全 文 ：蛋白质磷酸化是生物体内蛋白质功能调节的
重要方式. 在细胞内, 多种蛋白质激酶参与蛋白
质的磷酸化, 从而控制着细胞的生长、代谢和分
化 [1]. 酪蛋白激酶(Casein kinase, CK)是广泛存在
于真核生物的丝/苏氨酸蛋白激酶, 能够直接利用
ATP 或 GTP 作为磷酸基团供体 , 包括 CK1 和
CK2两大亚类, 主要定位于细胞膜、细胞质、细胞
核和线粒体等部位. 酪蛋白激酶高度保守, CK1
收稿日期: 2013-04-18; 修回日期: 2013-05-30
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31071076; 30871325); 教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NECT-10-0363); 湖南省杰出青年基
金资助项目(11JJ1005); 教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(教外司留[2011]1139号)
作者简介: 王育(1988-), 男, 安徽六安市人, 硕士研究生, 主要从事植物分子遗传学研究; 王萍(1988-), 女, 河南郑州市人, 硕士研究生, 主
要从事植物分子遗传学研究; 王育与王萍对本文贡献相等, 并列为第一作者; *通讯作者: 郭新红(1975-), 女, 湖南大学教授, 博士生导师,
主要从事分子遗传与发育生物学研究, Tel: 0731-88822606, E-mail: gxh@hnu.edu.cn.
拟南芥突变体 cka3-2的筛选及其功能初步研究
王 育, 王 萍, 袁聪颖, 常洪平, 张 骋, 胡 帅, 陆秀涛, 郭新红*
(湖南大学 生物学院, 化学生物传感与计量学国家重点实验室, 中国湖南 长沙 410082)
摘 要: CKA3-2 基因属于拟南芥 CK 基因家族成员, 该基因编码一条 691 个氨基酸残基的多肽. 利用三引物
法和实时定量 PCR 法鉴定获得 CKA3-2 基因对应的 T-DNA 插入纯合突变体 cka3-2, 并对其表 T 型变化进行
了观察. 实时定量 PCR 分析表明: CKA3-2 基因在茎生叶中表达最高, 花和茎中次之, 在根、莲座叶和果荚中表
达量较低. 赤霉素使 CKA3-2 基因的表达升高, 6 h 时表达量明显增加, 8 h 时表达量下降. 用 50 μmol/L GA3处
理 Col-0 和 cka3-2 幼苗 6 h, 结果发现赤霉素信号转导通路相关基因如 KS、KAO1、KAO2、GA2ox1、GA3OX1 和
GA20OX1 等在两种幼苗中的相对表达量发生明显变化. 此外, 突变体 cka3-2 相对野生型 Col-0 来说 , 具有较
明显的早花现象.
关键词: 拟南芥; CKA3-2 基因; 实时定量 PCR; 表达分析; 早花
中图分类号: Q785 文献标识码: A 文章编号: 1007-7847(2013)04-0305-05
Screening of Arabidopsis cka3-2 Mutant and Its Preliminary Studies
WANG Yu, WANG Ping, YUAN Cong-ying, CHANG Hong-ping,
ZHANG Cheng, HU Shuai, LU Xiu-tao, GUO Xin-hong*
(State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University,
Changsha 410082, Hunan, China)
Abstract：CKA3-2 gene is a member of CK (Casein kinase) gene family, and this gene codes 691 anmino
acids. Three primer PCR method and real-time PCR technique were used to identify the homozygous T-DNA
mutant cka3-2 of CKA3-2 gene in Arabidopsis. The phenotypic changes of cka3-2 and Col-0 plants were
observed. The results of real-time PCR analysis showed that the CKA3-2 gene was highly expressed in stem
leaf, flower and stem, and less in root, rosette leaf and silique. The expression of CKA3-2 gene was induced
by GA3, and its expression was significantly increased at 6 h. However, its expression was decreased at 8 h.
The Col-0 and cka3-2 mutant seedlings were treated with 50 μmol/L GA3 for 6 h, and obvious changes were
found for the expression levels of related genes involved in GA signal transduction pathways including KS,
KAO1, KAO2, GA2ox1, GA3OX1 and GA20OX12. Furthermore, cka3-2 mutants flowered early compared to
Col-0 plants.
Key words: Arabidopsis thaliana; CKA3-2 gene; quantity RT-PCR; expression analysis; early flower
（Life Science Research，2013，17（4）：305～309）
第 17 卷 第 4 期 生命科学研究 Vol．17 No．4
2013 年 8 月 Life Science Research Aug. 2013
生 命 科 学 研 究 2013 年
往往以单体形式存在, CK2由 4个亚基 αα′ββ′组
成. 报道有 160种蛋白在体外被 CK2修饰, CK2
与转录调控、细胞增殖、信号传导、发育和肿瘤发
生等有关[2]; CK1与 DNA修复、代谢调控、有丝分
裂和信号传导的调节等过程有关[3].
CK1是真核生物中非常保守的多基因家族,
它是最早被分离的丝/苏氨酸蛋白激酶之一, 广泛
分布于从酵母到哺乳动物中. 目前, 酵母中发现
有 4个 CK1 基因; 在哺乳动物中发现有 α、β、γ、δ
和 ε等 5个亚家族. 近年来, 在高等动物中有关
CK1 家族的研究有过一些报道, 如 CK1 参与了
Wnt信号通路的传导和生物节律性的调控[4～6]. 但
在高等植物中对 CK1的性质及作用的研究不多,
对它们在植物中的生理功能所知甚少. 同源比较
表明, 在拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中可
搜索到 21 个可能的 CK1 同工酶的 cDNA 序列.
CK1A和 CKL3是拟南芥 CK1亚家族成员, CK1A
可能参与拟南芥蓝光信号传导途径[7]; CKL3可能
与非生物胁迫(盐胁迫和热击)响应有关 [8]; 水稻
OsCKI参与根发育和植物激素的敏感性有关[9], 其
他植物 CK1的研究尚不多见.
在动物细胞中, 许多研究表明 CK2在细胞分
裂、增殖中具有不可或缺的作用 . 有证据显示
CK2的缺少可直接阻断细胞周期, 而不是作为其
影响代谢活性、生物合成下降的一个间接结果[10].
迄今, 关于拟南芥 CK2 蛋白功能的研究已有报
道, 如研究发现 CK2类蛋白 CKB3和 CKB4主要
影响拟南芥生物钟的调节[11, 12]. CKA3-2基因是拟
南芥 CK2亚家族成员, 目前尚未见对其生理功能
研究的报道. 本研究中, 采用实时定量 PCR技术
分析了 CKA3-2基因在不同组织中的表达情况及
其受赤霉素诱导的表达情况. 使用 50 μmol/L 赤
霉素处理野生型 Col-0和插入突变体 cka3-2幼苗
6 h, 发现赤霉素信号通路相关基因如 KS、KAO1、
KAO2、GA2ox1、GA3OX1 和 GA20OX1 等基因在
两种植株幼苗中的相对表达量发生明显变化. 观
察 5 周龄的突变体 cka3-2 和野生型 Col-0 植物,
发现突变体 cka3-2出现早花现象.
1 材料和方法
1.1 植物材料
拟南芥 CKA3-2 (At5g18190)基因的 T-DNA 插
入突变体 Salk_002211(cka3-2)购自 ABRC (arabi-
dopsis biological resource center), 野生型拟南芥为
Columbia生态型 (Col-0). 种子用 70%酒精溶液浸
泡, 吸出酒精溶液后用无菌水清洗 4～6次, 然后
用 0.1% NaClO浸泡 7 min, 吸出后用无菌水清洗
4～6 次 , 放入 4 ℃冰箱中 4 d. 播种时 , 种子用
0.1% 琼脂悬液悬浮后均匀点播在含 0.8%琼脂的
固体培养基表面, 置于 22 ℃光照培养箱中培养.
移栽的植株则放在培养室中于长日照条件下 (光
照 16 h/d, 光照强度为 100 μmol·m-2·s-1). 收取 5
周龄植株的根、茎、叶、果荚、花, 放在液氮中速冻
后储存于-80 ℃冰箱中供目标基因的组织表达分
析用. 生长在培养基上的 2周龄拟南芥幼苗在液
氮中速冻后, 储存于-80 ℃冰箱中供抽提 RNA和
实时定量 PCR分析用.
1.2 基因组 DNA 和总 RNA 的分离以及 cDNA
第一链的合成
基因组 DNA 和总 RNA 的抽提分别采用
DNAeasy Mini Kit和 RNAeasy Mini Kit (Ambiogen
生物技术有限公司) 按照说明书进行操作, 反转
录按照 Invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase
Instruction 操作 , 取 2 μg 经 DNase I 处理的总
RNA用于 cDNA第一链的合成, 产物作为实时定
量 PCR模板.
1.3 三引物法鉴定纯合子
以总 DNA为模板, 采用 T-DNA的特异引物
R0 (5′ -TGGTTCACGTAGTGGGCCATC-3′ )及基因
5′与 3′端引物进行 PCR反应. 鉴定突变体 cka3-2
的 5′端引物为 5′-TGTTCCATAATCCAGTCCTGC-
3′ ; 3′端引物为 5′ -ATGCACACCTAGGTCGAAC-
TG-3′. 在相同 PCR 反应体系中, 分别加入不同引
物组合: 基因 5′与 3′端引物各 1 μL, 基因 3′引物
及 T-DNA 上的特异引物 R0 各 1 μL. PCR 程序
为: 95 ℃预变性 5 min; 95 ℃变性 30 s, 55 ℃退火
30 s, 72 ℃延伸 40 s, 30个循环后延伸 5 min. 1%
琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物.
1.4 实时定量 PCR分析
实时定量 PCR用 JumpStar Taq Readymix kit
(Sigma; Product Code P2893), 荧光染料为 Sybr
Green I (Invitrogen; Lot no. 30033W)和 Rox (Invit-
rogen; Lot no.303260), 在 Mx3000P QPCR System
(Stratagene)仪器上完成. 荧光定量 PCR的引物如
表 1所示. PCR条件为: 95 ℃ 10 min, 95 ℃ 30 s,
57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 57 ℃时采集荧光数据, 共
40个循环.
306
第 4 期 王 育等：拟南芥突变体 cka3-2的筛选及其功能初步研究
图 1 CKA3-2 基因的 T-DNA 插入位点以及缺失突变体 cka3-2 纯合子的鉴定
(A) T-DNA 在 CKA3-2 基因上的插入位点; (B) 三引物 PCR 法鉴定缺失突变体 cka3-2 的纯合子; 1、2、3 分别代表 FR、FR0、
RR0; (C) 实时定量 PCR 技术鉴定缺失突变体 cka3-2 的纯合子.
Fig.1 The T-DNA insertion site in CKA3-2 gene and the homozygous identification and validation of cka3-2 mutant
(A) The T-DNA insertion site of CKA3-2 gene; (B) The homozygous identification of cka3-2 mutant by tri-primer RT-PCR
method; 1, 2 and 3 represent FR, FR0 and RR0; (C) The homozygous identification of cka3-2 mutant by real-time PCR.
2 结果与分析
2.1 cka3-2突变体的插入位点以及纯合子的筛选
利用 TAIR 网站 (www.arabidopsis.org)提供的
有关 CKA3-2基因信息, 发现 T-DNA插入到该基
因起始密码子下游 1 573 bp处(图 1A). 提取 5周
龄大小植株的叶片 DNA, 利用 3对引物 FR、FR0、
RR0(依次为图 1B中的 1、2、3)进行 PCR反应, 经
电泳检测产物如 A 和 E 为纯合子, B、C、G 和 H
为野生型, D为杂合子(图 1B). 将三引物法获得的
纯合子植株继续种植扩大, 利用实时定量 PCR技
术进一步检测上述用三引物法初步获得的纯合子
株系, 结果显示缺失突变体 cka3-2 中未检测到
CKA3-2基因的表达(图 1C), 说明我们获得的是纯
合子.
表 1 荧光定量 PCR 引物
Table 1 Quantitative real time PCR primers
Primer name
CKA3-2 F
CKA3-2 R
KS F
KS R
AtKO1 F
AtKO1 R
KAO1 F
KAO1 R
KAO2 F
KAO2 R
GA2ox1 F
GA2ox1 R
GA3OX1 F
GA3OX1 R
GA20OX1 F
GA20OX1 R
Actin2 F
Actin2 R
Sequence of primers
5′-GAGGATGAACGACCCAAAG-3′
5′-CAGTCCCAGCATCCATTA-3′
5′-AACGGAGATTGGACTCAGAA-3′
5′-CATGGTTATCAAGTCCCCAAG-3′
5′-TGTCTGCGCAGGAGAAAAGT-3′
5′-GATAGCCTCCGATTTGCGTA-3′
5′-CTGACTCCTTCACTCGC-3′
5′-CCTGAGACGCTTGTGTT-3′
5′-TCCATTTGGACCCTGAAATC-3′:
5′-TGTGAGGCAAGAACATCACC-3′
5′-CACTATCCACCATGTCCTCTTA-3′
5′-CAGACCAACTAAACTCCTCGTA-3′
5′-CCATTCACCTCCCACACTCT-3′
5′-GCCAGTGATGGTGAAACCTT-3′
5′-GGGCTAAGTTTAGGCGT-3′
5′-GGTGGCGTCACTACTC-3′
5′- GCAAGTCATCACGATTGGTG-3′
5′-ACAGTGTCTGGATCGGTGGTTC-3′
(A)
(B) (C)
ATG 5′
1 573 bp
TAG
3′
A1A2A3 B1B2B3 C1C2C3 D1D2D3 E1E2E3 F1F2F3 G1G2G3 H1H2H3 Col-0 cka3-2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
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y(
dR
n) 1.2
2.2 CKA3-2基因在不同组织中的表达情况
实时定量 PCR结果表明: CKA3-2基因在各
个不同组织中的表达水平不同, 在茎生叶中表达
量最高, 花和茎中次之, 在根、莲座叶和果荚中表
达量较低(图 2).
2.3 Col-0 和 cka3-2 中 GA 信号转导途径相关
基因表达量的变化
2周龄幼苗经 50 μmol/L GA3处理, 提取不同
处理时间的总 RNA, 逆转录成 cDNA, 实时定量
PCR检测不同时段幼苗中 CKA3-2基因的表达情
况, 结果表明在 GA3处理 6 h时, CKA3-2基因的
表达量最高 (图 3A). 50 μmol/L GA 处理 6 h时,
GA信号转导途径相关基因的表达情况是: 与野
生 型 Col-0 相 比 , AtKO1、KAO2、GA3OX1、
GA20OX1 在 cka3-2 中的表达量高 , 而 AO1 和
GA2ox1基因在 cka3-2中的表达量低(图 3B).
2.4 Col-0与缺失突变体 cka3-2的表型观察
将春化的 Col-0与 cka3-2和未春化的 cka3-2
种子进行播种, 观察整个生长期的变化. 通常, 春
图 2 CKA3-2 基因在不同组织中的表达水平
Fig.2 The expression level of CKA3-2 gene in different tissues
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0.5
1.0
1.5
2.5
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307
生 命 科 学 研 究 2013 年
图 3 实时定量 PCR 分析 GA3信号转导通路中相关基因在野生型 Col-0 与突变体 cka3-2 中的表达情况
(A) 50 μmol/L 赤霉素处理野生型 Col-0 在不同时段中 CKA3-2 基因的表达量变化情况; (B) 50 μmol/L 赤霉素处理 6 h 的野
生型 Col-0 与突变体 cka3-2 中赤霉素信号通路中相关基因的表达量变化情况.
Fig.3 The expression analysis of CKA3-2 gene and related genes involved in GA3 signal pathway by real-time PCR
method
(A) The CKA3-2 gene expression in 15-day-old Col-0 seedlings treated with 50 μmol/L GA3 for 12 h; (B) The expression levels
of related genes involved in GA3 signal pathway in Col-0 and cka3-2 mutant seedlings treated with 50 μmol/L GA3 for 6 h.
化可促进植物提前开花, 如果 CKA3-2基因与调
控开花现象无关, 应该会出现春化的野生型与突
变体比未春化的突变体早些开花. 但是, 我们的
结果显示春化的突变体相对于春花的 Col-0和未
春化的突变体均具有较明显的早花现象(图 4), 从
而暗示 CKA3-2基因可能参与了植物的开花调控.
3 讨论
本研究采用实时定量 PCR分析检测了 CKA3-2
基因在拟南芥不同器官中的表达情况以及 50
μmol/L GA3处理 2周龄的 Col-0和 cka3-2幼苗 6 h
时赤霉素信号转导通路相关基因如 KS、KAO1、
KAO2、GA2ox1、GA3OX1 和 GA20OX1 基因等在
两种植株中的表达量如何变化. 根据上述这些基
因在 Col-0和 cka3-2中的表达量情况, 可以初步
判断出 CKA3-2基因在赤霉素信号转导途径中的
可能地位.结果显示:与野生型 Col-0相比,突变体
cka3-2中的 KS、AtKO1、KAO2、GA3OX1、GA20OX1
等基因的表达量升高, 暗示 CKA3-2基因在赤霉
素信号通路中可能负调控这些基因的表达; 与野
生型相比, 突变体 cka3-2 中的 KAO1 和 GA2ox1
基因的表达量降低, 暗示 CKA3-2基因可能正调
控这 2 个基因的表达. 通过观察 6 周龄大小的
Col-0和 cka3-2植株表型, 发现突变体 cka3-2具
有早花现象, 结果暗示 CKA3-2基因可能抑制开
花. 目前, 我们知道影响开花时间主要有 4种途
径: 光周期途径、春化作用途径、不依赖外源信号
的自主开花途径和赤霉素途径. 各种途径之间主
要是通过 CO、FT、SOC1、FLC 等主效基因的相互
作用, 最终调节花特异性基因 AP1 和 LFY 基因
的表达, 从而调控拟南芥的开花时间[13]. 后续实验
我们将进一步分析 CKA3-2基因是通过哪种可能
的途径来影响拟南芥开花时间,最终解析 CKA3-2
基因在调控植物生长发育过程中的具体作用机理.
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KS
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O1
KA
O2
GA
2ox
1
GA
3O
X1
GA
20O
X1
AtK
O1
Col-0
cka3-2
(B)
图 4 生长 40 d 时春化野生型 Col-0 与突变体 cka3-2 和
未春化突变体 cka3-2 的表型观察
Fig.4 The phenotypic observations of 40-day-old seed-
lings of vernalized wild type and cka3-2 mutant, and un-
vernalized cka3-2 mutant
Col-0(vernalization)
cka3-2(not vernalization)
cka3-2(vernalization)
cka3-2
(vernalization)
cka3-2
(not vernalization)
Col-0
(vernalization)
308
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王 育等：拟南芥突变体 cka3-2的筛选及其功能初步研究 309