全 文 ：第３９卷第２期
２０１６年３月
河 北 农 业 大 学 学 报
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＨＥＢＥＩ
Ｖｏｌ．３９Ｎｏ．２
Ｍａｒ．２　０　１　６
文章编号：１０００－１５７３（２０１６）０２－０００９－０６　 ＤＯＩ：１０．１３３２０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊａｕｈ．２０１６．００２６
ＡｔＡＨＡ１０参与拟南芥幼苗盐胁迫响应的信号
转导机制初探
刘　婷，　谢世英，　王玉芳，　尚忠林
（河北师范大学 生命科学学院，河北石家庄 ０５００２４）
摘要：为了探究质膜质子泵ＡＨＡ１０在盐胁迫响应中的作用，本试验以拟南芥ＡＨＡ１０缺失突变体ａｈａ１０－１幼
苗为材料，检测了盐胁迫条件下幼苗根和子叶的生长状况。结果显示，ａｈａ１０－１幼苗在０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理条
件下，主根长度明显短于野生型，子叶生长状况与野生型相同，说明 ＡＨＡ１０可能在幼苗根盐胁迫响应过程中
发挥了正向调节作用。电生理检测结果显示，盐处理后野生型根细胞质膜钙电流明显增强，而ａｈａ１０－１根细胞
质膜钙电流未见明显变化，表明ＡＨＡ１０可能在盐胁迫激活钙信号过程中发挥了介导作用。
关　键　词：盐胁迫；拟南芥；质子泵ＡＨＡ１０；钙电流
中图分类号：Ｑ９４６０．１　　 文献标志码：Ａ
　　收稿日期：２０１５－１１－２０
　　基金项目：河北省高等学校科学技术研究项目（Ｑ２０１２０６５）；河北师范大学自然科学科研基金重点基金项目（Ｌ２０１２Ｚ０４）；
河北师范大学自然科学科研基金博士基金项目（Ｌ２０１１Ｂ１１）资助．
　　作者简介：刘　婷（１９８１－），女，河北省石家庄市人，博士，讲师，主要从事植物生物学研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｔｉｎｇ＿８１＠１６３．ｃｏｍ
　　通讯作者：尚忠林（１９７０－），男，河北省沧州市人，博士，教授，主要从事植物抗逆与发育研究．
Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈａｎｇｚｈｏｎｇｌｉｎ＠ｍａｉｌ．ｈｅｂｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｐｒｉｍａｒｙ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆ　ＰＭ　Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ　ＡＨＡ１０ｉｎ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
ＬＩＵ　Ｔｉｎｇ，ＸＩＥ　Ｓｈｉ－ｙｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｙｕ－ｆａｎｇ，ＳＨＡＮＧ　Ｚｈｏｎｇ－ｌｉｎ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｂｅｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ　０５００２４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｅｖｉｏｕｓ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｈａｖｅ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ａｃ－
ｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ，ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｃａ２＋ｓｉｇｎａｌ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｓ．Ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｏｎ　ｐｕｍｐ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｃａ２＋ｓｉｇｎａｌｓ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｉｓ　ｓｔｉｌ　ｕｎ－
ｃｌｅａｒ．Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｎ　ｐｕｍｐ　ＡＨＡ１０ｉｎ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄ－
ｌｉｎｇｓ，ａ　ｎｕｌ　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　ＡＨＡ１０ （ａｈａ１０－１）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ａｎｄ
ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈｓ　ｏｆ　ｒｏｏｔｓ　ａｎｄ　ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ，ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ａｈａ１０－１　ａｆｔｅｒ　０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗａｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｓｈｏｒｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ（Ｃｏｌ－０），ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ′ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ
ａｈａ１０－１　ｗａｓ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ（ｗｔ）．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＡＨＡ１０ｍａｙ　ｐｌａｙ
ａｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｒｏｏｔｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ　Ｃａ２＋ｉｎｆｌｕｘ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＮａＣｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ，ｂｕｔ　ｗａｓ
河 北 农 业 大 学 学 报 第３９卷　
ｉｍｐａｉｒｅｄ　ｉｎ　ｒｏｏｔ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｏｆ　ａｈａ１０－１，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ＡＨＡ１０ｍａｙ　ｂｅ　ａ　ｋｅｙ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ　ｉｎ
ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｔｈａｔ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｃａ２＋ｉｎｆｌｕｘ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；ＡＨＡ１０；ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｕｒｒｅｎｔ
　　盐胁迫是常见的非生物胁迫因子之一，土壤的
盐分过多会影响植物吸水、破坏细胞膜结构、抑制呼
吸作用、影响营养物质的吸收。植物在进化过程中
形成了生理响应机制来耐受一定程度的盐胁迫，通
过调节质膜上的离子通道或运输载体活性来维持离
子平衡是重要的手段之一。在拟南芥［１］和水稻［２］中
都发现ＮａＣｌ可以增强质膜Ｎａ＋－Ｈ＋反向转运蛋白
的活性，使植物排出过多的 Ｎａ＋ 离子。在拟南芥
Ｎａ＋－Ｈ＋反向转运蛋白基因ＡｔＳＯＳ１的过表达植株
中，发现盐刺激条件下 Ｎａ＋的累积量减少［３］，植物
通过Ｎａ＋－Ｈ＋反向转运蛋白（拟南芥中的ＳＯＳ１）来
排出Ｎａ＋，这一过程依赖于质膜质子泵（Ｈ＋－ＡＴ－
Ｐａｓｅ）建立的电化学势梯度［４］。
质膜 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ可以利用 ＡＴＰ水解释放的
能量将 Ｈ＋泵出细胞外，在质膜上建立内负外正的
电化学势梯度，为物质进出细胞提供驱动力。拟南
芥质膜 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ家族有１１个基因成员，分别为
ＡＨＡ１～ＡＨＡ１１［５］。不同成员表达模式有所不同，
ＡＨＡ１和ＡＨＡ２基因在各个组织器官中均有大量
的表达，为持家基因［６］，ＡＨＡ３ 在韧皮部表达［７］，
ＡＨＡ４主要在根的内皮层细胞中表达［８］，ＡＨＡ５在
整株中表达量都比较低，但在保卫细胞中有大量表
达［９］，ＡＨＡ９在花药中表达［１０］，ＡＨＡ１０在发育着的
种子中有大量表达［１１］。质膜Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ在不同环
境条件下的表达和活性也不同，逆境胁迫条件下，植
物细胞可以在转录水平、翻译水平和翻译后水平调
节质膜 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ的表达和活性来响应逆境胁
迫。如盐胁迫条件下，盐生植物大洋洲滨藜要比甜
土植物烟草积累更多的质子泵基因 ｍＲＮＡ来增强
植物的抗盐性［１２］。
Ｃａ２＋是植物细胞中普遍存在的第二信使，介导
植物体对多种外界刺激做出反应，在植物生长发育
及响应环境胁迫过程中发挥着至关重要的作用。盐
刺激引发的钙信号可以激活ＳＯＳ途径，钙离子浓度
的升高激活了钙传感器ＳＯＳ３，一种钙调磷酸酶Ｂ
类蛋白ＣＢＬ，ＳＯＳ３和ＳＯＳ２二聚化形成ＣＢＬ互作
蛋白激酶（ＣＩＰＫ），转运至质膜通过磷酸化作用激活
Ｎａ＋－Ｈ＋反向转运蛋白ＳＯＳ１，促使 Ｎａ＋排出，使根
正常生长［１３］。
植物细胞中的Ｃａ２＋通过质膜上的多种Ｃａ２＋通
道进入细胞［１４］，细胞质中钙离子信号通过钙调素、
钙依赖的蛋白激酶、钙调磷酸酶等靶蛋白对细胞内
的生理过程进行调控，而后胞质中过高的 Ｃａ２＋ 被
Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅｓ和Ｃａ２＋－Ｈ＋反向转运蛋白清除出细
胞质［１５］。
综上所述，一方面盐胁迫可使植物细胞胞质钙
浓度增加，钙作为信号分子通过多种途径如改变
Ｎａ＋－Ｈ＋反向转运蛋白活性，参与调节植物对盐胁
迫的响应过程。另一方面盐胁迫可以提高质子泵的
表达和活性，在质膜上建立电化学势梯度，为 Ｎａ＋－
Ｈ＋反向转运蛋白提供驱动力，来增强植物的耐盐
性。质子泵与盐刺激条件下钙信号的产生之间应该
有某种联系。因此，为探究质子泵 ＡＨＡ１０在拟南
芥幼苗盐胁迫响应过程中的作用，本试验利用筛选
到的拟南芥质子泵ＡＨＡ１０缺失突变体，检测、比较
了盐胁迫条件下野生型和突变体幼苗生长状况，并
利用膜片钳技术检测了野生型和突变体根细胞的质
膜Ｃａ２＋流动的变化情况。
１　材料与方法
１．１　植物材料
所用植物材料为拟南芥，包括野生型（Ｃｏｌ－０）和
质膜质子泵基因ＡＨＡ１０（Ａｔ１ｇ１７２６０）缺失突变体
ａｈａ１０－１（ｓａｌｋ－０１９５６９）。种子均购自拟南芥突变体
库Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＲＣ），经
筛选鉴定后的纯合突变体用于本试验。
１．２　拟南芥ＡＨＡ１０ 缺失纯合突变体筛选与分子
鉴定
提取 ＡＨＡ１０ 缺 失 突 变 体 ａｈａ１０－１ （ｓａｌｋ－
０１９５６９）分离群体单株总ＤＮＡ。以所提取的植株总
ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ所用引物的设
计参照ＳＩＧｎＡＬ的相关资料（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．
ｅｄｕ／ｔｄｎａｐｒｉｍｅｒｓ．ｈｔｍｌ），ＰＣＲ试剂盒（２×Ｔａｑ　ＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ）由北京博迈德科技发展有限公司提供。
基因特异性引物见表１。反应体系共１０μＬ：模板
１μＬ，引物各０．５μＬ，１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　１μＬ，
０１
　第２期 刘　婷等：ＡｔＡＨＡ１０参与拟南芥幼苗盐胁迫响应的信号转导机制初探
ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．２μＬ，Ｔａｑ酶０．２
μＬ，加 Ｈ２Ｏ 至１０μＬ。将各种成分混匀后进行
ＰＣＲ，ＰＣＲ反应程序如下：９４℃变性５ｍｉｎ，９４℃变
性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３０个循
环。１％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
取２周龄植物体（２０～１００ｍｇ）为试验材料。
ＲＴ－ＰＣＲ分析基因表达水平。Ａｃｔｉｎ７（Ａｔ５ｇ０９８１０）
作为内参基因，对目的基因的表达水平进行标准化。
基因特异性引物见表１。反应体系及程序同筛选
试验。
表１　引物列表
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ａｈａ１０－１－ＬＰ　 ５＇ＣＣＡＡＣＣＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧ　３＇
ａｈａ１０－１－ＲＰ　 ５＇ＡＧＧＧＴＴＴＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＴＧＡＧ　３＇
ＬＢｂ１．３　 ５＇ＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＧＧＡＡＣ　３＇
ＡＨＡ１０－Ｓ　 ５＇ＧＴＡＴＡＴＴＧＣＣＧＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧ　３＇
ＡＨＡ１０－Ａ　 ５＇ＣＧＴＴＡＣＡＧＡＴＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＧ　３＇
Ａｃｔｉｎ７－Ｓ　 ５＇ＧＧＡＣＡＡＣＧＧＡＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣ　３＇
Ａｃｔｉｎ７－Ａ　 ５＇ＡＧＧＣＡＣＣＴＣＴＴＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧＣ　３＇
１．３　植物培养
将拟南芥种子播种在含有不同 ＮａＣｌ处理浓度
的１／２ＭＳ（１／２ＭＳ盐，１％蔗糖，０．８％琼脂粉，用
ＫＯＨ调节ｐＨ至５．８，１２１℃高温灭菌１５ｍｉｎ）固体
培养基上，避光条件下，４℃春化３ｄ后放置在光照
培养箱（光周期１６ｈ／８ｈ（ｌｉｇｈｔ／ｄａｒｋ），光强度１２０
～１３０μＥ／ｍ
２ｓ，培养温度２２℃／１８℃（ｌｉｇｈｔ／ｄａｒｋ），
相对湿度７０％中培养。
１．４　形态指标检测
１．４．１　根生长指标的检测　种子在１／２ＭＳ固体培
养基上春化后，光照下竖直培养４ｄ，根长７～１０
ｍｍ时，将幼苗移至含０，１００和１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ
的１／２ＭＳ固体培养基上，继续竖直培养６ｄ。每天
定时拍照，观察统计幼苗主根长度（ｎ＝３０）。
１．４．２　子叶生长指标的检测　将拟南芥种子播种
在含０，１００和１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的１／２ＭＳ固体培
养基上，春化３ｄ后放置在光照下水平培养７ｄ。每
天定时拍照，观察并统计幼苗子叶面积（ｎ＝９０）。
采集到的照片利用Ｉｍａｇｅ　Ｊ软件进行测量，数
据用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１０．０软件分析显著性差异。
１．５　电生理指标检测
１．５．１　原生质体的制备　取在１／２ＭＳ固体培养基
上竖直培养１０～１５ｄ的拟南芥幼苗的根（ｎ＝２５～
３０），放置在去离子水中清洗１ｍｉｎ，用镊子夹出放
在载玻片上吸走多余的水分，用刀将根切成３ｍｍ
左右的小段，置于盛有１ｍＬ酶解液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＣａＣｌ２，５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｅｓ，０．５％纤维素酶Ｒ－１０，０．５％
纤维素酶Ｃｅｌｕｌｙｓｉｎ，０．２％果胶酶Ｙ－２３，用Ｔｒｉｓ调
ｐＨ至５．８，５％山梨醇调节渗透势至３３０ｍＯｓｍ）的
ＥＰ管中，震荡酶解１．５～２ｈ（２６℃，５０ｒ／ｍｉｎ）。酶
解过后用２００μｍ尼龙网过滤，将包含分离出的原
生质体的滤液置于冰上沉淀０．５ｈ，然后进行电生理
指标检测。
１．５．２　根细胞原生质体质膜Ｃａ２＋电流的检测　细
胞浴液成分为２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２，５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｅｓ，
用Ｔｒｉｓ调ｐＨ至５．８，５％山梨醇调节渗透势至３３０
ｍＯｓｍ；电极内液成分为０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２，８．５
ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｃａ（ＯＨ）２，２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＡＴＰ，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＡＴＰ·Ｔｒｉｓ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＢＡＰＴＡ，１５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ，
用 ＨＣｌ将ｐＨ 调至７．３，４％山梨醇调节渗透势至
３３０ｍＯｓｍ；以全细胞电压钳方式记录跨膜钙离子电
流，封接电阻大于１ＧΩ，统计多个细胞（ｎ＝６）的电
流变化情况，作出Ⅰ－Ⅴ曲线进行分析。待记录到稳
定电流后，向样品槽中加入含１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的
细胞浴液，使样品槽中 ＮａＣｌ终浓度达到５０ｍｍｏｌ／
Ｌ，记录 ＮａＣｌ处理后的电流。记录电流的软件为
ｐＣｌａｍｐ　９．０，信号放大器为ＡＸＯＮ　７００Ｂ，试验数据
处理、作图使用软件为Ｏｒｉｇｉｎ６．０。
２　结果与分析
２．１　拟南芥ＡＨＡ１０ 缺失纯合突变体筛选与分子
鉴定
为了研究ＡＨＡ１０基因是否参与了盐胁迫响应
的钙信号转导途径，利用双引物法对ＡＨＡ１０ 缺失
纯合 突 变 体ａｈａ１０－１ 进 行 分 子 鉴 定。ＡＨＡ１０
（Ａｔ１ｇ１７２６０）是正向基因，由２１个外显子和２０个
内含子组成。试验所用ａｈａ１０－１（ｓａｌｋ－０１９５６９）的插
入位点位于第３个内含子上，如图１Ａ所示。双引
物法ＰＣＲ产物鉴定结果如图１Ｂ所示，野生型用基
因特异性引物ＬＰ－ＲＰ进行扩增可以得到特异性扩
增条带，大小约为１　１００ｂｐ，而用Ｔ－ＤＮＡ特异性引
物ＬＢｂ１．３－ＲＰ进行扩增没有产物。在ａｈａ１０－１中，
用引物ＬＰ－ＲＰ进行扩增没有产物，而用ＬＢｂ１．３－ＲＰ
进行扩增可以得到扩增条带，大小约为７８０ｂｐ，表明
本试验所使用的ＡＨＡ１０基因缺失突变体ａｈａ１０－１
在ＤＮＡ水平上是纯合突变体。为了确定ＡＨＡ１０
１１
河 北 农 业 大 学 学 报 第３９卷　
基因缺失突变体植株没有ＡＨＡ１０ 的表达，从基因
转录水平对ａｈａ１０－１进行了ＲＴ－ＰＣＲ鉴定（图１Ｃ）。
结果显示，野生型Ｃｏｌ－０的营养体可扩增出预计大
小的ＡＨＡ１０片段（扩增片段长度为８２０ｂｐ）；纯合
缺失突变体ａｈａ１０－１的材料无表达产物。
Ａ：ＡＨＡ１０的基因结构及突变体的Ｔ－ＤＮＡ插入位点示意图；
Ｂ：ＤＮＡ水平鉴定；Ｃ：基因转录水平鉴定．
图１　拟南芥ＡＨＡ１０缺失纯合突变体筛选与分子鉴定
Ｆｉｇ．１　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＡＨＡ１０
Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ
２．２　盐胁迫对ＡＨＡ１０ 缺失突变体生长表型的
影响
２．２．１　幼苗根生长表型　在无ＮａＣｌ处理条件下，
Ｃｏｌ－０和ａｈａ１０－１ 的主根长度没有明显差异。经
ＮａＣｌ处理后，Ｃｏｌ－０和ａｈａ１０－１幼苗的主根伸长生
长均受到抑制，且随着ＮａＣｌ浓度的升高，受抑制程
度增强。１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理条件下，Ｃｏｌ－０和
ａｈａ１０－１的主根长度有明显差异，绝对值分别为
（２４．２４±１．０９）ｍｍ 和（１７．７５±１．９４）ｍｍ，相对比
值（ＮａＣｌ处理／对照）分别为（０．７９±０．０３）和（０．６７
±０．０３），ａｈａ１０－１ 主根生长受抑制程度较野生型
大，二者差异显著（Ｐ＜０．０５）；１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处
理条件下，ａｈａ１０－１ 与Ｃｏｌ－０主根生长受抑制程度
无明显差异（图２）。试验结果说明在中度盐胁迫条
件（１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）下，ａｈａ１０－１主根伸长生长受
抑制程度较大，推测ＡＨＡ１０可能在拟南芥幼苗主根
感受和响应盐胁迫刺激过程中发挥了正向调控作用。
图２　盐胁迫对ａｈａ１０－１幼苗根生长的影响图表重复
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｒｏｏｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ
ａｈａ　１０－１　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
２．２．２　幼苗子叶生长表型　无ＮａＣｌ处理条件下，
Ｃｏｌ－０和ａｈａ１０－１的子叶没有明显差异。ＮａＣｌ处理
后，Ｃｏｌ－０和ａｈａ１０－１幼苗的子叶生长均受到抑制，
且随着ＮａＣｌ浓度的升高，受抑制程度增强，试验选
用的２种浓度 ＮａＣｌ处理条件下Ｃｏｌ－０和ａｈａ１０－１
均无明显差异（图３）。据此推测ＡＨＡ１０可能在拟
南芥幼苗子叶感受和响应盐胁迫刺激过程中没有发
挥作用。
图３　盐胁迫对ａｈａ１０－１幼苗子叶生长的影响
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ
ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ　ｏｆ　ａｈａ１０－１　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
２．３　盐胁迫下ａｈａ１０突变体根细胞质膜Ｃａ２＋通道
活性的检测
表型试验说明质子泵ＡＨＡ１０可能在拟南芥幼
苗主根感受和响应盐胁迫刺激过程中发挥了正向调
控作用，为进一步探究质子泵 ＡＨＡ１０是否参与盐
胁迫激活根细胞质膜Ｃａ２＋通道、促进Ｃａ２＋内流的过
程，以野生型（Ｃｏｌ－０）和缺失突变体ａｈａ１０－１的幼苗
根制备了原生质体作为试验材料，用５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ处理，采用全细胞步进式电压钳技术测定
ＮａＣｌ处理前后ａｈａ１０－１ 的质膜Ｃａ２＋通道活性，并
与Ｃｏｌ－０做比较，进而探究 ＡＨＡ１０在盐胁迫诱导
根细胞质膜Ｃａ２＋内流中的作用。
未加ＮａＣｌ处理时，野生型Ｃｏｌ－０的质膜钙通道
在－１００ｍＶ电压下开放，随着超极化程度的加强，
电流逐渐增大，５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后，电流强度
明显增大。对试验中６个较为一致的细胞进行统计
分析，结果显示处理前 ２００ｍＶ 下电流强度为
（ ２１０±４２）ｐＡ，ＮａＣｌ处理后电流强度增大到
（ ３３１±４５）ｐＡ，二者差异显著（Ｐ＜０．０５），说明
Ｃｏｌ－０在ＮａＣｌ处理前后电流出现了明显变化（图４）。
２１
　第２期 刘　婷等：ＡｔＡＨＡ１０参与拟南芥幼苗盐胁迫响应的信号转导机制初探
采用全细胞步进式电压钳技术记录ＮａＣｌ处理前／处理后
（５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）的电流图及电流／电压关系图 （ｎ＝６）．
图４　盐胁迫对拟南芥Ｃｏｌ－０和ａｈａ１０－１幼苗根细胞
原生质体质膜钙通道活性的影响
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ２＋－ｐｅｒｍｅａｂｌｅ
ｃｈａｎｎｅｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｏｆ　ｒｏｏｔ　ｃｅｌ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ（Ｃｏｌ－０）ａｎｄ　ａｈａ１０－１
　　对ＡＨＡ１０ 缺失突变体ａｈａ１０－１ 进行研究发
现，未加ＮａＣｌ处理时，质膜钙通道在 １４０ｍＶ电压
刺激下开放，其开放电压低于野生型，随着超极化程
度的加强，电流逐渐增大。加入５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ
处理后，电流强度变化不明显。对６个较为一致的
细胞进行统计分析的结果显示，处理前在 ２００ｍＶ
电压下电流强度为（１５６±１９）ｐＡ，ＮａＣｌ处理后电
流强度为（１６８±２８）ｐＡ，二者无显著差异（Ｐ＞
０．０５）（图４）。表明ＡＨＡ１０基因缺失后，细胞质膜
钙通道响应盐胁迫的能力明显减弱，推测 ＡＨＡ１０
可能在盐胁迫促进 Ｃａ２＋ 内流过程中发挥了介导
作用。
３　讨论与结论
质膜 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ参与调节植物对各种环境胁
迫的响应，如水分胁迫、冷害胁迫、盐胁迫等。在质
子泵对盐胁迫的响应研究中发现胡杨和苜蓿在盐环
境下 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ的表达和活性升高［１６－１７］。烟草的
根在盐胁迫条件下，质子泵基因 ＰＭＡ２、ＰＭＡ４、
ＰＭＡ５和ＰＭＡ６ 的表达量升高［１８］，超表达激活型
ＰＭＡ４增强了质膜质子泵的活性和烟草的耐盐
性［１９］。Ｖｉｔａｒｔ等［８］研究发现拟南芥质子泵基因
ＡＨＡ４的突变体ａｈａ４－１对ＮａＣｌ更敏感，根和叶的
生物量比野生型低，叶中 Ｎａ＋、Ｋ＋浓度较野生型高
４～５倍。但目前关于其他质子泵家族成员参与盐
胁迫响应的生理学证据还比较少，为了更进一步探
究质子泵其他家族成员在拟南芥幼苗盐胁迫响应过
程中的作用，本试验以拟南芥质子泵ＡＨＡ１０ 基因
缺失突变体幼苗为材料，检测了盐胁迫条件下幼苗
根和子叶的生长状况。发现ＡＨＡ１０基因缺失突变
体ａｈａ１０－１幼苗在１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理条件下，
主根长度明显短于野生型，而对子叶面积这一指标
的检测结果显示，ａｈａ１０－１ 和野生型对盐胁迫的反
应没有明显差异，说明 ＡＨＡ１０可能在拟南芥幼苗
根响应盐胁迫刺激过程中发挥了正向调节作用。
质膜 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ可以利用水解 ＡＴＰ释放的
能量将带正电荷的 Ｈ＋泵出细胞外，在质膜上建立
内负外正的电化学势梯度，为各种离子进出细胞提
供驱动力，它可能影响了多种位于质膜上的离子通
道，包括Ｎａ＋－Ｈ＋ 反向转运蛋白和钙离子通道等。
添加Ｎａ＋－Ｈ＋反向转运蛋白的抑制剂阿米洛利或质
膜 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ的抑制剂原钒酸钠后，胡杨根细胞
中 ＮａＣｌ引起的 Ｎａ＋－Ｈ＋ 交换受到抑制［２０］，因此
ＮａＣｌ激活的质膜 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ有利于 Ｎａ＋－Ｈ＋ 交
换从而增强植物耐盐性［１９］。
除了Ｎａ＋－Ｈ＋反向转运蛋白，位于质膜上的钙
通道也受到质膜 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ的调节，钙通道在植
物受到外界胁迫信号刺激产生钙信号这一过程中发
挥着重要作用。植物细胞中的Ｃａ２＋通过质膜上的
钙通道进入细胞［１４］，引起了钙震荡，产生的Ｃａ２＋信
号起始了细胞对多种环境变化的响应［１４，２１］，参与植
物对低温、高温、干旱和盐胁迫等多种逆境胁迫的反
应。玉米根原生质体在冷刺激条件下胞质钙浓度升
高，梨的原生质体在高温处理时，细胞对钙的吸收明
显增多。外源钙能缓解干旱胁迫，干旱胁迫条件下，
玉米幼苗的钙含量升高。盐胁迫可以刺激胞质
Ｃａ２＋浓度的增加，升高的Ｃａ２＋可通过多种信号转导
途径来响应盐胁迫，如ＳＯＳ（Ｎａ＋／Ｈ＋ 反向转运蛋
白）途径、ＣＡＮ 途径等。质膜 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ可以通
过泵 Ｈ＋为细胞膜上离子转运提供驱动力，但质子
泵与盐胁迫条件下钙信号的产生有无关系尚不确
定。目前没有相关的报道提供细胞质膜质子泵与
Ｃａ２＋通道相关性的直接证据。
为了探究质子泵在盐胁迫激活钙信号过程中的
作用，本试验以拟南芥幼苗根细胞原生质体为试验
材料，首次系统检测了５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理前后
质子泵ＡＨＡ１０基因缺失突变体根细胞质膜钙通道
活性的变化，结果显示，野生型盐处理后根细胞质膜
钙电流明显增强，而拟南芥质子泵ＡＨＡ１０ 基因缺
失突变体ａｈａ１０－１盐处理后根细胞质膜钙电流无明
显变化，Ｃａ２＋通道响应盐胁迫的能力明显减弱，说
明ＡＨＡ１０可能在盐胁迫激活钙信号这一过程中发
挥了正向调节作用。
３１
河 北 农 业 大 学 学 报 第３９卷　
综上所述，质子泵 ＡＨＡ１０既参与了盐胁迫激
活钙信号这一过程，也参与调节拟南芥幼苗根对盐
胁迫的响应，推测可能是盐胁迫激活了拟南芥质子
泵ＡＨＡ１０作用于Ｃａ２＋通道，促进Ｃａ２＋内流，引发
下游的根的生理反应。
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ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍ－
ｂｒａｎｅ　Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ　ａｌｔｅｒｓ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｉｎ－
ｃｒｅａｓｅｓ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７，１４４
（４）：１７６３－１７７６．
［２０］　Ｓｕｎ　Ｊ，Ｃｈｅｎ　Ｓ，Ｄａｉ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．ＮａＣｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｓ
ｏｆ　ｃｅｌｕｌａｒ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｏｎ　ｆｌｕｘｅｓ　ｉｎ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　ｓａｌｔ－ｒｅｓｉｓｔ－
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（Ｓｐ）：４０１－４１７．
（编辑：李　川）
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