累资料。
1结果与分析
1.1 pAtAP3的 PCR扩增
以 Col生态型拟南芥幼嫩叶片总 DNA为模板，
用高保真的 KOD-plus DNA聚合酶成功扩增出拟南
芥 AP3基因启动子 DNA片段(图 1)，PCR产物大小
约为 1 800 bp，与理论预测的目标 DNA长度相符。
1.2 pAtAP3的克隆
用 DNA回收试剂盒回收 PCR扩增产物，回收
产物 3末端经加 A反应后与 pMD18-T克隆载体过
夜连接，连接产物热激法转化大肠杆菌 DH5α感受
态细胞，37℃恒温培养箱中过夜培养后对重组子进
图 1拟南芥 AP3基因启动子的扩增产物
注: M: DNAMarkerⅢ; 1~2:拟南芥 AP3基因启动子扩增产物
Figure 1 Agarose gel separation of PCR product of pAtAP3
Note: M: DNA MarkerⅢ; 1~2: PCR product of pAtAP3
22
行菌落 PCR和质粒 PCR初筛，进一步对重组子进行
HindⅢ和 Xba Ⅰ双酶切鉴定，双酶切产生的 2 条
DNA长度分别为 1 800 bp和 2 800 bp (图 2)，与预期
酶切生成的 pAtAP3及 T载体片段的长度一致，表明
可以进行下一步的测序工作。
1.3 Col生态型拟南芥 AP3启动子测序结果及序列
分析
2个重组子的测序结果完全一致，测序结果表明
Col生态型拟南芥 AP3基因启动子长 1 767 bp (图3)。
基于 bl2seq程序的双序列比对分析显示克隆的 pAt-
AP3序列与 U30729序列的相似性为 98%，表明不同
生态型拟南芥 AP3 基因启动子序列之间存在多态
性。BLAST在线分析表明克隆的 pAtAP3序列与 Col
生态型拟南芥第 3染色体 BAC克隆 T12E18 (Gen-
Bank No. AL132971) 9 264~11 030之间的碱基序列
的相似性达 100%，且该序列下游基因编码 AP3蛋白
(GenBank No. CAB81799)，由此证实克隆序列为 Col
生态型拟南芥 AP3 基因启动子。该序列已经提交
图 2重组质粒 HindⅢ和 Xba Ⅰ双酶切琼脂糖电泳图
注: M: DNA MarkerⅢ; 1~2:重组质粒经 HindⅢ和 XbaⅠ双
酶切
Figure 2 Agarose gel electrophoresis of recombinants digested by
HindⅢ and XbaⅠ
Note: M: DNA MarkerⅢ; 1~2: Recombinants digested by Hind
Ⅲ and XbaⅠ
图 3 Col生态型拟南芥 AP3基因启动子序列
注:方框表示启动子的特异表达调控作用元件
Figure 3 Sequence of promoter from pAtAP3 (ecotype Col)
Note: Boxes indicate the specific expression element of promoter
GenBank，登录号为 FJ619533。
PLACE在线分析结果显示在 1 205~1 210 bp之
间有一个 TATA box (TTATTT)，其主要功能是保证
转录得以精确起始；在 154~157 bp、328~331 bp、
Col生态型拟南芥 AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建
Cloning of Promoter of AP3 Gene from Arabidopsis thaliana and Construction of Plant Expression Vector 23
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
878~881 bp、1 252~1 255 bp、1 469~1 472 bp和 1 619~
1 622 bp之间含有 6个 CAAT box，决定着启动子的
起始频率；在 pAtAP3 序列中含有 3 个 MADS-box
蛋白的结合位点保守元件 CArG-box，这 3个 CArG-
box与 AP3基因在花瓣和雄蕊中的特异性表达直接
相关(Koch et al., 2001; Tilly et al., 1998)，其中在 1 551~
1 568 bp之间含有 CArG1-box (GTTTACATAAATG
GAAAA)，该元件是 AP3/PI异源二聚体结合位点，在
1 599~1 616 bp处含有 CArG2-box (CTTACCTTTC
ATGGATTA)，该元件的突变导致 AP3基因在花瓣
中的表达量降低，但在雄蕊中的表达量不改变，在
1 624~1 641 bp处含有 CArG3-box (CTTTCCATTTT
TAGTAAC)；另外在 114~118 bp、955~959 bp 处有
2 个 anther box (AGAAA)，它是 AP3 基因在花药中
特异性表达的核心顺式元件(Tunen et al., 1989)；但未
检测到存在于矮牵牛 CHS基因启动子中与花特异表
达相关的 G-box (Staiger et al., 1989)和 TACPyAT-box
元件(van der Meer et al., 1992)。
1.4植物表达载体 pAtAP3::GUS的构建
将提取的空载体 pBI121质粒和重组质粒 pMD18-
T-pAtAP3 分别用 Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ双酶切，回收
pBI121 双酶切产生的大片段(图 4)以及重组质粒
pMD18-T-pAtAP3双酶切产生的小片段(图 2)。回收
产物经连接、转化后进行菌落 PCR初筛，应用质粒
PCR进一步鉴定，质粒 PCR电泳结果表明扩增出
1 800 bp的目标条带(图 5)，说明成功构建出 pAtAP3
融合 GUS标记基因的植物表达载体 pAtAP3::GUS。
2讨论
园林植物的基因工程涉及花朵的颜色、花型及
直径等多种性状的改良，因此花特异性表达启动子
的克隆及功能鉴定对于园林植物花器官性状的定向
改良具有重要的应用前景(Fan et al., 2010;高水平等,
2010)。黄瓜是单性花发育受激素调控的模式植物，已
有的研究表明乙烯促进黄瓜雌花的发育，在拟南芥
AP3基因启动子的驱动下，转入黄瓜(Cucumis sativus
L.) ACO2 (ACC氧化酶)基因后拟南芥植株营养生长
形态未发生变化，但所有花均表现不育，且其不育是
由不正常的雄蕊导致的，而心皮保持正常的功能；异
常的雄蕊表型是由于转基因拟南芥的花芽中 ACO2
酶活性较对照增加 20%造成的(Duan et al., 2008)，该
研究证实了拟南芥 AP3基因启动子用于精细调控花
器官性状的潜在应用价值。
本研究克隆了 Col生态型拟南芥 AP3启动子，
该序列已登录 GenBank数据库(FJ619533)。对启动
子序列进行了生物信息学分析，表明该启动子含有
多种与花特异表达相关的顺式元件。构建了 pAtAP3::
GUS融合表达载体，为进一步开展 Col生态型拟南
芥 AP3启动子的表达特性及其花特异性表达机制提
供了研究材料，同时为应用 Col生态型拟南芥 AP3
启动子定向改良园林植物与花相关的商业性状奠定
了一定基础。
3材料与方法
3.1植物材料
Col生态型拟南芥莲座期幼嫩叶片用于总 DNA
提取。
3.2菌种、质粒与试剂
KOD-plus DNA 聚合酶购自日本 TOYOBO 公
司；植物表达载体 pBI121及 E. coli菌株 DH5α保存
图 4 pBI121空载体 HindⅢ＋XbaⅠ双酶切琼脂糖电泳图
注: M: DNA Marker Ⅲ; 1~2: pBI121/Hind Ⅲ＋ Xba Ⅰ双酶切
产物
Figure 4 Agarose gel separation of pBI121 digested by Hind Ⅲ＋
XbaⅠ
Note: M: DNA Marker Ⅲ ; 1~2: pBI121 digested by Hind Ⅲ＋
XbaⅠ
图 5 pAtAP3::GUS表达载体的 PCR鉴定
注: M: DNA MarkerⅢ; 1~4: PCR扩增产物
Figure 5 Agarose gel separation of PCR products
Note: M: DNA MarkerⅢ; 1~4: PCR products
24
于本实验室；pMD18-T克隆载体、质粒提取及 DNA
回收试剂盒、内切酶HindⅢ和 XbaⅠ为 Takara (大连)
公司产品；DNA 分子量标准 Marker Ⅲ和 Taq DNA
聚合酶为天根(北京)公司产品。
3.3拟南芥叶片总 DNA提取及引物设计
拟南芥叶片总 DNA的提取采用 CTAB改良法
进行(Mummenhoff 和 Koch, 1994)，总 DNA 终浓度
调整为 50 ng/μL。应用 Primer Premier 5.0软件，基于
GenBank数据库报道的 Ler生态型拟南芥 AP3启动
子序列(U30729)及 pBI121 质粒中 35S 启动子上下
游的多克隆位点，设计一对特异性 PCR扩增引物。
上游引物利用了扩增序列中本身具有的 HindⅢ酶
切位点，其序列为 5-AAGCTTCTTAAGAATTATA
GTAGCACTTGTT-3，而下游引物中插入了 XbaⅠ
酶切位点，其序列为 5-TGCTCTAGAATTCTTCTCT
CTTTGTTTAATC-3，引物由北京奥科生物技术有
限公司合成。
3.4 pAtAP3的 PCR扩增
PCR扩增体系体积为 50 μL，其中含有 10×PCR
Buffer 5 μL，2.0 mmol/L each dNTP 5 μL，Col生态型
拟南芥叶片总 DNA 1 μL，25 mmol/L MgSO4 3 μL，
10 pmol/μL 上游和下游引物各 1.5 μL，KOD-plus
DNA聚合酶 1 μL，ddH2O 32 μL。PCR扩增程序为
95℃预变性 4 min；然后进行 35个扩增循环，95℃变
性 30 s，52℃退火 30 s，68℃延伸 2min 30 s；最后 68℃
延伸 7 min。PCR扩增产物在 1%琼脂糖凝胶中进行
电泳分离。
3.5 pAtAP3克隆与序列测定
用宝生物公司的 DNA纯化回收试剂盒回收并
纯化 PCR扩增产物。由于高保真的 KOD-Plus DNA
聚合酶不能对 PCR扩增产物的 3端加 A，因此在将
目的片段克隆到 pMD18-T载体之前，要对其 3末端
进行加 A反应。加 A反应总体系为 10 μL，其中含纯
化的 PCR 产物 8 μL，2.5 mmol/L each dNTP 0.8 μL，
PCR Buffer 1 μL，Taq DNA聚合酶 0.2 μL；加 A反应
程序为 72℃延伸 30 min。加 A产物与 pMD18-T载体
连接后用热激法转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，转
化子经菌落 PCR和质粒 PCR初筛，然后 HindⅢ和
XbaⅠ双酶切进一步鉴定，最后得到的阳性重组子
命名为 pMD18-T-pAtAP3，委托生工生物工程(上海)
有限公司进行序列测定。
3.6 pAtAP3序列的生物信息学分析
将获得的 DNA 序列提交到 NCBI网站(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行注册；应用 BLAST分析
工具中的 bl2seq 程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
Blast.cgi)对克隆的 pAtAP3序列及 U30729序列进行
在线比对；应用在线的 PLACE (Higo et al., 1999)分析
工具(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)
对克隆的 pAtAP3序列进行顺式元件分析。
3.7植物表达载体 pAtAP3::GUS的构建
为了进一步对 Col生态型拟南芥 AP3启动子的
表达特性进行分析，需构建 pAtAP3::GUS植物表达
载体。HindⅢ和 XbaⅠ双酶切 pMD18-T-pAtAP3阳
性重组子及空载体 pBI121，分别回收阳性重组子双
酶切后产生的小片断及空载体双酶切后产生的大片
段，二者过夜连接后转化大肠杆菌 DH5α感受态细
胞，选用 50 μg/mL卡那霉素筛选转化子，菌落 PCR
初筛后再进一步应用质粒 PCR 验证植物表达载体
构建的正确性。
参考文献
Angenent G.C ., and Colombo L., 1996, Molecular control of
ovule development, Trends in Plant Sci., 1(7): 228-232
Coen E.S., and Meyerowitz E.M., 1991, The war of the whorls:
Genetic interactions controlling flower development, Na-
ture, 353(6339): 31-37
Duan Q.H., Wang D.H., Xu Z.H., and Bai S.H., 2008, Stamen
development in Arabidopsis is arrested by organ-specific
overexpression of a cucumber ethylene synthesis gene
CsACO2, Planta, 228(4): 537-543
Fan B.Y., Gao S.P., Hou X.G., and Shi G.A., 2010, Cloning of a
flower-specific expression promoter from Arabidopsis thali-
ana and its plant expression vector construction, Forestry
Studies in China, 12(4): 201-205
Gao S.P., Fan B.Y., Shi G.A., Jia X.P., and Kong X.S., 2010,
Cloning and sequence analysis of promoter of chalcone syn-
thase gene from Petunia Hybrida and construction of plant
expression vector, Beifang Yuanyi (Northern Horticulture),
17: 155-158 (高水平, 范丙友, 史国安, 贾小平, 孔祥生,
2010,矮牵牛 CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表
达载体构建,北方园艺, 17: 155-158)
Higo K., Ugawa Y., Iwamoto M., and Korenaga T., 1999, Plant
cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database ,
1999, Nucleic Acids Research, 27(1): 297-300
Koch M.A., Weisshaar B., Kroymann J., Haubold B., and
Mitchell-Olds T., 2001, Comparative genomics and regula-
Col生态型拟南芥 AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建
Cloning of Promoter of AP3 Gene from Arabidopsis thaliana and Construction of Plant Expression Vector 25
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
tory evolution: Conservation and function of the Chs and
Apetala3 promoters, Mol. Biol. Evol., 18(10): 1882-1891
Krizek B.A., and Meyerowits E.M., 1996, The Arabidopsis
homeotic genes APETAGA3 and PISTILLATA are sufficient
to provide the B class organ identity function, Development,
122(1): 11-22
Mummenhoff K., and Koch M., 1994, Chloroplast DNA restric-
tion site variation and phylogenetic relationships in the
genus Thlaspi sensu lato (Brassicaceae), Syst. Bot., 19(1):
73-88
Staiger D., Kaulen H., and Schell J., 1989, A CACGTG motif of
the Antirrhinum majus chalcone synthase promoter is recog-
nized by an evolutionary conserved nuclear protein, PNAS,
86: 6930-6934
Tilly J.J., Allen D.W., and Jack T., 1998, The CArG boxes in the
promoter of the Arabidopsis floral organ identity gene
APETALA3 mediate diverse regulatory effects, Develop-
ment, 125(9): 1647-1657
Tunen A.J., Hartman S.A., Mur L.A., and Mol J.N.M., 1989,
Regulation of chalcone flavonone isomerase (CHI) gene ex-
pression in Petunia hybrida: The use of alternative promters
in corolla, anthers and pollen, Plant Mol. Biol., 12 (5):
539-551
van der Meer I.M., Brouwer M., Spelt C.E., Mol J.N.M., and Stu-
itje A.R., 1992, The TACPyAT repeats in the chalcone syn-
thase promoter of Petunia hybrida act as a dominant nega-
tive cis-acting module in the control of organ-specific ex-
pression, The Plant J., 2(4): 525-535
Verdonk J.C., Shibuya K., Loucas H.M., Colquhoun T.A., Un-
derwood B.A., and Clark D.G., 2008, Flower-specific ex-
pression of the Agrobacterium tumefaciens isopentenyltrans-
ferase gene results in radial expansion of floral organs in
Petunia hybrida, Plant Biotechnol. J., 6(7): 694-701
Zhang Z.Z., Xu Y.Q., and Huang H., 2006, Aribidopsis, a power-
ful tool for exploring the mysteries of plant kingdom, Sheng
ming Kexue (Chinese Bulletin of Life Sciences), 18 (5):
442-446 (张振桢,许煜泉,黄海, 2006,拟南芥——一把打
开植物生命奥秘大门的钥匙,生命科学, 18(5): 442-446)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Call for Papers-Genomics and Applied Biology
(ISSN 1925-1602)
Genomics and Applied Biology (GAB) (ISSN1925-1602) is an internati-
onal open access and peer review journal, containing original research pap-
ers, involving in the structural genomics, functional genomics, comparative
genomics and basic theory and application technology of applied biology based
on genomics.
All papers accepted for publishing should be innovative research work in
fields of genomics and applied biology, particular in the research on genomic
structure and function, evolutionary and comparative genomics, genomics and
bioinformatics, gene expression and its function identification, etc. The primary
criteria for publication is new insights that are not only of broad interest to bio-
logists, geneticist and molecular biologist, but also to satisfy the populations of
this journals who are engaging in the development and marketing of biotechn-
ology.
GAB offers a fast publication schedule (normally 2~4 weeks) and maintaining strictly peer reviewing.
You can submit your manuscript by online submission system or via email: edit@gab.sophiapublisher.com.
To find out more about the journal or to sign up to receive regular email article alerts, please visit: http://gab.
sophiapublisher.com.
26