全 文 ：基金项目：本研究由国家高科技发展计划 863项目 (2002AA241111)以及国家自然科学基金主任基金 (30140003)资助。
分子植物育种，2007，第 5卷，第 1期，第 21-26页
Molecular Plant Breeding, 2007, Vol.5, No.1, 21-26
研究报告
Research Report
拟南芥硫氧还蛋白M1型基因(AtTRX m1)与环境逆境之间的关系
夏德习1 管清杰1 金淑梅1 李宇佳1 梁涵1 张欣欣1,2 西内俊策2 高野哲夫2 柳参奎1*
1 东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心抗性分子生物学实验室, 哈尔滨, 150040; 2 东京大学亚洲生物资源环境研究中心, 东京, 1880002, 日本
* 通讯作者, shenkuiliu@nefu.edu.cn
摘 要 硫氧还蛋白家族是约 12 kD的小分子蛋白质，含有高度保守的活性反应位点WCG/PPC，催化硫
醇—二硫键相互交换，调节细胞内的氧化还原作用。在本研究中，通过 RT-PCR法获得目的基因拟南芥硫
氧还蛋白M1型基因 (AtTRX m1, GenBank Accession No. At1g03680)。通过 Northern杂交分析拟南芥悬浮
细胞系在 100 mmol/L NaCl、10 mmol/L NaHCO3、50 μmol/L ABA、10 mmol/L H2O2等逆境处理下 mRNA
表达水平的变化和硫氧还蛋白M1型转基因植株对 NaCl、NaHCO3盐及 ABA逆境的抗性分析，表明硫氧
还蛋白M1型基因与生物环境胁迫有一定的相关性，尤其是氧化胁迫，能够增强植物对逆境的耐受力。从
而为进一步研究硫氧还蛋白基因家族与逆境之间的相关作用奠定了基础。
关键词 拟南芥(哥伦比亚型), 硫氧还蛋白M1型基因, 非生物逆境, 转基因, Northern杂交
The Relationship of Arabidopsis thaliana Thioredoxin M-type 1 (AtTRX m1)
Gene with Environmental Stress
Xia Dexi1 Guan Qingjie1 Jin Shumei1 Li Yujia1 Liang Han1 Zhang Xinxin1,2 Shunsaku Nishiuchi2 Tetsuo
Takano2 Liu Shenkui1*
1 Stress Molecular Biology Laboratory, Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry University, Harbin, 150040; 2 Asian Natural
Environment Science Center (ANESC), The University of Tokyo, Tokyo, 1880002, Japan
* Corresponding author, shenkuiliu@nefu.edu.cn
Abstract Arabidopsis thaliana thioredoxins are about 12 kD small proteins, with a highly conserved and
prominent active site sequence WCG/PPC, that catalyse thiol-disulphide oxido-reduction. In this study, the
full length sequence of Arabidopsis thaliana thioredoxin M-type 1 gene (AtTRX m1, Genbank Accession No.
At1g03680) was cloned using RT-PCR. We analyzed the differentiation of the AtTRX-m1 mRNA expression level in
A. thaliana suspension cell under abiotic stress (100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L NaHCO3, 50 μmol/L ABA, 10 mmol/L
H2O2) by northern blot. We also analyzed the transgenic plants’ tolerance resistance to stress (100 mmol/L NaCl, 5
mmol/L NaHCO3, 50 μmol/L ABA). The research suggest that AtTRX m1 gene can enhance the plants tolerance to
abiotic stress. TRX m1 gene have a relationship with abiotic stress, especially for oxidative stress. This study is a
basis for further research of the relationship between thioredoxin familys with the environment stress.
Keywords Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia), AtTRX m1, Abiotic stress, Transgene, Northern blot
植物在生长过程中要受到各种生物和非生物逆
境影响。植物遭受盐、干旱和低温胁迫时，在初期
阶段会造成植物体离子失衡和渗透紊乱，引发植物
的“生理性干旱”；胁迫的延续或加重还常常会伴
随活性氧 (ROS)的产生和次生性氧化胁迫的发生。
盐碱化是影响植物生长的最重要的环境压力之一，
它严重影响了农作物的产量和生产力 (Greenway and
Munns, 1980; Epstein et al., 1980; Flowers and Yeo,
1995)。大量实验证明转基因植物中 ROS清除因子
的过量表达或具有更高 ROS清除功能的突变体对
环境胁迫具有更强的耐受性 (Bohnert and Sheveva,
1998; Örvar et al., 2000; Bohnert et al., 2001)。随着科
技的发展，利用分子生物学技术来获得抗性基因，
揭示植物与逆境之间的关系，辅助作物育种，将比
22 分子植物育种
Molecular Plant Breeding
单纯用传统方法来改变植物的性状更加快捷、有效。
硫氧还蛋白基因家族是一类小分子量 (约
12 kD)的蛋白质，含有高度保守的活性反应位点
WCG/PPC，催化硫醇—二硫键相互交换 (Holmgren,
1989)。它普遍存在于从原核生物到高等真核生物
的几乎所有生物个体中。在植物中硫氧还蛋白基因
家族尤其复杂，在拟南芥中目前至少有 20种硫氧
还蛋白基因已被确认，包括 4种M型 (AtTRX m1,
AtTRX m2, AtTRX m3, AtTRX m4)，2种 F型 (AtTRX
f1, AtTRX f2)，8 种 H 型 (AtTRX h1 ~ AtTRX h9,
except AtTRX h6)，2 种 O 型 (AtTRX o1, AtTRX
o2) 和 y 型 (trx y1，trx y2) 及 trx x，cdsp32 各 一
种。其中 H型存在于胞质，O型至少是 o1被证实
存在于线粒体，TRX m和 TRX f和 cdsp32，TRX x，
TRX y存在于叶绿体中 (Laloi et al., 2001)。硫氧还
蛋白在生物体内参与了一系列的生理生化反应。除
了还原靶蛋白的二硫键之外，还作为 H+供体参与
对酶的调节 (Holmgren, 1989; Arnér and Holmgren,
2000)，对转录因子进行调控 (Schenk et al., 1994;
Hirota et al., 1999)及在氧化逆境中发挥作用 (Chae
et al., 1994; Kang et al., 1998)。
TRX m 与原核生物有较高同源性，4种 TRX
m虽然表达水平不同，但主要都在植物绿色组织
中 (Mestres-Ortega and Meyer, 1999)。4 种 M 型 硫
氧还蛋白 AtTRX m1，m2，m3和 m4都已经被证
明能有效的激活 NADP-MDH (Collin et al., 2003)。
TRX m在体外能够作为有效的还原剂来调节 NADP-
malatedehydrogenase (MDH)的氧化还原作用，表
明它可能是卡尔文循环和糖新陈代谢中的酶的重
要 调 节 物 (Buchanan, 1980; Jacquot et al., 1997)。
Motohashi等 (2001)的研究表明 TRX m与两种与氧
化压力耐性相关的蛋白相关，推测其在保护体内氧
化压力损伤中发挥作用。Chlamydomonas reinhardtii
悬浮细胞中的 TRX m在重金属如 1 μmol/L HgCl2
或 100 μmol/L CdCl2的处理下表达量增加 (Lemaire
et al., 1999)。Issakidis-Bourguet等 (2001)的研究表
明 TRX m可以提高酵母 (S. cerevisiae)对 H2O2的耐
受性。叶绿体硫氧还蛋白 AtTRX m1、m2、m3和
m4在酵母中的耐受性实验证明 TRX m是一个维
持体内过氧化物酶活性的有效电子供体 (Issakidis-
Bourguet et al., 2001)。TRX 不仅能够与胞质蛋白的
氧化还原功能相关而且能够直接降低体内的 H2O2
(Spector et al., 1988; Kang et al., 1998)。
氧化胁迫是普遍发生在植物对各种生物和非生
物胁迫因子进行胁迫应答过程中的生理现象 (Price
et al., 1989; Quartacci and Navari-Izzo, 1992)。本研
究中，通过转基因技术将 TRX m1基因转入拟南芥
中使其过量表达，并通过在各种逆境下对转基因的
抗性分析，对 TRX m1基因与逆境的应答关系进行
了较系统的研究，从而揭示 AtTRX m1基因对植物
在逆境中的影响。
1 材料与方法
1.1 植物材料与生长条件
拟南芥 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)
种子经 70%酒精消毒数秒，再用 5%次氯酸钠消毒
3~5 min，然后用灭菌水涮洗数次，播种于 1/2 MS
培养基中，22℃，湿度 60%，16 h光照培养。8 d后，
移栽于土、蛭石、珍珠岩按 4:2:1比例混合的培养
土中，用 Hogland营养液每周浇 2次。
拟南芥悬浮细胞 A. thaliana L. (ecotype Columbia)
的培养方法为在含 50 mL JPL培养基的 250 mL悬浮
瓶中，23 ± 1℃，持续光照，强度 40 μmol· m-2· s-1，
130 r/min，pH5.8 培 养 (Jouanneau and Péaud-Lenoël,
1967)。培养 1周后，取 1/10继代培养。
1.2 拟南芥TRX m1型基因的克隆与表达载体的构建
采取幼嫩的植物叶片，利用 Trizol (invitrogen)
一步法提取叶片 mRNA，通过反转录，获得 cDNA
文库，再利用特异引物 (上游引物 5-GGATCCAT
GGCTGCTTACACGTGT-3，下游引物 5-GAGCTC
AGTAGATAGGTAAAAGGT-3) PCR扩增得到 TRX
m1基因，并克隆到 pMD-18T (TaKaRa)载体上。
利用 BamHⅠ，SacⅠ酶切 位点对 pMD-18T-TRX
m1和 pBI121载体进行酶切，连接获得重组质粒
pBI121-TRX m1。然后将其转入其宿主菌 EHA105
(Clontech)中。采用减压浸润法将基因转入开花期
的拟南芥中。
1.3 拟南芥悬浮细胞系的逆境下分析
拟南芥悬浮细胞悬浮细胞培养 1周后，将 3 mL
悬浮培养物加入到 30 mL培养液中继代培养 4 d后，
开始分别用 100 mmol/L NaCl，10 mmol/L NaHCO3，
50 μmol/L ABA，10 mmol/L H2O2进行不同时间梯
度处理。
1.4 拟南芥悬浮细胞RNA提取和Northern blot分析
用异硫氢酸胍法提取悬浮细胞 RNA(萨姆布鲁
23
克和拉塞尔 , 2002)。将 10 μg总 RNA进行甲醛变
性电泳，然后转移到尼龙膜上进行杂交试验分析，
探针合成采用特异引物 (上游引物 5-GGATCCAT
GGCTGCTTACACGTGT-3，下游引物 5-GAGCT
CAGTAGATAGGTAAAAGGT-3)，以 AtTRX m1的
cDNA为模板，用 [α32P] dCTP 标记。杂交，洗膜。
最后用 CDP star 检测试剂为底物， 利用碱性磷酸酶
催化的化学发光显影。
1.5 转基因植株的筛选和鉴定
所得 T0 代种子经含 40 Kana的 1/2 MS培养
基上筛选所得阳性植株，继续培养收其种子。取
继续在 40 Kana筛选的 T2 代苗植物嫩叶，CTAB
法提取植物基因组 DNA，利用 CaMV35S启动子
序列设计上游引物 (5-CCCACAGATGGTTAGA
GAGGCT-3)和 TRX m1基因序列设计下游引物
(5-GAGCTCAGTAGATA GGTAAAAGGT-3)， 进
行 PCR扩增，扩增程序为 94℃预变性 2 min，94℃
变性 30 s，58℃复性 1 min，72℃延伸 90 s，共 30
个循环，最后 72℃延伸 10 min。
1.6 转基因植株的抗性分析
将野生型和转基因 T3代种子同时播种于 1/2
MS培养基中，8 d后将其移入分别添加 100 mmol/L
NaCl，5 mmol/L NaHCO3 及 50 μmol/L ABA 的 1/2
MS培养基中，观察其生长势变化。
2 结果与分析
2.1 转基因植物的鉴定
经 40 Kana抗性筛选的 T2代植株叶片 DNA以
CaMV35S启动子序列设计的上游引物 (5-CCCA
CAGATGGTTAGAGGCT-3) 和 TRX m1 基因序列
设计的下游引物 (5-GAGCTCAGTAGATA GGTAA
AAGGT-3)进行 PCR扩增所得到的结果见图 1。
拟南芥硫氧还蛋白M1型基因 (AtTRX m1)与环境逆境之间的关系
The Relationship of Arabidopsis thaliana Thioredoxin M-type 1 (AtTRX m1) Gene with Environmental Stress
图 1 转 TRX m1基因的 PCR检测
注 : M: 分子量标准 ; 1为阴性对照 ; 2为阳性对照 ; 3~13为样品
Figure 1 PCR results of TRX m1-type gene from transformed Arabidopsis thaliana plants
Note: M: 2 000 bp ladder DNA marker; 1: Negative control; 2: Positive control; 3~13: Transformed plants
2.2 不同逆境下拟南芥悬浮细胞中TRX m1基因表达
特性的研究
为了检测拟南芥 TRX m1基因与逆境胁迫的应
答关系，本研究特别选取 NaCl、NaHCO3、ABA、
H2O2等几种逆境对拟南芥 TRX m1基因在转录水
平上的表达特性进行了研究 (图 2)。结果表明，在
100 mmol/L NaCl 处理下 TRX m1基因表达量明显
降低，中间略有增加但并不明显，在 24 h时又明显
降低。而在 NaHCO3处理下，TRX m1基因表达量
先降低后逐渐增加在 8 h达到最大，接近于处理前
水平，随着处理时间的加长在 16 h又略有降低。在
ABA和 H2O2处理下情况与 NaHCO3处理结果类似。
TRX m1基因在 NaCl与 NaHCO3处理下的表达情况
不同，而在NaHCO3处理下表达量增加比NaCl明显，
说明其不仅与高盐胁迫中的 Na2+有应答关系，且与
HCO3- 引起的高 pH值相关。TRX m1基因在 H2O2
处理下表达量增大，表明其与氧化胁迫相关，作为
ROS系统的一部分，清除过多的自由基，有明显的
抗氧化胁迫能力。TRX m1基因在 ABA处理下表达
量的变化表明其与 ABA有明显的应答关系。ABA
对 AtTRX h5有类似的作用 (Laloi et al., 2004)。越来
24 分子植物育种
Molecular Plant Breeding
越多的证据表明 ABA与植物细胞中的氧化压力的
形成相关。表现在：① 高浓度的 ABA导致细胞氧
化损伤 (Bueno et al., 1998; Jiang and Zhang, 2001)；
② 诱导抗氧化基因的表达和抗氧化防御系统的能力
(Bueno et al., 1998; Guan and Scandalios, 1998; Jiang
and Zhang, 2001; 2002)；③ ROS在有 ABA信号转
导途径引起的抗氧化防御系统中起着重要的媒介作
用 (Guan et al., 2000)；④ ABA能直接引起 ROS的
产生，例如 O2-，H2O2。这可能是 TRX m1基因与
ABA有明显应答性的原因。这表明 TRX m1与氧化
胁迫有特异性的应答关系 (Pei et al., 2000; Murata et
al., 2001; Jiang and Zhang, 2003)。
2.3 转TRX m1基因在拟南芥中过量表达及抗性分析
为了进一步研究 TRX m1基因在逆境胁迫下的作
用，我们利用农杆菌介导的减压浸润法将 TRX m1基
因转入拟南芥中。通过 PCR 鉴定，我们获得了 11
个相互独立遗传的，稳定表达的转基因品系。同时，
在研究分别对这些遗传品系进行了 NaCl，NaHCO3
及 ABA处理。结果如图 3表明，在正常的 1/2 MS
培养基上，野生型与转基因的拟南芥生长状态基本
一致；而在 100 mmol/L NaCl盐逆境下，和 5 mmol/L
NaHCO3盐逆境及 50 µmol/L ABA逆境下，转基因
的植株均好于对照。这说明，TRX m1基因对提高
图 2 不同逆境下，拟南芥悬浮细胞中 TRX m1基因随时间梯度在转录水平上的表达特性
注 : 拟南芥悬浮细胞中 TRX m1基因的 Northern blot分析 ; 拟南芥悬浮细胞在 100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L NaHCO3、 50
µmol/L ABA 和 10 mmol/L H2O2不同逆境下的检测
Figure 2 Expression of TRX m1 transcript after exposure to abiotic stresses for the indicated times
Note: Northern blot analysis of TRX m1 gene in Arabidopsis suspension cells; The Arabidopsis suspension cells was examined under
stress from 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L NaHCO3, 50 µmol/L ABA and 10 mmol/L H2O2
图 3 拟南芥 TRX m1基因的表达提高其对逆境的耐受性
注 : A: 1/2 MS培养基 ; B: 1/2 MS + 100 mmol/L NaCl; C: 1/2 MS + 5 mmol/L NaHCO3; D: 1/2 MS + 50 µmol/L ABA; CK: 野生
型拟南芥 ; AtTRX m1: 转 AtTRX m1基因植株
Figure 3 Expression of AtTRX m1 gene increases tolerance to stress
Note: A: 1/2 MS; B: 1/2 MS + 100 mmol/L NaCl; C: 1/2 MS + 5 mmol/L NaHCO3; D: 1/2 MS + 50 µmol/L ABA; CK: Wide type;
AtTRX m1: Transgenic lines
25
拟南芥在非生物逆境中的抗性有重要的作用。
3 讨论
对于非生物逆境机理的分子调控机制，它是通
过激发及调控特异的与逆境相关的基因来实现的
(Wang et al., 2003)。因此，了解植物的耐性机制，
培育耐盐、耐旱等非生物逆境作物，已成为农业生
产发展的迫切需求。拟南芥是重要的模式植物，通
过对拟南芥的研究可以使我们方便的了解该基因的
特性功能，从而为进一步的研究提供依据。
硫氧还蛋白是一种小分子量、热稳定的酸性蛋
白。它们在多种反应中通过可逆的硫醇—二硫键
相互交换起到氧化还原载体的作用，是重要的酶活
力调节蛋白。硫氧还蛋白同时具有重要的抗逆能力
和基因表达调控功能。为了研究 TRX m1基因与环
境逆境的应答关系，我们选取了几种典型的逆境，
对 TRX m1基因的表达特性进行了研究。结果表
明 TRX m1基因在 NaCl、NaHCO3、ABA、H2O2处
理下都有一定的应答关系，而对 NaHCO3、ABA、
H2O2逆境的胁迫的应答关系又大于 NaCl。TRX m1
对 NaCl、NaHCO3 应答关系的不同说明，不仅是高
浓度的 Na+对植物有影响，而且 HCO3- 引起的高
pH值可能引起的氧化胁迫关系更大。对 H2O2的明
显应答关系，则是其作为 ROS系统组成部分的重
要体现。
为了更进一步的对其与环境逆境的应答关系进
行研究，我们获得了其转基因植株。通过在不同的
逆境下，对转基因拟南芥的生长势的研究表明，在
100 mmol/L NaCl，5 mmol/L NaHCO3 及 50 µmol/L
ABA逆境下，转基因拟南芥的生长势好于野生型对
照。这说明，拟南芥 TRX m1对其在逆境环境中的
生存起着重要的作用。植物中的硫氧还蛋白系统作
为 ROS系统的重要组分，不仅本身具有抗逆胁迫
能力，同时对抗逆基因的表达进行调控，在植物的
抗逆系统中起着重要的作用。然而植物的抗逆机理
涉及到大量基因的参与与互作，而不是由单一基因
独立调控，因此需要进一步通过对基因组，蛋白质
组的整体解析以了解其机理，然而对单个基因的独
立解析将为此奠定坚实的基础。
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