全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2005,13 (5):580~586
*基金项目：山东省人事厅留学回国人员科技活动择优项目(No.2003(10)14)和教育部留学回国人员科研启动项目(No.2004(527)资助。
苑克俊：男，1963年出生，博士，研究员。E-mail:.
收稿日期：2004-09-16 接受日期：2004-12-10
·研究论文·
改进的拟南芥CAPS标记方法*
苑克俊
(山东省果树研究所，泰安271000)
摘要：在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)的一种生态型Columbia(Col)中，存在大多数CAPS(切割扩增的多态性序
!)标记的标记酶识别位点；而用于分析的酶中，只有37.5%47.5%的酶在Col基因组的扩增区段存在酶识别位点，超过半数
的酶在大多数CAPS标记的开发中无作用。因此,建立了一种改进的开发CAPS标记的方法。首先进行限制性内切酶分析，筛
选出在Col基因组的扩增区段存在酶识别位点的候选酶，然后再在候选酶中筛选CAPS标记酶；只有在候选酶中找不到CAPS
标记酶时，才在其它酶中筛选。应用实验结果表明，即使不知道拟南芥的另两种生态型Landsbergerecta(Ler)和CapeVerdeIs-
lands(Cvi)的基因组序列，也可利用Col基因组序列开发Ler和Cvi的CAPS标记，可节约超过50%酶的费用。这种基于基因
组的CAPS(geCAPS)方法在其它植物如水稻(Oryzasativa)和茶叶(Cameliasinensis)中的应用进行了讨论。
关键词：植物；拟南芥；基因组；CAPS(切割扩增多态性序列)；分子标记；限制性内切酶
AnImprovedMethodofCleavedAmplifiedPolymorphic
Sequence(CAPS)MarkersinArabidopsisthaliana
YUANKe-Jun
(ShandongInstituteofPomology,Taian271000,China)
ThemarkerenzymesiteforeachofmostCAPS(Cleavedamplifiedpolymorphicsequence)markerscouldbefoundin
oneArabidopsisecotypeCol(Columbia),only37.5%#47.5%ofanalysedenzymeshadcutsitesintheamplificationregionofCol
genome.ThesefindingsindicatedthatoverhalfofanalysedenzymeswerenotusefulindevelopingmostCAPSmarkers.Basedon
thesefindings,animprovedCAPSmethodfordevelopmentofnewmarkerswasestablished,thatis,restrictionanalysiswasconducted
atfirsttofindcandidateenzymesthathavecutsitesinColamplificationregion,thesecandidateenzymeswerethenusedtoscreen
CAPSmarkerenzyme,notusingotherenzymesunlessnopolymorphismbetweenecotypeswasdetected.Applicationexperimentre-
sultsshowedthattheimprovedmethodusingColgenomicsequencecouldbeusedtodevelopCAPSmarkersforothertwoecotypes
Ler(Landsbergerecta)andCvi(CapeVerdeIslands)(ofArabidopisthaliana),eveniftheirgenomicsequenceswerenotknown;and
thecostforover50%enzymescouldbesaved.Applicationofthisgenome-basedeconomicCAPS(geCAPS)methodinotherplants
suchasOryzasativaandCameliasinensiswerediscussed.
plants;Arabidopsisthaliana;genome;CAPS(cleavedamplifiedpolymorphicsequence);marker;restrictionenzymes
在自然群体和突变体中最常见的一类DNA多
态性是单核苷酸多态性(SNPs)，已开发了许多检测
SNPs的方法 (Myersetal.,1985;Labruneetal.,
1991;KoniecznyandAusubel,1993;Nefetal.,
1994)。其中，切割扩增的多态性序列(CAPS)分析是
最广泛应用的方法(KoniecznyandAusubel,1993)，
已被广泛地用于植物的突变检测 (Koniecznyand
Ausubel,1993)、新分子标记开发 (Carantaetal.,
1999)、分子标记辅助育种(Mouryetal.,2000)、遗传
作图(Mouetal.,2000;Brugmansetal.,2002)和基于
图谱的基因克隆(Janderetal.,2002)，也已被用于狗
(htp:n/www.ornl.gov/TechResources/Human-Geno-
me/publicat/94SANTA/mapping/nef.html,1994)和昆
$(Hasselmannetal.,2001)的遗传分析。在1992%
第5期 苑克俊:改进的拟南芥CAPS标记方法
2002年全世界拟南芥和植物抗病性方面被引用率最
高的 25篇论文中，原始的 CAPS论文排名第四
(htp:/www.esi-topics.com/arab/papeks/al.html,
2003)。很显然，对这样一种CAPS技术的任何改进
都具有重要意义。
在CAPS技术中，根据已知基因序列设计的引
物被用来扩增模板DNA，通过检测扩增序列中限制
性酶切位点的增加和减少来检测多态性核苷酸
(KoniecznyandAusubel,1993;Nefetal.,1998)。随
着拟南芥基因组测序的完成 (TheArabidopsis
GenomeInititive,2000)，有大量的序列数据可被用
来设计引物。理想的情况下，这些序列数据可使
PCR的新分子标记的开发最经济 (Hauseretal.,
1998)。因此，在应用CAPS标记时，如何充分和经济
地利用基因组或者基因序列是一个新颖、有趣的课
题。但目前仅有几种改良CAPS方法在其它方面做
了一些改进，例如dCAPS和Beye建立的 ECAPS
(Michaelsetal.,1998;Baumbuschetal.,2001)。本实
验力图建立一种改进的CAPS方法，以便在开发拟
南芥新分子标记时能充分地利用Columbia(Col)基
因组序列。这种方法首先在Col基因组的扩增区段
进行限制性内切酶分析，筛选出在Col基因组的扩
增区段存在酶识别位点并可能产生具有生态型特异
性酶切图谱的候选酶，然后用这些候选酶进行实验
筛选CAPS标记酶；只有在候选酶中找不到CAPS
标记酶时，才用其它酶进行筛选。由于这种方法是基
于基因组序列信息建立的并可以节约一部分酶的费
用，故将其叫做geCAPS (genome-basedeconomic
CAPS)。
我们调查拟南芥 (Arabidopsisthaliana)AGI遗
传图谱上132和28个CAPS标记的酶切图谱(htp:
/www.arabidopsis.org)，并对其中 Col和 Ler(Lands-
bergerecta)生态型50个CAPS标记在Col的扩增
区段上进行酶切分析，阐明了geCAPS方法的科学
基础，报道了在另一对拟南芥生态型 Ler和 Cvi
(CapeVerdeIslands)中的成功应用，讨论了在其它植
物中应用的可行性，给出了详细实验方法以利于
geCAPS方法的应用。
1 材料和方法
1.1 酶切模式调查
利用 TAIR上的标记搜寻工具找出在拟南芥
AGI遗传图谱上Col和Ler生态型间具有多态性的
所有 CAPS标记(htp:/www.arabidopsis.org)，对其
中每一个标记进行检查，通过调查它们的酶切图谱
找出在Col扩增区段上有酶切位点的CAPS标记数
量和无酶切位点的CAPS标记数量。对Cvi和Ler
生态型间具有多态性的CAPS标记也进行了调查。
1.2 酶切分析(以F11A12标记为例)
利用拟南芥整个基因组(BACclones,DNA)的
数据和 TAIRBLAST2.0软件包中的 BLASTN工
具，输入正向引物序列找出F11A12标记的开始点，
输入反向引物序列找出F11A12标记的终止点。在
输入正向引物序列 (GGTGGTGAAGAAGGT
GCTCG)并执行BLAST后，可得到在拟南芥基因组
序列上的BLAST查询结果。同样也可得到在拟南
芥基因组序列上反向引物序列 (ATTGTAATTT
GGGAGCTGGACC)的BLAST查询结果。据此可
以发现F11A12标记在BACF11A12上，其位置是
13428!15127。然后利用TAIRQuickSearch去发
现 TAIR数据库中的 F11A12BAC克隆及其 Gen-
BankaccessionAC068900。复制在1342815127
区段的DNA序列，利用TAIRBLAST2.0软件包中
的酶切分析工具进行分析和显示酶切图谱。结果发
现123个侯选酶在13428#15127区段有酶切位点
(包括 F11A12标记的酶 Rsa!)， 117个酶在
13428~15127区段无酶切位点，并看到所有酶的名
称和123个侯选酶的TAIR酶切图谱。TAIR站点上
的酶切分析工具也可用于其它植物。某些具有酶切
分析功能的软件也可用来进行酶切分析。
1.3 应用实验
用 Col基因组序列(htp:/www.arabidopsis.org)
设计6个CAPS标记的引物。除F11A12标记外，大
部分新标记的标记酶及引物序列见 Bentsink等
(2003)。F11A12标记的标记酶是Rsa!:
正向引物:GGTGGTGAAGAAGGTGCTCG;
反向引物:ATTGTAATTTGGGAGCTGGACC。
两种拟南芥生态型Ler和Cvi，各1个花序或1
片叶用于提取 DNA。DNA提取采用 Bentsink等
(2000)中的方法。DNA提取的温度条件与Kaundun
等 (2003)中的相似，由125L提取缓冲液（ 0.35
mol/L山梨醇,100mmol/LTrisHCl,5mmolEDTA,
pH7.5）、175Llysis缓冲液(200mmol/LTris,50
mmol/LEDTA,2mol/LNaCl,2%(W/V)CTAB200
mL水)和30L10%(W/V)Sarkosyl组成的混合液
$%65&下预热5min，用来提取DNA，每一个样
品在65’水浴中提取30min，轻轻倒置样品试管3
次。加入400L(或700L)氯仿/异戊醇(24!1,V!
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农 业 生 物 技 术 学 报 2005年
表1132个Ler和Col的CAPS标记的酶切模式
Table1Enzymedigestionpaterninvestigationfor132
CAPSLerandColmarkers
Ler和Col分别代表Landsbergerecta和Columbia，全部132个标记来自TAIR(htp:
/www.arabidopsis.org)。LerandColstandforLandsbergerectaandColumbia,
respectively；Al132markersobtainedfromTAIR(htp:/www.arabidopsis.org).
标记酶 标记数量 主要酶(数量)
Markerenzyme MarkerNo. Mainenzyme(numbers)
在Ler中有酶切位点而在 23 Hind!(5),Hinc(3),Acc#(2),Xba#(2),
Col中无酶切位点的酶 EcoR#(2)
Enzymeonlywithcut
sitesinLer,noinCol
在Col中有酶切位点的酶 109 Dde#(16),Rsa#(11),Hind!(7),Hae!(5),
Enzymewithcut Hinc(5),Acc#(5),Alu#(5),Mbo#(5),
sitesinCol Xba#(5),Msp#(5)
V)，充分混匀。在15000g下离心5min后将样品管
中的约270$L(或500$L)上清液转入另一个新试
管。在新试管中加入等量的270$L(或500$L)冷
的异丙醇(!20!)，摇匀。在15000g下离心5min
后将上清液移去。试管中的DNA球用200$L (或
500$L)冷的70%乙醇(!20)漂洗，将试管置于旋
转真空干燥器中干燥10min，取出试管加入25$L
灭菌无离子水,在4#冰箱中保存备用。PCR反应
液(50$L)含有大约50ng基因组DNA和49$L反
应混合物，一份反应混合物由 2$LdNTPs(5
mmol/L)、5!$LTaq缓冲液、 2$L引物 (0.1$g/
$L)、0.2U的 TaqDNA聚合酶和 40$L水组成。
PCR反应35个循环，每一循环包括94$变性30s、
在每一个标记适宜的温度(50%55&)下退火1min
’72(下引物延伸2min。将2$LPCR产物、8$L
水和2$Lloadingdye混合后在80V电压、1%琼
脂胶上进行电泳检查PCR产物。如果PCR产物质
量好，在含5$LPCR产物的试管中加入2$L反应
缓冲液 (10!)、10U适宜的限制性内切酶和12$L
水，在37)水浴2*3h或在37+温度下过夜进
行酶切割。20$L酶切产物加5$Lloadingdye进行
电泳，电泳条件是80V电压、1%琼脂、溴化乙锭染
色。
在geCAPS技术中，通常先在20,30种可利
用的酶中选择出侯选酶或直接用10-15种侯选酶
来筛选CAPS标记酶。如果在这些侯选酶中没有发
现CAPS标记酶，用另一组不同的侯选酶进行筛选，
直到无侯选酶可用。这时可利用其它酶进行筛选。以
F11A12标记为例，在2001年我们用常规的CAPS
方法开发F11A12标记时，用20种酶
(即 BsaA#、BsaB#、Hga#、Dra
#、Cla#、Kpn#、Sst#、Cto#、
Xho#、Xba#、Acc#、Bfa#、Scrf
#、Mbo#、Msp#、Hinf#、Nde#、
Hind!、EcoR.和Rsa#)进行实验。
假 如 采 用 geCAPS方 法 ， 先 在
F11A12BAC的 13428/15127区段
0行酶切分析，只需要用9种找出的
侯选酶 (即 Bfa#、Scrf#、Mbo#、
Msp#、Hinf#、Nde#、Hind!、EcoR
1和Rsa#)来进行实验。
为了找出侯选酶在可利用的酶
中的比例和检查拟南芥生态型 Ler
和Cvi的多态性，我们用设计的引物
从两种生态型中扩增DNA片段，用包含12230种
酶的一组酶来切割DNA片段，而不是先找出侯选
酶。
2 结果
2.1 酶切模式调查
当用 TAIR上的标记搜寻工具来搜寻拟南芥
AGI遗传图谱(htp:/www.arabidopsis.org)上 Ler和
Col的CAPS标记时，发现了168个在Ler和Col间
具有多态性的CAPS标记，其中132个CAPS标记
具有足够的信息来分析其酶切模式。在 132个
CAPS标记中，发现23个标记(17.4%)只在Ler的扩
增区段中有酶切位点,而在Col的扩增区段中无酶
切位点，109个标记(82.6%)在Col的扩增区段中有
3切位点(表1)。因此，对大多数分子标记来说，Ler
4Col间的突变发生在Col的酶切位点上，只有少
数标记其突变是在 Ler中增加 1个酶切位点引起
的。对于大多数CAPS标记来说，每一个标记酶的位
点可在Col的扩增区段中找到。这就是开发Ler和
Col的CAPS标记时，首先要在Col的扩增区段中
进行酶切分析来找出侯选酶的原因。
为了解geCAPS方法在其它生态型Ler和Cvi
上应用的可行性，调查了AGI遗传图谱(htp:/www.
Arabidopsis.org)上Ler和Cvi的CAPS标记。结果发
现28个在Ler和Cvi间具有多态性的CAPS标记，
也发现其在 Ler或 Cvi上的酶切模式与 27个
CAPS标记在Col上的酶切模式相同。尽管NIT4标
记在Col上的酶切模式不同，但其标记酶Mbo是
可以通过在Col基因组扩增区段进行酶切分析找出
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第5期 苑克俊:改进的拟南芥CAPS标记方法
表250个Ler和Col标记的酶切分析
Table2Restrictionanalysisfor50markersofLerandCol
50个标记和分析工具来自TAIR(htp:/www.arabidopsis.org);酶切分析在Col基因组上的扩增区段进行;侯选酶是在扩增区段上有酶切位点的
酶。Al50markersandanalysistoolobtainedfromTAIR (htp:/www.arabidopsis.org);Restrictionanalysiswasconductedintheamplificationre-
gionofColgenome;CandidateenzymeswereenzymeswithcutsitesintheColamplificationregion.
的侯选酶。因此，这些CAPS标记中任何一个的标记
酶位点皆可在Col中找到，Col的基因组序列也可
用来开发在其它生态型(例如Ler和Cvi)间具有多
态性的CAPS标记。
Dde!、Rsa!和Hind是易于引起突变的酶
位点，34个Ler和Col的标记(25.8%)和8个Ler和
Cvi的标记(28.6%)在这3个酶位点上发生突变。此
外，35个Ler和Col的标记 (25.8%)在其它7个酶
(即Hae、Hinc#、Acc!、Alu!、Mbo!、Xba!和
Msp!)的位点上发生突变，10个Ler和Col的标记
(7.6%)至少在两种不同的酶位点发生突变。Acc!、
Hind、Hinc$、Xba%和EcoR!是易于在Ler上形
!#$%&Col上无酶位点的酶，23个标记中有
14个(60.9%)在Ler上有这5种酶的酶位点，而在
Col上无其酶位点。这些结果对于开发新CAPS标
记也是非常有用的，特别是利用侯选酶在生态型间
未发现多态性时。
2.2 50个Ler和Col标记的酶切分析
酶切分析主要用于发现在可利用的限制性内切
酶中找出侯选酶所占的比例，以评估在开发一个
CAPS标记时可节约多少限制性内切酶。当用243
个限制性内切酶在 5条染色体上 50个 Ler和 Col
标记的Col扩增区段进行酶切分析时，结果发现在
Col扩增区段4497个侯选酶有酶切位点、7496个
酶无酶切位点。侯选酶占所有酶的 37.5%[4497/
(7496+4497)=0.375]，无酶切位点的酶占62.5%(表
2)。结果也表明，对于43个(86%)CAPS标记来说，
任何一个标记在其侯选酶中可找到至少一个标记酶
(表2)。既然无酶切位点的酶占62.5%,86% (或
82.6%)的酶在Col扩增区段有酶切位点(表1,2)，这
意味着，在开发 86%(或 82.6%)的 CAPS标记时，
在所分析的酶中62.5%的酶是无用的。这是为什么
首先进行酶切分析找出侯选酶的另一个原因，也给
出了在利用geCAPS方法筛选一个CAPS标记时需
要较少限制性内切酶的原因以及为什么可节约酶的
费用。理论上，在开发一个geCAPS标记时可节约超
过 50%的酶费用 (86%!62.5%=53.8%,82.6%’
62.5%=51.6%)。
实验结果表明，4497个侯选酶在61406个核
苷酸(50个CAPS标记在Col上的扩增区段)中有酶
切位点，平均每14bp有一个侯选酶。尽管侯选酶的
酶切位点不是随机分布的，却揭示出在扩增区段确
实存在许多潜在的酶切位点。这是我们可以建立
geCAPS方法以及为什么可用侯选酶来筛选标记酶
的第3个原因。
2.3 6个Ler和Cvi标记的酶切分析
如表3所示，在6个Ler和Cvi标记的侯选酶
中每个标记至少可从中找出1个标记酶，这进一步
证明了在Col基因组的扩增区段进行酶切分析可用
来发现其它生态型(例如Ler和Cvi)的侯选酶。
当用243个限制性内切酶在6个Ler和Cvi标
记相应的Col扩增区段进行酶切分析时，结果发现
在Col扩增区段688个侯选酶有酶切位点，761个
酶无酶切位点。侯选酶占所有酶的 47.5%（ 688/
(761+688)=0.475)无酶切位点的酶占52.5%(表3)。
由于在6个Ler和Cvi标记的侯选酶中每个标记至
少可从中找出一个标记酶，理论上在开发这 6个
CAPS标记时可节约52.5%酶的费用。
研究中还发现688个侯选酶在 6个 CAPS标
(的9757个核苷酸中有酶切位点(表3)，平均每14
染色体 标记数及其大小/bp 无酶切位点的酶 有酶切位点的酶 标记酶 (自侯选酶中选出的标记酶)
Chromosome MarkerNo.andSizes Enzymeswithnocutsite Enzymeswithcutsites Markerenzymes(fromcandidateenzymes)
!!!!!!!!! 11(12495) 1735 842 13(10)
!!!!!!!!$ 9(9785) 1416 758 10(8)
!!!!!!!! 10(10899) 1513 902 10(8)
!!!!!!!!& 10(14649) 1424 988 10(9)
!!!!!!!!’ 10(13578) 1408 1007 11(10)
总和Total 50(61406) 7496 4497 54(43+2)
583
农 业 生 物 技 术 学 报 2005年
表36个Ler和Cvi标记的酶切分析
Table3Restrictionanalysisfor6markersofLerandCvi
标记大小是基于这些标记相应的Col扩增区段计算得出;分析工具来自TAIR(htp:/www.arabidopsis.org);酶切分析在这些标记相应的Col扩
增区段进行，侯选酶是在Col扩增区段上有酶切位点的酶。
MarkersizeswerecalculatedbasedontherelevantColamplificationregionforthesemarkers;AnalysistoolobtainedfromTAIR(htp:/www.ara-
bidopsis.org);RestrictionanalysiswasconductedintherelevantColamplificationregionforthesemarkersandcandidateenzymeswereenzymeswith
cutsitesintheColamplificationregion.
表46个Ler和Cvi标记的应用分析和实验
Table4Applicationanalysisandexperimentresultsfor6markersofLerandCvi
分析工具来自TAIR(htp:/www.arabidopsis.org);酶切分析在这些Ler和Cvi标记相应的Col扩增区段进行;侯选酶是有酶切位点的酶。
AnalysistoolobtainedfromTAIR(htp:/www.arabidopsis.org);RestrictionanalysiswasconductedintherelevantColamplificationregionforthese
markersofLerandCvi;Enzymeswithcutsiteswerecandidateenzymes.
bp有一个侯选酶。表明在扩增区段存在许多潜在的
酶切位点，也进一步解释了为什么可用侯选酶来筛
选标记酶。
2.4 应用分析和实验
当用12!30个可利用的限制性内切酶在6个
Ler和Cvi标记相应的Col扩增区段进行酶切分析
时，结果表明侯选酶占所有酶的46.5%，[66/(66+76)
=0.465]，无酶切位点的酶占53.5%(表4)。由于在6
Ler和Cvi标记的侯选酶中每个标记至少可从中
找出一个标记酶，理论上在开发这6个CAPS标记
时可节约53.5%酶的费用。
实验结果表明，在12#30个可利用的限制性内
切酶中，在扩增产物中有酶切位点的酶占43%，[61/
(81+61)=0.43]，无酶切位点的酶占57%(表4)。尽管
结果与酶切分析的结果略有不同，但实验结果确实
验证了侯选酶的选择和利用是可行的，在开发
CAPS标记时确实可节约超过50%的酶费用。
当用geCAPS方法开发F11A12标记时，在20
种可利用的酶中，只需要用9种侯选酶(即Bfa!、
Scrf!、 Mbo!、Msp!、Hinf!、Nde!、Hind、
EcoR$和Rsa!)来进行实验。从图1可看出，8种
侯选酶 (即 Bfa!、Mbo!、Msp!、Hinf%、Nde&、
Hind’、EcoR(和Rsa))在PCR产物中有酶切位
点，其中的Rsa!酶可作为F11A12标记的标记酶。
这意味着在开发F11A12标记时可节约55%酶的费
*+(20!9)/20=0.55。
标记 标记大小/bp 无酶切位点的酶 有酶切位点的酶 标记酶(自侯选酶中选出的标记酶)
Marker Markersizes Enzymeswithnocutsite Enzymeswithcutsites Markerenzymes(fromcandidateenzymes)
T4P13b 1385 118 125 1(1)
cT22N4a 1759 127 114 2(1)
cT13O15b 1803 140 102 2(2)
cT13O15c 1417 124 117 1(1)
cF4P13a 1694 135 107 1(1)
F11A12 1699 117 123 1(1)
总和Total 9757 761 688 8(6+1)
标记 酶数量 在Col基因组酶切分析 Ler和CviPCR产物检测
Marker Analysed RestrictionanalysisinColgenome CheckinLerandCviPCRproducts
enzymes 无酶切位点酶 有酶切位点酶 无酶切位点酶 有酶切位点酶
Enzymeswithoutcutsite Enzymeswithcutsites Enzymeswithoutcutsite Enzymeswithcutsites
T4P13b 20 7 13 8 12
cT22N4a 30 15 15 16 14
cT13O15b 30 19 11 21 9
cT13O15c 12 7 5 6 6
cF4P13a 30 17 13 18 12
F11A12 20 11 9 12 8
总和Total 142 76 66 81 61
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第5期 苑克俊:改进的拟南芥CAPS标记方法
图1.F11A12标记的Ler和CviPCR
产物的20种酶切的电泳图谱
Fig.1.IdentificationofF11A12markedLerandCviPCR
productsby20restrictionenzymedigestions
3 讨论
尽管过去几年中出现了一些高通量检测DNA
多态性的新技术，(Janderetal.,2002)，然而由于这些
技术需要昂贵的仪器，CAPS方法还是大多数植物
研究单位的首选技术。在原始的 CAPS方法
(Koniecznyetal.,1993)中，PCR产物是用一组酶切
割的。通常，每一PCR产物用25个酶切割，假如没
有检测到多态性，再用另外25种不同的酶切割，如
此进行下去，直到发现具有多态性的酶或者已无酶
可利用。很明显，这里没有提到在酶切割实验前如何
进行酶的选择。我们的结果表明，在拟南芥的Col生
态型中可找到大多数CAPS标记的标记酶位点，供
分析的酶中只有37.5%!47.5%的酶在Col基因组
的扩增区段有酶切位点，在基因组扩增区段上平均
每14个核苷酸就有一个酶切位点。基于这些发现，
我们建立了开发拟南芥新标记的geCAPS方法，并
给出了其科学基础。geCAPS方法不仅可在实验前
进行酶的选择，也可更多地利用基因组或者基因序
列信息，节约超过一半的酶费用。此外，由于它所用
到的仪器和试剂对大多数分子生物学实验室来说并
不贵，所用的有关软件在 TAIR站点(htp:/www.
arabidopsis.cog)是免费使用的，对开发SNP和InDel
标记的实验室尤其有利用价值(Janderetal.,2002)。
geCAPS方法实际上通过特定PCR产物的酶
切割来检测SNPs。在Col和Ler间平均每 3.3kb
就有一个 SNP，但这个数值也有可能被低估了
(Janderetal., 2002; TheArabidopsisGenome
Inititive,2000)。在Ler、Col和Ws(Wassilewskija)三
者中任何一对的频率据估计是每2071027个核苷
酸就有一个SNP(Koniecznyetal.,1993;Hauseretal.
,1998;Choetal.,1999)。由于28%的突变(SNPs)可
直接作为CAPS标记 (Michaelsetal.,1998)，一个
geCAPS标记的设计大小是 739#3668bp(207$
28%=739，1027%28%=3668)。在我们的实验中，6个
Ler和Cvi的CAPS标记的大小是1385~1803bp，
这与dCAPS标记的大小是不同的。由于dCAPS标
记的标记酶位点被人为地设计在其一个引物中，其
标记大小只是80&300bp(Nefetal.,1998;Michaels
etal.,1998)。当然，在两种生态型(例如Col和Ler)
的基因组序列已知时，也可很容易地设计和开发小
于739bp的CAPS标记。在这种情况下，当利用243
种酶或者手头可利用的酶在Col和Ler的扩增区段
进行酶切分析时，有可能发现在一种生态型中有酶
’()*+,-./0123456789:;个酶
<=>?@ABCD
在大多数情况下，知道一种生态型的基因组或
者基因序列已足以用来开发一个 geCAPS标记。
(Bentsinketal.,2003)。这一点是非常重要的，因为对
于大多数植物(包括经济植物)来说，我们还不知道
两种生态型(或者品种)的基因组序列。例如，茶叶上
检查 geCAPS方法的可行性时，只知道品种
Yabukita3个基因的序列。这意味着只要知道一种
生态型或者作物品种的基因组(或者基因)序列，就
可应用geCAPS方法来开发CAPS标记。应用水稻
和茶叶的许多 CAPS标记 (Kaundunetal.,2003;
Barlaanetal.,2001)进行验证后，我们发现在其它植
物中应用geCAPS方法确实是可行的。现在水稻基
因组序列的数据已经可以利用(Yuetal.,2002)。随
着更多植物和动物基因组项目的完成以及越来越多
的基因序列可以利用，geCAPS方法在植物以及动
物众多的遗传分析工作中将非常有用。
致谢:2000E2001年作者在国家留学基金 (CSCNo.
99937032)支持下在荷兰瓦赫宁根大学植物生理学实验室与
VreugdenhilD.合作研究时进行6个新标记的实验工作，遗传
学实验室 BentsinkL.设计了 6个标记的引物，并与
KoornneefM.一起提供了实验技术、实验材料和仪器试剂。
作者对他们以及 JamarD.、RuysG.、AartsM.、HanhartC.、
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农 业 生 物 技 术 学 报 2005年
ClerkxE.和SalahE.的帮助深表感谢。
参 考 文 献
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