全 文 ：拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类
进化酶的获得及其特性分析 *
陶苏丹 ** 陈喜文 ** 刘 佳 贾向东 陈德富 ***
(南开大学生命科学学院，天津 300071)
摘要 拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类(AtGSTZ)是一种与细胞代谢和环境净化密切相关的多功能酶.应用易错PCR和多轮
DNA洗牌技术构建了AtGSTZ随机突变文库，再利用pH指示剂颜色改变法对突变文库进行筛选，获得了9个二氯乙酸脱氯
活性提高的突变子.其中，NN23含25个氨基酸突变，比活力提高120%，NN20含24个氨基酸突变，比活力提高102%，
EC1含2个氨基酸突变，比活力提高47%，其他6个为单点突变，比活力分别提高9%～60%.酶学分析显示，所有进化酶
对底物二氯乙酸的催化效率和对谷胱甘肽的亲和力以及个别进化酶的复性能力都得到不同程度的提高，但热稳定性均没有明
显改善.同时，对一系列与AtGSTZ空间折叠及催化活性相关位点进行了讨论.
关键词 进化子，二氯乙酸脱氯(DCA-DC)活性，热稳定性，复性能力，拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类
学科分类号 Q555，Q75
*国家自然科学基金资助项目(30671183).
**同为第一作者.***通讯联系人.
Tel/Fax:022-23500133,E-mail:chendefu@nankai.edu.cn
收稿日期：2007-06-20，接受日期：2007-08-08
生物化学与生物物理进展
ProgressinBiochemistryandBiophysics
2008,35(2):208~216
www.pibb.ac.cn
研究报告ResearchPapers
谷胱甘肽 S-转移酶(glutathioneS-transferases，
GSTs，EC2.5.1.18)是一种具有解毒作用的超家族
二聚体蛋白酶，普遍存在于细菌、真菌、植物及动
物细胞中[1].植物 GSTs分为 4大类：phi、tau、
theta及zeta[2].Zeta类(GSTZ)由于其性质独特，自
1997年被发现以来越来越受到关注.它能有效降
解包括二氯乙酸(DCA)在内的多种卤代物，而
DCA是自来水氯处理过程中产生的对啮齿类动物
具有强致癌毒性的副产物[3]，因此该酶的二氯乙酸
脱氯(DCA-DC)活性已成为人们关注的焦点.此外，
GSTZ还具有顺丁烯二酰乙酰乙酸异构酶活性，在
生物体内苯丙氨酸、酪氨酸等氨基酸代谢中起关键
作用[4].
拟南芥来源的GSTZ简写为AtGSTZ，其单体
由221个氨基酸残基组成，编码基因的开放阅读框
为666个碱基[4].AtGSTZ单体的晶体结构已被测
定，由2个结构域组成，即N端结构域和C端结
构域.N端结构域由1～84位氨基酸组成，此区域
非常保守，是谷胱甘肽(GSH)的结合区域(G-site)；
C端结构域由93～221位氨基酸组成，此区域高度
可变，是疏水底物结合区(H-site)[5].虽然 AtGSTZ
的晶体结构已被测定，但其相关研究的深度远不如
其他家族的GSTs[6～8]，如对结构的了解仅限于其活
性中心，功能位点还不很清楚，催化性质仅限于酶
动力学研究[4,9～11].
酶的体外定向进化是近几年发展起来的蛋白质
改造新技术，不仅能获得有重要经济价值的进化
子，还适合于蛋白质结构-功能关系分析[12].本文
应用易错PCR(eror-pronePCR，EP-PCR)[13]和多轮
DNA洗牌(DNAshufling)[14]技术，构建了 AtGSTZ
随机突变文库.然后应用pH指示剂颜色改变法[15]，
从中筛选出DCA-DC活性提高的突变子，并分析
了其酶学特性.同时，结合氨基酸比对结果和酶动
力学数据，对一系列与AtGSTZ正确折叠及催化活
性相关位点进行了讨论，为进一步阐明其功能位点
及开展高效定向改造奠定了基础．
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒与试剂
大肠杆菌菌株DH5!-FT和BL21(DE3)，质粒
陶苏丹等:拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类进化酶的获得及其特性分析2008;35(2)
pET21b(+)和 pMID1-AtGSTZ[16]均为本室保存.
rTaqDNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、
NdeⅠ、NotⅠ、T4DNA连接酶、异丙基-!-D-硫
代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(Amp)及各种引物
等购自宝生物工程(大连)有限公司.GSH购自
AMRESCO公司.酵母抽提物与蛋白胨购自
OXOID公司.乙醛酸购自日本和光纯药工业株式
会社.其他试剂均为国产分析纯.
1.2 构建AtGSTZ突变文库
先对 AtGSTZ基因进行 EP-PCR，再对其产物
进行多轮 DNA洗牌.EP-PCR的引物设计依据
AtGSTZ序列及 pET21b(+)多克隆位点序列，上游
引物为 GSTZ-1(5′ctactctgcatatggcgaatccggc3′，
下划线为 NdeⅠ位点)，下游引物为 GSTZ-rev(5′
gatgatgatgggcggccgcgatggtgga3′，下划线为NotⅠ位
点).EP-PCR体系包括：0.2mmol/LdATP、
0.2mmol/LdGTP、1.0mmol/LdCTP、1.0mmol/L
dTTP、0.3mol/L2种引物、7.5mmol/LMg2+、
0.5mmol/LMn2+、0.01%TritonX-100、0.05U/#l
rTaqDNA聚合酶及 0.2mg/LpMID1-AtGSTZ.扩
增条件为：94℃ 5min，94℃ 40s、58℃ 32s、
72℃ 90s35个循环，72℃ 7min.扩增产物经
0.7%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收目的片段用
于DNA洗牌.
回收的DNA在15℃下用0.1U/$lDNaseⅠ消
化数分钟后，85℃保温20min，再添加5%(v/v)含
50mmol/LEDTA和30%(v/v)甘油的预冷缓冲液A
终止反应.电泳回收40～100bpDNA片段用于无
引物重排反应.重排反应条件同EP-PCR，但不加
引物、模板DNA浓度改为 10～20mg/L、循环数
降至20.
回收重排产物，再重复上述步骤 (DNaseⅠ消
化和无引物重排)2次，最后得到的重排产物进行
有引物 PCR.反应体系为：0.2mmol/LdNTP、
0.3%mol/L每种引物、0.05U/&lExTaqDNA聚合
酶及适量重排DNA.PCR条件同无引物重排.产
物回收后用NotⅠ和NdeⅠ消化，并与经同种限制
性内切酶消化的pET21b(+)载体连接，然后电转化
进大肠杆菌 DH5’-FT，得突变文库，并计算
库容.
1.3 筛选AtGSTZ进化子
利用pH指示剂颜色改变法[15]筛选AtGSTZ进
化子.回收突变文库的全部菌落，提取质粒DNA，
转化进BL21(DE3)，接种到铺有一层硝酸纤维素滤
膜的LA(含50mg/LAmp的LB)平板上，37℃倒置
培养 10h，得表达文库.然后将滤膜转移至含
0.5mmol/LIPTG的 LA平板上，37℃过夜诱导，
再将滤膜转移至浸有13mg/L酚红、13mg/L溴酚
蓝、0.3g/L溶菌酶、0.5mmol/LIPTG及5倍稀释
LA培养液(pH8.2，蓝色)的双层滤纸上.待全部
菌落转蓝后(需 0.5～1h)，反转滤膜并置于含
13mg/L酚红、13mg/L溴酚蓝、10mmol/L
DCA、1mmol/LGSH、0.5mmol/LIPTG及 12g/L
琼脂的 5倍稀释 LA培养基(pH8.2，蓝色)上，
37℃倒置培养.具DCA-DC活性的菌落，其所在
位置(培养基或滤膜)将变黄，黄色深浅反映菌落
DCA-DC活性的强弱.挑选菌落所在位置明显变黄
的单菌落(需1～2h)进行诱导表达及序列测定.
1.4 AtGSTZ进化酶的表达及DCA-DC比活力测定
将挑选的单菌落接种至10ml含50mg/LAmp
的 2×TY培养液中，37℃培养至 A600≈0.8，加入
IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养10h，离心收
集菌体.菌体悬浮于含 0.3g/L溶菌酶、0.01%
TritonX-100的100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中，
室温保温30min，-70℃/4℃冻融处理和超声波破
碎，再 15000r/min4℃离心15min，上清即为酶
液.12.5%SDS-PAGE检测蛋白质带型及含量.测
定DCA-DC活性，方法参照Tong等[9]做如下修改，
反应体系中加入2mmol/LDCA和4mmol/LGSH，
37℃保温7min.以每分钟产生1nmol乙醛酸的量
为1个DCA-DC活力单位(U)，取3次重复实验的
x±s为其比活力值.
1.5 测定AtGSTZ进化酶动力学参数
测定底物DCA动力学参数时，固定GSH浓度
为4mmol/L，设置DCA浓度范围为0.2～1.6mmol/L.
测定底物 GSH动力学参数时，固定 DCA浓度为
2mmol/L，设置GSH浓度范围为0.5～8mmol/L.
DCA-DC活性测定同本文1.4，但37℃保温时间减
至5min.依A535值计算各进化酶的Km和Kcat，取
3次重复实验的x±s为其动力学参数值.
1.6 AtGSTZ进化酶的热稳定性和复性能力分析
热稳定性分析时，设 6个处理温度(37℃、
45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)，各进化酶分别
保温 15min后再于冰上静置 10min，再测其
DCA-DC比活力.以各处理温度酶活与37℃标准
温度酶活百分比表示其热稳定性.
209· ·
生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2008;35(2)
bp
925
421
M 1 2 3
bp
162
79
M 1 2 3 4 5 6
bp
925
421
M 1
bp
925
421
M 1 2 3 4
复性能力分析时，各进化酶在变性液(100mmol/L
磷酸缓冲液、4mol/L尿素、1mmol/LEDTA，
pH7.4)中变性30min后，再用复性液(100mmol/L
磷酸缓冲液、1mmol/LEDTA，pH7.4)稀释5倍，
室温下再静置 10min，再测其 DCA-DC比活力.
以复性后酶活与未经变性处理酶活百分比表示其复
性能力.
热稳定性和复性分析中的DCA-DC比活力测
定同本文1.4.
2 结果与分析
2.1 AtGSTZ突变文库的构建与筛选
以pMID1-AtGSTZ为模板，GSTZ-1和GSTZ-rev
为引物，进行EP-PCR，其电泳图谱见图1.结果
显示，扩增带集中在0.7kb附近，与预期相符.回
收目的片段用于DNaseⅠ消化.不同消化时间的电
泳图谱见图2.结果显示，消化片段的长度随消化
时间的延长而变短.20min时，消化片段长40～
160bp，大多集中在 80bp附近，是进行 DNA重
排反应的理想长度.
Fig.1 TheamplifiedpaternofAtGSTZbyEP-PCR
M:!/EcoT14ⅠdigestDNAmarker;1～3:TheEP-PCRproducts.
Fig.2 TheprofileofAtGSTZdigestedwithDNaseⅠ
M:ΦX174/HincⅡdigestDNAmarker;1～6:Thetreatedtimewas1,2,
4,8,12and20minutes,respectively.
回收40～80bp的消化片段用于无引物重排，
图3为其重排产物电泳图谱.结果显示，重排产物
集中在 0.7kb，表明多数已组装成全长 AtGSTZ.
回收重排产物，再重复 DNaseⅠ消化和无引物重
排，最后获得 0.7kb片段用于有引物 PCR.图 4
为不同模板量下有引物 PCR的扩增结果.显示，
当PCR循环数为20时，22.5～37.5mg/L重排模板
量能有效地扩增出全长AtGSTZ.
回收有引物PCR产物，NdeⅠ和NotⅠ双酶切
后与pET21b(+)连接，再电转化进DH5-FT，得库
容为5×105的突变文库.收集全部转化子，提取重
组质粒，转化 BL21(DE3)，得相同大小的表达文
库.利用硝酸纤维素滤膜介导的pH指示剂颜色改
变法，从中筛选出50余个颜色变黄的单菌落.
Fig.3 ThereassemblyofdigestedAtGSTZfragments
M:#/EcoT14ⅠdigestDNAmarker;1:Thereassemblyproducts.
Fig.4 Amplificationprofilewithprimerswhenusing
diferentamountofreassembledAtGSTZ
M:$/EcoT14ⅠdigestDNAmarker;1～4:Theamountofthereassembly
fragmentswere3,9,22.5and37.5mg/L,respectively.
2.2 AtGSTZ进化子的氨基酸序列比对
对筛选出的50余个单菌落在 IPTG诱导下表
←
←
←
210· ·
陶苏丹等:拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类进化酶的获得及其特性分析2008;35(2)
达目的蛋白，SDS-PAGE检测其上清，大部分突变
子表达不稳定，仅 9个进化子表达稳定，它们是
EA1、 EA3、 EA4、 EA6、 EC1、 NN1-67、
NN2-54、NN20和NN23.序列分析显示，9个进
化子中，6个为单点突变，3个为多点突变(EC1突
变2个氨基酸，NN20突变24个氨基酸，NN23突
变 25个氨基酸，NN20和 NN23仅相差 1个氨基
酸).图5是9个进化子与野生型酶的氨基酸序列
比对结果，可以看出，无论是单点突变还是多点突
变，氨基酸突变位点均位于活性中心周围，活性中
心的氨基酸没有突变.
Fig.5 ThealignmentoftheimprovedAtGSTZmutants
ThesecondarystructureofAtGSTZwasreferenced[5].WT:Wildtype;:Activesites; :ResiduesbetweendomainⅠ;:Residuesbetweendomain
Ⅱ;:ActivesitesⅠbetweensubunits; :activesitesⅡbetweensubunits; :!helices; :sheet.
211· ·
生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2008;35(2)
Dataareshownasx±s,n=3.
Table1 ThediferenceofDCA-DCactivityamongtheevolvedAtGSTZmutants
Enzymes Mutatedaminoacids Specificactivity/(U·mg-1) RelativeactivitywithWT/%
Native - 204.57±12.13 -
EA1 Q115P 267.57±3.13 131
EA3 P113R 223.13±8.25 109
EA4 Q115L 238.66±12.22 117
EA6 D67H 276.21±14.27 135
EC1 I111L/Q115P 300.11±11.58 147
NN1-67 N55Y 327.38±2.72 160
NN2-54 Y79F 235.49±32.87 115
A28S,D33E,K43R,D45E,F47S,S49P,N71S,
F74L,R92P,Y101F,M104A,A118G,R121K,
Y122F,V129S,N137T,N153S,I164V,H176Y,
M186L,K194T,N200K,E201D,L209A
414.13±30.29 202
AS28S,D33E,E35D,K43R,D45E,F47S,S49P,
N71S,F74L,R92P,Y101V,M104A,A118G,
R121K,Y122F,V129S,N137T,N153S,I164V,
H176Y,M186L,K194T,N200K,E201D,L209A
449.79±22.81 220
NN23
NN20
2.3 AtGSTZ进化子的比活力分析
9个AtGSTZ进化子的DCA-DC比活力结果见
表1.可以看出，多点突变进化子的比活力提高较
大(NN23提高了120%，NN20提高了102%，EC1
提高了47%)，单点突变进化子的比活力提高较小
(除 NN1-67提高了 60%外，其余均未超过 35%)，
暗示多点突变对酶活性的改善优于单点突变.
在单点突变进化子中，EA6、NN1-67和
NN2-54的突变位点位于N端，活性的提高可能与
“G-site”的改变有关；EA1、EA3和 EA4的突变
位点位于C端，活性的提高可能与“H-site”的改
变有关.EA1和 EA4均为 Gln115突变，但变成
Pro的EA1比变成Leu的EA4活力高，暗示此位
点的 Pro比 Leu更有利于形成较高活性的结构.
EC1比EA1多一个I111L突变位点，其比活力高
于 EA1，暗示 Leu111能单独或协同 Pro115提高
AtGSTZ的DCA-DC活性.
2.4 AtGSTZ进化酶的动力学参数
表2列出了各进化酶的动力学参数.从中可以
看出，各进化酶的 KmDCA介于 0.5～0.65之间，与
野生酶相比差异不明显，但KcatDCA和KcatDCA/KmDCA值
明显升高，其中进化酶 NN20、NN23和 NN1-67
提高最大，这与它们较高的比活力相吻合.
各进化酶的K0.5GSH均比野生酶低1～2mmol/L，
暗示各进化酶与电子传递物 GSH的亲和力增加，
其中 EA3、EC1、NN1-67和 NN2-54增加最明
显.野生AtGSTZ对GSH的Hil常数为 1.13，不
符合经典的米氏方程，有微弱的正协同效应，这与
前人研究结果[6]相一致；9个进化酶的Hil常数与
野生酶的差异不明显，暗示各突变位点对AtGSTZ
亚基间的正协同效应影响不大.
212· ·
陶苏丹等:拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类进化酶的获得及其特性分析2008;35(2)
Table2 ThediferenceofkineticparametersamongtheevolvedAtGSTZmutants
Dataareshownasx±s,n=3.
表3为AtGSTZ进化酶复性能力的结果.可以
看出，NN1-67最高，为54.28%，NN23次之，为
50.1%，其余与野生酶间没有显著差异，均为42%
左右.由于复性能力在一定程度上反映了酶的折叠
能力，因此 NN1-67的突变位点(N55Y)可能与
AtGSTZ的空间折叠有关.NN23比 NN20仅多一
个氨基酸突变(E35D)，但 NN23的复性能力却比
NN20高 12%，暗示 AtGSTZ上第 35位残基与酶
Enzymes
KmDCA
/(mmol·L-1)
KcatDCA
/min-1
KcatDCA/KmDCA
/(mmol-1·L·min-1)
K0.5GSH
/(mmol·L-1)
Hilcoeficient
Native 0.56±0.02 15.4±0.4 27.75±1.46 5.37±0.58 1.13±0.02
EA1 0.61±0.03 19.8±2.7 32.41±3.15 4.47±0.66 1.08±0.04
EA3 0.64±0.03 17.6±2.2 27.61±4.47 4.03±0.33 1.18±0.03
EA4 0.64±0.08 18.0±2.1 28.10±1.53 4.27±0.46 1.14±0.03
EA6 0.65±0.08 19.6±3.7 30.11±3.53 4.42±0.37 1.10±0.03
EC1 0.58±0.04 21.9±0.4 37.75±2.20 4.00±0.26 1.08±0.02
NN1-67 0.65±0.06 24.8±0.4 38.09±2.78 4.10±0.24 1.13±0.05
NN2-54 0.50±0.01 16.1±0.2 32.37±0.92 3.95±0.41 1.10±0.06
NN20 0.53±0.08 21.6±0.7 41.49±4.79 4.29±0.46 1.11±0.01
NN23 0.59±0.01 24.0±0.1 40.41±0.79 4.23±0.89 1.12±0.03
2.5 AtGSTZ进化酶的热稳定性和复性能力
图 6为 AtGSTZ进化酶的热稳定性结果.
45℃、50℃、55℃处理后各进化酶的相对活性均没
有明显改变；60℃处理时，各进化酶的相对活性明
显降低，仅保留50%～60%；65℃时，仅保留10%
活性.进化酶热处理后保留活性与野生酶间没有显
著差异，暗示突变位点对AtGSTZ热稳定性没有明
显影响.
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生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2008;35(2)
Dataareshownasx±s,n=3.
Enzymes Renaturability/%
Native 42.06±7.37
EA1 45.23±5.08
EA3 46.20±3.58
EA4 37.89±2.13
EA6 45.85±5.88
EC1 43.03±3.34
NN1-67 54.28±6.23
NN2-54 47.02±5.51
NN20 38.12±8.10
NN23 50.10±7.82
的空间折叠有关.
Table3 Thediferenceofrenaturabilityamong
theevolvedAtGSTZmutants
3 讨 论
本文利用EP-PCR和多轮DNA洗牌技术构建
了AtGSTZ随机突变文库，然后利用AtGSTZ催化
二氯乙酸脱氯生成盐酸而改变介质pH进而使pH
指示剂颜色改变的方法，从5×105的突变文库中筛
选出9个DCA-DC比活力提高的进化子.进化子
筛选效率明显低于其他酶，如Lee等[17]从5000的
突变库中筛选出 12个法尼基焦磷酸合成酶进化
子.本文中进化子筛选效率较低可能与多轮DNA
洗牌有关.DNA洗牌将产生大量的致死或活性下
降的移码、缺失、重复、多点替换等突变类型[18]，
较高的致死或活性下降突变的产生将直接影响高活
性突变子的筛选效率.同时，多点突变可导致酶的
三维结构发生重大改变进而导致其功能丧失，所以
9个进化子中，6个为单点突变，仅3个为多点突
变，显示多点突变获取活性提高的进化子的几率比
较低.
进化酶与野生酶的氨基酸序列比对发现，突变
氨基酸并未发生在AtGSTZ的活性中心，而是发生
在间接影响酶催化活性的区域，即酶活性中心周围
区域.该发现与Guo等[19]在3-甲基腺苷酸DNA糖
基化酶(AAG)上的研究相吻合.他们认为，活性中
心氨基酸残基耐受突变的能力明显低于各二级结构
单元间的无规则卷曲.因此，通过定点诱变或点饱
和突变技术改造活性中心周围氨基酸残基来提高酶
的活性，是进一步改造AtGSTZ的新方向.
获得的9个DCA-DC活性提高进化酶的KmDCA
在0.5～0.65之间，与野生酶差异不显著，说明这
些氨基酸残基的突变对酶与底物DCA的亲和力没
有影响，不能增加酶-DCA复合物的稳定性，但其
KcatDCA/KmDCA和KcatDCA明显高于野生酶，即酶 -DCA
复合物分解成乙醛酸的能力得到了提高.对GSH
的Hil常数和K0.5GSH分析发现，9个进化酶亚基间
的协同效应虽不明显，但与GSH的亲和力，即酶-
GSH复合物的稳定性得到了明显改善.因此，本文
所得进化酶活性提高的主要原因，是改变了DCA
的催化能力及酶-GSH复合物的稳定性.
进化子NN23和NN20的活性较高，分别是野
生型的2.2和2.02倍，这与其多点突变可能有一定
的联系.近年研究表明，多点突变可造成酶活性中
心三维构象的重大改变，能引入额外的协同作用，
产生出结构更优、功能更强的进化子[20].在野生型
AtGSTZ中，Phe74、Tyr101、Met104等位点参与
结构域及亚基间的相互作用，形成疏水核心[5].
NN20与NN23虽在74、101和104位均产生了突
变，但由于是突变成疏水氨基酸，并未影响到疏水
核心的形成，这也是NN20和NN23仍维持正确空
间构象而具有活性的重要前提.进化子 NN20和
NN23在许多特性上差异不大，但NN20的复性能
力比NN23低12%，二者在序列上只有一个氨基酸
差异，35位氨基酸残基分别是 Asp和 Glu，说明
35位残基可能与 AtGSTZ的正确折叠有密切关
系.Asp和 Glu都是酸性氨基酸，Asp35优于
Glu35的原因可能是Asp的侧链小，从一级结构折
叠成高级结构的空间位阻将相应变小.
Asn55位于N端结构域 2螺旋的末端，并不
与 GSH和 DCA直接作用，但进化子 NN1-67在
55位由 Asn突变成 Tyr，DCA-DC比活力提高了
60%，KcatDCA/KmDCA也明显提高.其活性提高可能与
AtGSTZ的 #2螺旋及其邻近的 $3折叠有关，这2
个区域是酶与GSH结合的重要特征区域[5]，N55Y
突变可能导致酶空间构象改变，影响酶与GSH的
结合从而间接影响酶的催化活力.本文发现，
NN1-67具有较高的热稳定性和复性能力，在一定
程度上支持该构象变化影响酶催化活力的推测.
N端结构域 %1螺旋和 &3螺旋的氨基酸残基
与C端结构域 ’4螺旋和 (6螺旋的氨基酸残基之
间形成疏水区，该疏水区是 N端和C端结构域间
214· ·
陶苏丹等:拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类进化酶的获得及其特性分析2008;35(2)
的主要作用力[5]，二聚体亚基间的 !3螺旋与 4螺
旋的疏水作用是AtGSTZ两亚基间的主要作用力[5].
本研究发现 Tyr79突变为 Phe后，活性提高了
15%.由于79位残基位于 #3螺旋中，疏水的Phe
也可能参与N端疏水表面的形成，进一步促进了
N端与C端结构域及二聚体亚基之间的相互作用，
从而提高DCA-DC活性.
保守基元IQP(111～113)位于 C端结构域 $4
螺旋的末端，被认为与底物结合和催化活性有关[5].
但这些保守位点的突变却没有使酶失活，酶活反而
微弱提高(EA3、EC1)，说明保守位点也具有耐受
突变的能力.这与Matsumura等[21]的结果相一致，
他们对 %-葡糖苷酸酶进行定向进化，获得的高酶
活突变体的突变位点也位于高保守区.
在全部进化子中，EA6活性提高的原因比较特
殊，67位酸性Asp突变成碱性His后，不但没有失
去活性，反而显示出更高的 DCA-DC比活力.
AtGSTZ晶体结构显示，Asp67位于 &3和 ’4连接
处，远离活性中心，这种远离活性中心且性质相反
氨基酸的突变，是很难用理性设计预测的.当然，
D67H突变使酶活性提高的原因尚需进一步探讨.
通过对获得的9个进化子的分析，本文鉴定出
了一系列与AtGSTZ催化活性和折叠相关位点，如
Glu35、Asn55和 Tyr79等位点，但一些位点的作
用机制还需深入研究.鉴于AtGSTZ在细胞内代谢
及污染物处理等方面的重要作用，通过定向进化获
得高活性进化子具有良好的应用前景，也为
AtGSTZ结构-功能关系的研究及进一步了解它的
作用机理奠定了基础.
致谢 感谢南开大学生命科学学院2003级明铭同
学在本工作上给予的协助.
参 考 文 献
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生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2008;35(2)
ObtainmentandCharacterizationofTheEvolved
EnzymesFromArabidopsisthalianaGlutathione
S-TransferaseZetaClass*
TAOSu-Dan**,CHENXi-Wen**,LIUJia,JIAXiang-Dong,CHENDe-Fu***
(ColegeofLifeSciences,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)
Abstract TheArabidopsisthalianaglutathioneS-transferaseszetaclass(AtGSTZ)isamulti-functionalenzyme,
whichplaysimportantroleincelularmetabolismandenvironmentalpurification.Eror-pronePCRandcyclesof
DNAshuflingwereusedtoconstructamutagenesislibraryofAtGSTZ.Thescreeningoftheresultantlibrarieswas
cariedoutbyapHindicatordye-basedcolorimetricassay.Ninemutantswhichenhancedthedichloroaceticacid
dechlorinationactivitywereobtained.Amongthem,NN23contained25aminoacidsubstitutionswiththeactivity
improving120%,whereasNN20contained24aminoacidsubstitutionswiththeactivityimproving102%.EC1
contained2aminoacidsubstitutionswiththeactivityimproving47%.Therest6mutantscontainedoneamino
acidsubstitutionwiththeiractivityincreasingfrom9%to60%.Theenzymaticcharacterizationshowedthatalthe
evolvedenzymesincreasedtheircatalyticeficienciestowardsdichloroaceticacidandbindingafinitytowards
glutathionewhereassomeofthemincreasedtherenaturability.Howeverthereisnoobviouschangeintheir
thermostability.Basedonthesedata,functionalresiduesrelatedtocatalysisandrefoldingofAtGSTZwere
discussed.
Keywords evolvedmutants,dichloroaceticaciddechlorination(DCA-DC)activity,thermostability,renaturability,
ArabidopsisthalianaglutathioneS-transferaseszetaclass(AtGSTZ)
*ThisworkwassupportedbyagrantfromTheNationalNaturalScienceFoundationofChina(30671183).
**TAOSu-DanandChenXi-Wencontributedequalytothiswork.
***Corespondingauthor.Tel/Fax:86-22-23500133,E-mail:chendefu@nankai.edu.cn
Received:June20,2007 Accepted:August8,2007
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