全 文 ：第 37卷第 3期　　　　　　　　　　 　　　　　上海师范大学学报(自然科学版) Vol.37, No.3
2 0 0 8年 6月　　　　　　　　　　 JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) 2 0 0 8 , Jun.
拟南芥雄性不育突变体 ms1521的基因定位
周　鹊 , 贾琦石 , 杨仲南 , 张　森＊
(上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 200234)
摘　要:ms1521是经 EMS诱变筛选得到的一拟南芥雄性不育突变体.通过背景纯化与遗传分
析 ,发现 ms1521突变体是受隐性单基因控制.形态学观察表明:突变体的花缺失部分花瓣 ,雄
蕊比较短 ,花药肥大 ,部分雄蕊的花药成丝状.利用图位克隆的方法对不育基因 MS1521进行
了定位 ,结果表明:MS1521位于第一条染色体分子标记 F17F8Alu1和 T19E23之间 161kb的
区间内.数据库预测 ,其中有 11个与花发育有关的基因.试验将有助于对目的基因的克隆 ,控
制花器官研究和雄性不育分子机制的研究.
关键词:拟南芥;雄性不育;基因定位;花器官发育
中图分类号:Q943.2　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5137(2008)03-0296-05
　　　　　　　　　　
收稿日期:2008-02-21
基金项目:国家自然科学基金(30671127);上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金(RE566).
作者简介:周　鹊(1982-), 女 ,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生;张　森(1963-),男 , 上海师范大
学生命与环境科学学院副教授.
＊通讯作者.
0　引　言
雄性不育是高等植物生命活动中的一个普遍现象 ,与雄蕊 ,花药和花粉的发育密切相关.雄性不育
基因的克隆有利于人们对这些组织和器官发育的深入研究.雄性不育又是生产上杂交育种的基础.因此
雄性不育现象的研究及不育基因的克隆具有理论意义 ,又有潜在的应用价值.
拟南芥基因组小 ,生长周期短 ,结子量大 ,已经作为模式植物用于功能基因的分离.拟南芥全基因组
序列测序的完成 [ 1] ,加快了人们对基因功能的研究.目前已从拟南芥中分离出近三十个雄性不育基因
包括 ATP1[ 2] , SYN1[ 3] , CYP74a[ 4] , MS2[ 5] , EMS1[ 6]以及 MS1[ 7]基因等.据文献报道大约有 3500个基因
在拟南芥花药中表达 ,其中 60到 100个基因为花药发育所必需 ,任何一个基因的突变都可能会导致雄
性不育 [ 8] .因此 ,拟南芥中尚有许多不育基因未得到克隆.
经典 ABC模型假定拟南芥是由 ABC三类基因的表达而控制花的结构[ 9] .拟南芥的花代表了大多
数被子植物花的结构 ,由 4轮同心花器官组成 ,由外向内分别为:萼片 、花瓣 、雄蕊和雌蕊.ABC三类基
因分别控制相邻两轮花器官的发育 ,其中 , A和 C两类基因相互拮抗 ,即 A功能基因能够抑制 C在一 ,
二轮的表达 , C反过来也能抑制 A在三 ,四轮的表达 [ 10] .A类基因包括 AP1, AP2,能控制萼片和花瓣的
发育 ,其功能丧失会导致第一轮的萼片变为心皮 ,第二轮的花瓣变成雄蕊.B类基因包括 AP3, PI,能控
制第二 ,三轮花器官的发育 ,其功能丧失会使第二轮花瓣变为萼片 ,第三轮的雄蕊变为心皮.C类基因
含有 AG,能控制第三 ,四轮花器官的发育 , 其功能丧失会使第三轮的雄蕊变为花瓣 ,第四轮的心皮变成
萼片[ 11 ～ 14] .在这 5个基因中 , AP1, AP3, PI和 AG都是 MADS盒家族的成员 ,这 3类基因中任何一个基
因的功能丧失或突变都会导致花器官性状的改变.
本实验通过 EMS诱变拟南芥植株 ,分离得到了一棵雄性不育突变体 ms1521,并对该突变体进行了
表型分析 ,并运用图位克隆的方法对不育基因 MS1521进行基因定位.所得结果有助于进一步阐明植物
雄性不育的机理.
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料
野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana):生态型 Columbia(Col),生态型 Lansbergerecta(Ler).
拟南芥突变体 ms1521:由本实验室用 EMS诱变得到的雄性不育株系.
1.1.2　数据库
本实验所需数据信息来源于:htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/, htp://www.arabidopsis.org/和 htp://
www.genevestigator.ethz.ch/.
1.2　方法
1.2.1　材料种植
拟南芥在 0.1%的琼脂糖中 4℃春化 2 ～ 4d后培养在黑土 ,蛭石 ,珍珠岩(1∶6∶0.25)的混合土中.培
养时在其上层罩一层塑料膜以保持湿度 ,当拟南芥萌发出子叶后去掉塑料层.光照时间为 16h, 8h黑暗 ,
湿度保持在 60% ～ 70%,温度控制在 22 ～ 25℃,光照强度为 50Em-2s-1 ,营养液为 PNS.
1.2.2　突变体的背景纯化与遗传分析
以拟南芥野生型 Ler为父本 ,突变体为母本进行回交得到 F1代 , F1代自交后得到 F2代.种植并观
察 F2代表型 ,统计 F2代中可育植株与不育植株的比例.
1.2.3　突变体定位群体的建立
以拟南芥野生型 Col为父本 , Ler背景的突变体为母本进行回交得到 F1代 , F1代自交后得到 F2
代 ,收集 F2遗传群体中的不育突变体用于基因定位.
1.2.4　分子标记
用于基因定位的分子标记是根据网上公布的拟南芥基因组多态性数据库 ,并利用软件 Primer5.0
进行引物设计.一般从数据库中优先选择 In/Del标记 ,用 2.5%的琼脂糖进行凝胶电泳验证 2个亲本
LER和 COL之间的多态性.
1.2.5　突变体基因的初定位
(1)随机选取 50株不育突变体 ,每 25株构成一个 DNA池.野生型 Ler和 Col的 DNA分别作为对照.
(2)研磨法提取拟南芥基因组 DNA,提取参照 Sun等 [ 15]方法并作适当改进.
(3)分别以野生型和 2个 DNA池为模板 ,用初定位分子标记为引物进行 PCR扩增.
(4)PCR结束后用 2.5%琼脂糖进行电泳 ,并利用 TanonGIS凝胶图像处理系统拍照.
1.2.6　突变体基因的精细定位
用高通量的方法 [ 16]提取突变体单株的 DNA,根据初定位结果选择 、合成新的分子标记对这些植株
进行基因型分析 ,对目的基因进行精细定位.
2　结果分析
2.1　突变体的表型分析
ms1521突变体是经化学诱变剂 EMS诱导拟南芥野生型 Ler种子筛选得到的雄性不育植株.从表型来
看 ,突变体 ms1521与野生型形成很大差异(图 1A, B),在突变体植株上 ,果荚短小不结籽 ,呈现不育性状.
通过进一步的解剖镜观察 ,发现突变体的花器官发育不正常 ,突变体 ms1521的花缺失部分花瓣
(图 1C, D),雄蕊比较短 ,部分雄蕊的花药成丝状(图 1 E, F),并且突变体的花药与野生型相比显得比
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较肥大(图 1 G, H).当用野生型的花粉和突变体的雌蕊杂交后 ,突变体产生短小肥大的果荚 ,内有 15 ～
20粒种子 ,这些结果说明该突变体是雄性不育.
A, C, E, G:代表 Ler的植株 、花 、雄蕊和花药;B, D, F, H:代表突变体 ms1521的植株 、花 、雄蕊和花药.
图 1　野生型与突变体的形态比较
2.2　突变体 ms1521的背景纯化与遗传分析
突变体 ms1521与野生型 Ler回交后 , F1代表型正常 ,植株可育 ,说明该突变体受隐性基因控制.F1
代自交得到的 F2代群体中出现育性分离 ,可育植株 128株 ,不育植株 41株 ,两者比例接近于 3∶1,符合
孟德尔遗传定理 ,可以判断突变体 ms1521是单基因控制的.
2.3　突变体 ms1521的基因定位
用图位克隆的方法对突变体 ms1521进行基因定位 ,首先利用本实验室开发的 20个在拟南芥 5条
染色体中平均分布且在两亲本 LER和 COL有明显多态性的分子标记对突变体进行初定位 ,结果表明
该基因与第一条染色体上的 F5J5分子标记紧密连锁(图 2).
从左至右电泳图的分子标记依次为:F13K23, F5J5, F7A10, NGA111;
1和 2:2个 DNA池分别为模板;L:Ler为模板;C:Col为模板.
图 2　MS1521基因在拟南芥第一条染色体上初定位的电泳图
为了对突变体 ms1521进一步定位 ,利用 Primer5.0软件结合数据库信息 ,设计了一些 In/Del标记
(表 1).
表 1　对突变体 ms1521进行定位所设计的分子标记
分子标记 上游引物序列 (5※ 3) 下游引物序列 (5※ 3)
F26F24 TTGGTTGCTCTAAATCAC TTGCCAATAATAAGAAGG
T5I8 CTTGGATTAGAAGATGAGGA CTTATACATAGTGCTTGACTGA
T17H7-H3 GGGTGGTCATAGACGGCT ACTCTTCATCCCCGCTTC
T17H7-H2 CGGTTTCAACAACTTCCTC GGATACATACCCGATGAAATAC
F17F8SnaB1 ACATAAAACGGATTAGACGC AAAAGCCTGTGTTGTGTGA
F17F8Alu1 GCGTATAATCATGGTGGTGT ATGACGGTTGTGATGGTTG
T19E23 AAACTAGAAACATTAATCACATA TTACCATGTTAAATTCTGCC
T8E3 GGCAAATACCTTCAGACG CAACATGCTTTCCACACA
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MS1521基因定位在拟南芥第一条染色体
分子标记 F17F8Alu1和 T19E23之间
图 3　MS1521基因的定位图
　　在 F5J5分子标记上游设计了分子标记 F26F24,并对 282
株突变体植株进行单株基因连锁分析 ,把基因 MS1521定位于
F26F24和 F5J5之间 5229kb范围内.然后 ,又设计了 T5I8,
T17H7-H3 , T17H7 -H2, F17F8SnaB1, F17F8Alu1, T19E23
和 T8E3七对引物 ,进一步把基因 MS1521的定位区间缩小在
F17F8 Alu1和 T19E23分子标记 161kb的范围(图 3).
3　讨　论
3.1　MS1521基因影响花器官形态建成的分子机理预测
植物花发育根据发生的时间顺序 ,可以分为 4个步骤 [ 17] :
第一步 ,是植物对外界环境和内源信号的感应并做出反应 ,由
营养生长转换为生殖生长 ,这个过程受到一大批开花时间调
控基因的控制;第二步 ,是来自各种开花时间调控途径的信号
的整合 ,激活部分花分生组织同源基因的表达;第三步 ,花分
生组织同源基因在花的不连续区域激活花器官同源基因;第
四步 ,花器官同源基因激活下游器官建成基因 ,这些基因往往
是形成 4轮花器官内部各种不同类型细胞与组织所必需的.
ABC模型中的基因属于花器官同源基因 ,他们受到花分生组
织同源基因的调控 ,如:LEY和 API[ 18, 19] .
根据突变体 ms1521的表型 ,可以得到这样一个推断:MS1521很有可能是一个调控 ABC模型中的 B
类基因的基因.B类基因控制花器官中的花瓣和雄蕊的发育 , MS1521的突变影响 B类基因的功能 ,导致第
二轮和第三轮器官的变异.因此 ,突变体 ms1521的花的花瓣部分缺失 ,雄蕊的花丝变短 ,花药变异.
3.2　ms1521突变体的基因定位和定位区间分析
图位克隆是一种正向遗传学的基因克隆方法 ,主要是通过寻找与目的基因相连锁的分子标记来进
行基因定位 [ 20] .目前 ,把 ms1521突变体定位在 F17F8Alu1和 T19E23这 2个分子标记 161kb的区间内.
根据 TAIR和 GENEVESTIGATOR数据库的信息 ,该区间内含有 44个基因.分析所有基因的数据库信
息 ,发现有 11个基因在花中高效表达 ,与花发育途径中的花分生组织基因和花器官基因有关.其中包括
一个已经被报道过的与花器官形成有关的基因 UFO,但它的突变表型与 ms1521突变体还是存在差异.
因此 , MS1521很有可能是一个新的雄性不育基因.对 MS1521的进一步定位 、克隆和功能分析 ,将为更
好地诠释花器官形态建成奠定一定的基础 ,并为雄性不育提供证据.
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GeneticmappingofanArabidopsisthalianamalesterilegenems1521
ZHOUQue, JIAQi-shi, YANGZhong-nan, ZHANGSen
(ColegeofLifeandEnvironmentSciences, ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234, China)
Abstract:AnArabidopsisthalianamale-sterilemutantms1521 hasbeenisolatedusingenthylmethanesulfonate(EMS)muta-
genesisstrategy.Geneticanalysisindicatedthatthemalesterilephenotypewascontroledbyasinglerecessivegene.Morphologi-
calobservationsindicatedthatinthemutant, petalswerefewerthanthatofthewildtype, stamenswereshorter, antherswerelar-
gerandsomeantherswerefilamentary.Amap-basedcloningapproachwasused, andMS1521wasmappedtoaregionof161kb
betweenthemolecularmarkersF17F8Alu1 andT19E23 onchromosome1.Inthisregionthereare11 genesrelatedwithflower
developmentaspredictedbydatabaseinthenetwork.Furtherstudyonms1521 mutantwillbehelpfultoourunderstandingof
Arabidopsisthalianaflowerdevelopmentandmalereproduction.
Keywords:Arabidopsisthaliana;malesterile;mapping;floralorgandevelopment
(责任编辑:郁　慧)
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