全 文 ：文章编号:1000-1573(2008)02-0011-05
拟南芥种子萌发及幼苗生长对干旱和
NaCl胁迫的响应①
刘海龙 , 　杜　娟 , 　吴立柱 , 　孙敬磊 ,
王冬梅 , 　潘延云
(河北农业大学 生命科学学院 , 河北 保定 071000)
摘要:为获得胁迫因子处理拟南芥的最佳浓度及其生长的临界胁迫浓度 ,以期进一步采用拟南芥基因缺失突变
体 ,以 PEG 模拟干旱胁迫和 NaCl作为盐胁迫因子 ,在室内培养条件下探讨了拟南芥种子萌发 、幼苗生长 、根长
及渗透调节物质丙二醛和脯氨酸含量的变化。结果发现:干旱和高盐胁迫影响种子萌发的半抑制浓度分别为
10%(PEG-6000)和 150 mmol L;幼苗生长的临界值分别为 25%(PEG-6000)和 250 mmol L NaCl。随着干旱
胁迫和 NaCl胁迫程度的增加 ,丙二醛及脯氨酸的含量均明显增加。表明随着胁迫条件的加重 ,拟南芥幼苗质膜
受到氧化性伤害 ,并通过合成脯氨酸等渗透调节物质的机制对胁迫因子产生响应。
关　键　词:拟南芥;NaCl胁迫;干旱胁迫
中图分类号:Q 945 文献标识码:A
Responses of seed germination and seedling growth
of Arabidopsis thaliana to drought and NaCl stress
LIU Hai-long , DU Juan, WULi-zhu ,SUN Jing-de ,
WANG Dong-mei , PANYan-yun
(Co llege of Life Sciences , Agricultural University of Hebei , Baoding 071000 , China)
Abstract:This paper studies the polyethylene glycol(PEG-6000)employed as osmoticum fo r simu-
lating drought and NaCl for salt stress to identify the seed germination and seedling g row th of Ara-
bidopsis.Results show ed that drought st ress o r high salinity retards seed germination of Arabidopsis
in the early stage.The rate of seed germinat ion and seedling grow th decreased significant ly and
semi-inhibi tory concentration w as 10%(PEG-6000)and 150 mmol L.The critical value of seed
grow th w as 25%(PEG-6000)and 250 mmol L NaCl respectively.The contents of malondialde-
hyde (MDA)and proline increased remarkably w ith the increase of PEG or NaCl concentration.
These f indings indicate that the osmo ticum and salt st ress might damage the cell membrane of the
seedling and the plants responded to st ress by compounded proline contents.
Key words:Arabidopsis thaliana;NaCl stress;drought st ress
① 收稿日期:2007-06-24
基金项目:国家基金项目(No.30570993)资助;和河北省科技攻关计划项目(2005111)资助
作者简介:刘海龙(1981-), 男 ,河北唐山人 , 在读硕士生 ,主要从事植物抗逆生理研究.
通讯作者:潘延云(1963-), 女 ,河北保定市人 , 博士 ,副教授 , 硕士生导师 ,从事植物细胞信号转导研究.
E-mail:pyycell@163.com Tel:0312-7528275
第 31卷第 2期
2 0 0 8年 3月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNAL OF AGRICU LT URAL UNIVERSI TY OF HEBEI
　 　 Vol.31 No.2
M ar .2 0 0 8
　　目前 , 水资源短缺以及土壤沙化 、盐渍化已成
为全球性问题。干旱及盐碱化严重影响植物的生长
发育 , 造成树木和农作物减产[ 1] 。据统计 ,我国的
盐碱土地面积达到了 1亿 hm2 。而在我国的现有耕
地中 ,至少有 800万 hm2 的土地由于不当的灌溉和
施肥 ,导致土壤中盐分积累 ,不同程度地影响了作物
的产量 。长期以来 ,人们一直想通过揭示非生物胁
迫的伤害机理 ,寻找提高植物抗胁迫能力的途径 。
大量研究表明 ,植物对干旱及盐胁迫环境的应答反
应涉及了多种基因和复杂的信号途径 ,目前对其作
用的分子机制还了解不够 。盐分水分胁迫对植物最
普遍和最显著的效应是抑制生长[ 1-3] 。本研究以
PEG模拟干旱胁迫和 NaCl作为盐胁迫因子 ,在室
内培养条件下探讨了拟南芥种子萌发 、幼苗生长 、根
长及渗透调节物质丙二醛和脯氨酸含量的变化情
况 ,旨在获得胁迫因子处理拟南芥的最佳浓度及其
生长的临界胁迫浓度 ,以期为进一步采用拟南芥基
因缺失突变体为材料 ,用反向遗传学的方法深入研
究参与植物盐胁迫反应的基因的功能及作用机制奠
定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia 生态型
1.2　材料处理
1.2.1　干旱胁迫　拟南芥种子经无菌水润洗后用
10%次氯酸钠深层消毒 10 min ,无菌水洗 4次 ,4℃
暗中春化 3 d ,转到光照培养箱(22℃, 16 h 8 h光暗
周期 ,光照强度 6 000 ～ 8 000 lx)中培养 。(参照文
献[ 4] ,有改动)用滤纸按培养皿直径裁剪 ,平铺到培
养皿中高温蒸气灭菌(121℃, 20 min)。将经过高温
消毒后的 0 , 5%, 10%, 15%,20%, 25%PEG-6000
(国产)水溶液 ,各吸取 2 mL 分别悬浮在上述培养
皿中 ,将消毒并经春化的拟南芥种子 400粒点播于
滤纸上 , 封口 , 然后放到培养室(22℃, 光照强度
6 000 ～ 8 000 lx , 16 h 8 h 光暗周期 , 相对湿度
70%)培养 ,每个处理 3 个重复 ,每天观察萌发及其
他表型 ,统计相关数据。
1.2.2　盐胁迫　(参照文献[ 5] ,有改动)配制好的
MS培养基(3%蔗糖 , 1%琼脂粉 ,1×Murashige and
Skoog 盐和维生素 ,pH 用 KOH 调至 5.8)在灭菌之
前分别将 NaCl添加进去 ,使得 NaCl终浓度分别为
0 , 50 , 100 , 150 , 200 , 250 mmol L ,高压蒸汽灭菌
(121℃,20 min)后分装到培养皿中 。培养基凝固后
用 2 mL 无菌水悬浮种子转入培养基上 ,待种子均
匀播种后除去多余无菌水 ,打开皿盖 , 用无菌风吹
1 h至表面干燥 ,封口 ,然后放到培养室(22℃,光照
强度 6 000 ～ 8 000 lx ,16 h 8 h 光暗周期 ,相对湿度
70%)培养 ,每个处理 3个重复 ,每天观察萌发及其
他表型 ,统计萌发数 ,存活率 ,测量根长试验复3次 ,
取其平均值。对取得的数据做差异显著性分析
(SSR测验)。
1.2.3　胁迫条件下拟南芥渗透调节物质的检测　
分别取盐胁迫和 PEG处理的拟南芥幼苗 ,检测其丙
二醛和脯氨酸的含量。丙二醛含量测定采用硫代巴
比妥酸法[ 7] 。脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮
法[ 8] 。
2　结果与分析
2.1　干旱与盐胁迫下的种子萌发
干旱与盐胁迫对拟南芥种子的萌发都有抑制作
用 ,且具有浓度依赖性(图 1 、2)。正常条件下 ,拟南
芥在无菌水中 6 d时萌发率可以达到 90%以上 ,在
MS 培养基中播种后第 2天即可萌发 90%以上 。用
PEG模拟的干旱条件 , 5%浓度时 ,对种子萌发基本
没有影响;25%时种子全部不能萌发 ,所以 25%的
PEG浓度是种子萌发的临界值 ,该浓度的 PEG 相
当于-0.8 MPa 的水势[ 9] ;10%～ 15%PEG 浓度 ,
使得种子的萌发率在 50%～ 60%之间 ,适合于做不
同材料样本处理的浓度(图 1)。用不同盐浓度的
MS培养基模拟的盐胁迫条件下 ,50 ～ 200 mmol L
的 NaCl虽然使得拟南芥种子萌发有不同程度的延
迟 ,但最终也都能获得 90%以上的萌发率 , 250
mmol L 的盐胁迫条件对种子萌发有较大的影响 ,所
以 200 mmol L 的 NaCl是种子萌发的临界值 ,而检
测不同材料样本的种子萌发情况时 , 宜采用 150
mmol L的 NaCl平板 ,统计萌发 3 ～ 5 d时的萌发率
(图 2)。
图 1　不同浓度 PEG对拟南芥种子萌发率影响
Fig.1　Effect of different PEG concentrations on seed
germination of Arabidopsis Columbia ecotypa
12　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 31卷
图 2　不同浓度 NaCl对拟南芥种子萌发率影响
Fig.2　Effect of different NaCl concentrations on seed
　　germination of Arabidopsis Columbia ecotype
2.2　干旱与盐胁迫下的存活率
在不同浓度的干旱与盐胁迫条件中 ,并不是所
有萌发的种子都可以正常存活 ,其中部分萌发的种
子长出子叶后就逐渐萎缩 ,不能进一步生长真叶。
我们将能够生长出真叶的幼苗作为能够存活的依
据 ,统计之后发现 ,即使在无菌水中 ,拟南芥也能够
生长出真叶 ,而不同浓度的 PEG对幼苗的存活有一
定的影响 ,其中在 10 mmol L 的 PEG 中 ,幼苗存活
率为对照的 40%(表 1);盐胁迫培养皿中 ,浓度超过
150 mmol L NaCl的培养基中 ,拟南芥种子萌发出
现子叶后 ,随着时间的延长 ,最终均陆续死亡 , 50
mmol L 的 NaCl浓度下 ,拟南芥幼苗的存活率为对
照组的 97%,100 mmol L的培养基中的幼苗存活率
为对照的 53%(表 1)。故检测拟南芥不同样本在干
旱及盐胁迫环境中的存活情况时 , PEG 宜取 10
mmol L 的浓度 ,而 NaCl宜取 100 mmol L 的浓度。
表 1　PEG或 NaCl对拟南芥幼苗存活率的影响
Table 1　Effect of PEG or NaCl on seedling livability of Arabidopsis
PEG 浓度 %
PEG
concentra tion
幼苗存活率 %
Seedling
livability
差异显著性
Significance
analysis
5% 1%
NaCl浓度
(mmol·L-1)
NaCl
concentration
幼苗存活率 %
Seedling livability
差异显著性
Significance
analysis
5% 1%
0 85.24 a A 0 84.09 a A
5 52.24 b B 50 82.64 b A
10 33.60 c C 100 45.90 c B
15 12.93 d D 150 0 d C
20 0.74 e E 200 0 d C
25 0 e E 250 0 d C
　　＊为 3次试验的平均值.
2.3　干旱与盐下的主根长度
种子萌发到第 10天 ,统计不同平板上的存活幼
苗并测量根长度。在 5%PEG 胁迫条件下 ,拟南芥
幼苗的主根长度要比对照组长 9%, 而在 10%和
15%PEG胁迫条件下 ,幼苗的主根长度呈现出比对
照组缩短的趋势 ,但差异不明显(表 2);而在盐胁迫
环境中 ,随着 NaCl浓度的增加 ,拟南芥幼苗的主根
的生长速率明显降低(表 2),所以在以根长做为拟
南芥非生物胁迫应答反应指标时 ,宜采用的 NaCl
做为胁迫因素 ,且其终浓度控制在 100 mmol L 为
宜 。
表 2　PEG或 NaCl对拟南芥十天龄幼苗主根长度的影响
Table 2　Effect of PEG or NaCl on root length of Arabidopsis
PEG 浓度 %
PEG concentra tion
主根长度 cm
Roo t length
差异显著性
Significance
analysis
5% 1%
NaCl浓度
(mmol·L-1)
Nacl
concentration
主根长度 cm
Roo t length
差异显著性
Significance
analysis
5% 1%
0 4.69 ab AB
5 5.15 a A 0 2.32 a A
10 4.43 b AB 50 1.89 a A
15 4.05 b B 100 1.23 b B
　　＊为 3次试验的平均值.
2.4　脯氨酸含量的变化
以存活的幼苗为材料 ,分别测定了不同胁迫条
件下脯氨酸含量的变化情况 。结果显示 , 在 5%
PEG中生长的拟南芥 ,脯氨酸含量就有了明显的升
高(表 3), 100 mmol L NaCl胁迫也大大促进了拟南
芥中脯氨酸的合成(表 3),说明在这两个条件下 ,拟
13　第 2期　　　 刘海龙等:拟南芥种子萌发及幼苗生长对干旱和 NaCl胁迫的响应
南芥开始大量合成脯氨酸来抵御胁迫刺激。
表 3　PEG或 NaCl对拟南芥幼苗脯氨酸含量的影响
Table 3　Effect of PEG or NaCl on proline content of Arabidopsis
PEG 浓度 %
PEG concentra tion
脯氨酸
(μg·g-1FW)
P ro
差异显著性
Significance
analysis
5% 1%
NaCl浓度
(mmol·L-1)
Nacl
concentration
脯氨酸
(μg·g-1FW)
P ro
差异显著性
Significance
analysis
5% 1%
0 1.25 c C 0 0.48 c C
5 3.85 b B 50 0.80 b B
10 4.09 b B 100 2.57 a A
15 4.59 a A
　　＊为 3次试验的平均值.
2.5　丙二醛含量的变化
对上述材料分别测定丙二醛含量的情况 ,发现
无论是用 PEG 处理的拟南芥幼苗还是 NaCl 处理
的 ,丙二醛含量都随着胁迫因子浓度的上升呈现出
递增趋势(表 4),但同在生长半抑制浓度下 ,干旱引
起丙二醛含量较对照增加了一倍 ,而盐胁迫刺激使
幼苗丙二醛含量上升了 47%。暗示干旱对膜结构
的伤害更为严重。
表 4　PEG或 NaCl对拟南芥幼苗丙二醛含量的影响
Table 4　Effect of PEG or NaCl on MDA content of Arabidopsis
PEG 浓度 %
PEG concentra tion
丙二醛
(μmol·g-1FW)
MDA
差异显著性
Significance
analysis
5% 1%
NaCl浓度
(mmol·L-1)
Nacl
concentration
丙二醛
(μmol·g-1FW)
M DA
差异显著性
Significance
analysis
5% 1%
0 0.89 c B 0 0.79 b B
5 1.33 b A 50 0.92 b A
10 1.40 b A 100 1.12 a A
15 1.66 a A
　　＊为 3次试验的平均值.
3　讨论与结论
旱害是指土壤水分缺乏造成水势降低而对植物
造成的伤害 。实验室可以采用 PEG 、甘露醇 、蔗糖
等溶液模拟干旱条件 。Hohl[ 9]等对上述胁迫剂研究
的多项结果都支持用 PEG作为渗透剂 ,研究植物的
水分关系。分子量 6 000 的 PEG 比分子量较低的
PEG ,如 PEG-1000 、2000 等的效果更好 ,可能是因
为 PEG-6000的分子量较大 ,不会进入植物细胞造
成伤害。蔗糖溶液易诱发霉菌 ,一般不用作渗透剂 。
盐碱土的盐类通常为 NaCl 、Na2 SO 4 、Na2 CO 3 和
NaHCO 3等 ,盐胁迫除了也能造成水势降低外还有
Na
+升高造成的离子胁迫 , 影响了植物对 K +和
Ca
2+等营养的吸收 ,从而对植物造成伤害[ 10] 。因
此 ,本实验采用 PEG-6000和 NaCl模拟干旱和盐胁
迫条件。
植物体在遭遇盐胁迫和渗透胁迫时 ,在许多反
应上 有 差异 。 Bajji[ 11] 等 用 29% PEG-6000 和
300 mmol L NaCl(约-1.5 MPa)胁迫玉米幼苗时
发现幼苗鲜重显著降低 ,PEG 处理的降低程度大于
NaCl处理。李海云[ 12] 等研究盐生植物滨藜(Atri-
plex isatidea)、碱蓬(Suaeda salsa)、海蓬子(Salico-
mia eucopca)、补血草(Limonium bicolor)种子萌发
的抑制因子时发现 ,虽然 NaCl 和等水势的 PEG-
6000都对种子萌发有抑制作用 ,但 PEG-6000的抑
制作用大于 NaCl。许兴[ 13] 等报道 NaCl胁迫下的
小麦根和叶中游离脯氨酸含增加均大于等渗 PEG
处理 ,这些结果暗示了干旱胁迫和盐胁迫对植物造
成伤害时有不同的机制 。本试验得到了相似的结
果 ,同样是幼苗存活的半抑制浓度 ,10%的 PEG 使
幼苗中丙二醛的含量增加了 1 倍 、脯氨酸含量增加
了 2倍 ,而 100 mmol L NaCl使幼苗丙二醛含量增
加了 47%、脯氨酸含量增加了 5倍 ,说明干旱引起
的膜脂过氧化程度更高 ,二者对膜结构的破坏程度
是不一样的 ,同时拟南芥幼苗通过合成更多的脯氨
酸来调节由盐引起渗透势的变化 。干旱和盐胁迫破
坏植物生长的不同机制还体现在对植物生长表型的
影响上 ,如 PEG 和 NaCl胁迫处理均影响了种子萌
发和幼苗的生长 ,但对主根生长的抑制却明显不同 ,
NaCl胁迫对主根长度的抑制作用显著强于 PEG胁
迫 。
14　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 31卷
本研究还考察了不同胁迫对拟南芥种子萌发和
生长产生完全抑制的临界值 ,该数据对进一步研究
拟南芥突变体的耐盐性有所帮助。张依章[ 4] 等以
25%PEG胁迫下种子是否萌发为指标 ,筛选出 78
株对水分胁迫不敏感突变体;杜伟[ 14] 等报道用 200
mmol L 的 NaCl胁迫筛选经化学诱导激活标签系统
转化得到的拟南芥突变体库获得一株高盐耐受突变
体 ,并将其命名为 hst1突变体。胁迫因子的全抑制
和半抑制浓度以及半抑制浓度下拟南芥不同的表型
及脯氨酸 、丙二醛等物质含量的变化 ,均将为进一步
研究拟南芥盐胁迫应答反应的调节因素提供试验依
据。
利用模式植物拟南芥进行的植物对非生物胁迫
的研究早已开始 ,多项研究结果揭示了植物在盐胁
迫条件下的信号传导途径是一个复杂的过程 ,至今
还没有搞清它的确切机制 。近年来研究较为清楚的
几条信号转导途径为 SOS 信号途径 、MAPK信号途
径及 ABA 信号途径等。除此之外还有很多因素与
植物耐盐反应相关 ,如 Ca2+ 、钙调素 、蛋白激酶和磷
酸酶 、CDPK 信号途径及磷脂信号系统中的磷脂酶
A2(PLA2)、磷脂酶 C(PLC)和磷脂酶 D(PLD)等 ,
这些因素在植物产生的盐胁迫应答反应中所起的作
用还有待一一澄清[ 15-18] 。所以 ,研究野生型拟南芥
在不同胁迫条件下的生理反应 ,是进一步利用反向
遗传学研究目的基因在植物盐胁迫反应中的作用和
功能的基础。目的基因调节植物盐胁迫反应存在着
上调或下调两种方式 ,所以通过试验获取导致 50%
的植物生长表型发生变化的胁迫因子浓度的数据 ,
可以进一步以该浓度的胁迫环境去检测目的基因突
变体的表型变化 ,以便对目的基因的作用做出初步
的分析。
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(编辑:梁　虹)
15　第 2期　　　 刘海龙等:拟南芥种子萌发及幼苗生长对干旱和 NaCl胁迫的响应