全 文 ：第 39 卷　第 8 期
2011 年 8 月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of No rthwest A&F Univer sity(Nat.Sci.Ed.) Vo l.39 No.8Aug.2011
DOI:CNKI:61-1390/ S.20110711.1715.002 网络出版时间:2011-07-11　17:15:00
网络出版地址:http://w ww .cnki.net/ kcms/detail/ 61.1390.S.20110711.1715.002.html
人成纤维细胞生长因子-21的拟南芥
油体表达系统构建＊
付宏岐1a ,b , 2 ,李海燕1a , c ,庞实锋3 ,杨　晶1a ,薛　萍1a , c ,刘秀明1a ,
王艳芳1a , b ,李　营4 ,李洪志5 ,李校堃1a
(1吉林农业大学 a 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心 , b 中药材学院 , c 生命科学学院 ,吉林 长春 130118;
2 渭南职业技术学院 ,陕西 渭南 714000;3 广东医学院生物教研室 ,广东 东莞 523808;
4 吉林市农业科学院 ,吉林 吉林 132101;5 牡丹江医学院医药研究中心 ,黑龙江牡丹江 157011)
[ 摘　要] 　【目的】利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)油体系统表达人成纤维细胞生长因子-21(F ibroblast
gr ow th facto r-21 , FGF21), 为利用植物油体表达系统规模化生产 FGF21 奠定基础。【方法】以磷酸甘露糖异构酶
(PM I)基因作为转基因植物的安全筛选标记 ,将带有组氨酸标签的人源 FGF21 基因与大豆油体蛋白基因融合 ,克隆
至大豆油 体蛋白启动子驱 动的表达载体 pCAM BIA1390MDo(p1390MDo)上 , 构建植物双 元表达载 体
p1390MDoFGF21。采用冻融法将植物双元表达载体 p1390MDoFGF21 转入农杆菌 GV3101 , 花粉管导入法转化拟南
芥 ,采用 PCR检测 、Southern blo t筛选转基因拟南芥阳性植株(T 0), 并对 FGF21 蛋白在转基因拟南芥种子(T 1)中的
表达进行Western blo t 分析。【结果】成功构建了带 PMI 安全筛选标记的植物双元表达载体 p1390M DoFGF21。
PCR扩增和 Southern blo t分析结果表明 , 重组 FGF21融合基因以单拷贝和多拷贝 2 种方式已整合到转基因拟南芥
基因组中。 BandScand 5.0 软件和Western blo t分析结果显示 , FGF21 融合蛋白约占转基因拟南芥种子可溶性蛋白
的 3.76%,并具有良好的免疫原性。【结论】FGF21 融合基因已经转入拟南芥中 ,并在以 PMI 为选择标记的转基因
拟南芥种子中成功高效表达。
[ 关键词] 　拟南芥;成纤维细胞生长因子-21;油体表达;磷酸甘露糖异构酶
[ 中图分类号] 　Q782 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2011)08-0190-07
Establishment of an Arabidopsis thaliana oil body-based expression
system of human fibroblast growth factor 21
FU Hong-qi1a ,b ,2 , LI Hai-yan1a , c , PANG Shi-feng3 ,
YANG Jing1a , XUE Ping1a , c , LIU Xiu-ming1a ,WANG Yan-fang1a ,b ,
LI Ying4 , LI Hong-zhi5 , LI Xiao-kun1a
(1 a Ministr y o f E ducat ion Eng ineering Research Cen ter o f B ioreactor and P harmaceutica l Develo pment ,
b Col leg e o f Trad it ional Ch inese Medicine , c Col lege o f Li fe S ciences , J i lin A gr icu ltura l Un iver sity , Chang chun , J i lin 130118 , Ch ina;
2 Weinan Vocationa l &Techn ica l Co llege ,Weinan , Shaan xi 714000 , China;3 Depar tment o f B iolog y , Guangdong Med ica l Col leg e ,
Dongguan , Guangdong 523808 , China;4 Academy o f Ag ricu ltural S ciences , J i lin , Ji l in 132101 , China;
5 Med icine and Pharmacon Research Center ,Mudanj iang Med ica l Un iver sity ,Mudanj iang , Hei lon g j iang 157011 , Ch ina)
＊ [ 收稿日期] 　2011-01-17
[ 基金项目] 　国家“ 863”高技术研究发展计划项目生物反应器重大专项(2007AA100503);吉林省科技发展计划重点项目
(20070922);教育部高等学校科技创新工程重大项目(70S018)
[ 作者简介] 　付宏岐(1972-),男 ,陕西岐山人 ,讲师 ,博士 ,主要从事药用植物生物转化和植物生物反应器研究。
E-m ail:hqfu@163.com
[ 通信作者] 　李校堃(1964-),男 ,吉林长春人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事基因工程制药研究。 E-mail:xiaokunli@163.n et
DOI :10.13207/j.cnki.jnwafu.2011.08.002
Abstract:【Objective】The research w as done to invest igate the expression of human f ibroblast grow th
facto r 21(FGF21)in Arabidopsis thal iana oil body sy stem.【Method】Phosphomannose isomerase gene
(PMI)was used as a select ion marker fo r t ransgenic plants;the plant expression vecto r p1390MDoFGF21
w as obtained by cloning FGF21 gene into the soybean oleosin promote r-driven pCAMBIA1390MDo
(p1390MDo)vector ,which contained the sequence encoding the human FGF21 gene fused w ith oleosin and
a histidine tag.After p1390MDoFGF21 was t ransferred into Agrobacterium tume f aciens strain GV3101 ,
then hFGF21 gene w as int roduced into cultivated A.thaliana via Agrobacterium-mediated f low er infection
method.The po sitive t ransgenic A.thal iana plants w ere determind by PCR , Southern blot , and Western
blo t analy sis.【Resul t】The plant binary expression vector p1390MDoFGF21 that ca rries PMI selection
marke r w as successfully const ructed.Subsequent PCR and Southe rn blot analy ses confirmed that FGF21
gene w as integ rated into the genome o f A.thal iana plant.SDS-PAGE and Western blo t analy sis showed
transgenic A.thaliana plant seeds had posit ive expression of FGF21 pro tein and good antigenicity.Elect ro-
phoresis st rips w ere analy zed by BandScand 5.0 so f tw are and the FGF21 fusion pro tein accumulated in
t ransgenic A.thaliana plant seeds w as estimated to be appro ximately 3.76% of the to tal soluble pro tein.
【Conclusion】The FGF21 fusion protein w as successfully expressed in t ransgenic A.thaliana plant seeds at
relatively high levels using PMI as a selectable marker.
Key words:Arabidopsis thaliana;FGF21;oil body ;pho sphomannose-i some rase (PM I)
　　近年来 ,随着植物基因工程技术的不断发展 ,用
植物表达系统生产药用蛋白日益受到人们的重视 ,
但是由于植物自身组织成分复杂 ,使得重组蛋白下
游分离纯化成本大大提高 。而植物油体表达系统利
用油体亲脂疏水的特性 ,将转基因种子经“粉碎-液
体抽提-离心”处理后 ,回收上层油相即可将融合蛋
白与细胞内其他蛋白组分分开[ 1-2] ,因此植物油体表
达系统已成为现阶段植物生物反应器研究的热点之
一。Lee等[ 3] 利用玉米油体蛋白基因启动子和油菜
种子贮藏蛋白(napin)基因启动子 ,在油菜中表达玉
米油体蛋白 ,获得了大约 1%的玉米油体蛋白 ,而且
其中 90%以上都定位于油菜油体中。 van Rooijen
等[ 4]在油菜种子中表达了 Oleo sin-GUS 融合基因。
贾士荣等[ 5] 利用植物油体表达载体成功表达了 Ole-
o sin-msCT 融合蛋白 ,其生物活性远远高于天然鲑
鱼降钙素和人降钙素。Nykifo ruk 等[ 2] 利用菜豆蛋
白启动子在拟南芥中表达了具有生物活性的重组人
胰岛素 ,并且产量很高 。刘宇[ 6] 利用拟南芥油体系
统表达了重组人胰岛素。赵宏[ 7] 利用人工油体和植
物油体在油菜中表达了人表皮细胞生长因子 hEGF
(Human epidermal g row th facto r)。最近加拿大
SemBioSys公司在红花种子油体中表达了可以治疗
糖尿病的胰岛素(其表达量占种子总蛋白的1.15%,
2009年已完成 Ⅲ期临床试验),以及治疗心血管疾
病的载脂蛋白 AI 和硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原
酶[ 8-11] 。此外 ,考虑到转基因产品的安全性问题 ,以
磷酸甘露糖异构酶(Phosphomanno se-isomerase ,
PM I)基因为安全筛选标记在转基因植物中的应用
也越来越多 ,如玉米[ 12] 、番茄[ 13] 、水稻[ 14] 、苹果[ 15] 、
小麦[ 16] 等植物。
成纤维细胞生长因子-21(Fibroblast grow th
facto r-21 ,FGF21)是 FGF 家族的一个新成员 ,其在
肝脏中有特异性表达 ,脂肪组织可能是其作用的靶
点[ 17-19] 。一些动物试验表明 , FGF21可以不依赖胰
岛素调节血糖[ 17] ,能改善 2型糖尿病患者的胰岛素
抵抗 ,大剂量用药也不会导致低血糖和水肿 ,对一些
组织细胞的脂类代谢也有调节作用[ 18] 。因此 ,
FGF21 有很大潜力成为治疗 2 型糖尿病等代谢性
疾病的新型药物。然而传统的生产技术 ,如大肠杆
菌表达的 FGF21蛋白在胞内易形成包涵体 ,产量和
活性都不理想[ 4] 。为了满足对 FGF21不断增长的
需求 ,本研究构建了含 PMI 基因和 FGF 21基因的
双 T-DNA植物油体表达载体p1390MDoFGF21 ,探
索利用油体表达系统在拟南芥种子中表达重组人
FGF21 ,并对其生物学活性进行研究 ,以期为进一步
研究利用油料作物红花 、大豆等生物反应器规模化
生产人重组药物蛋白 FGF21奠定基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
Columbia生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana)
种 子 、质 粒 pCAMBIA1390Do (以 下 简 写 为
191第 8 期 付宏岐 ,等:人成纤维细胞生长因子-21 的拟南芥油体表达系统构建
“p1390Do”)、pUC19-FGF21 、农杆菌 GV3101 、大肠杆
菌DH5α,均由吉林农业大学生物反应器与药物研发
教育部工程研究中心保存。质粒 pM390(克隆有
PMI 基因)由东北师范大学遗传与细胞研究所王兴
智教授惠赠 。各种限制性内切酶 、Pyrobest DNA pol-
ymerase 、T4 DNA连接酶 、凝胶回收试剂盒 、质粒提取
试剂盒等 ,均购自 TaKaRa 公司;植物快速基因组提
取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司;DIG
High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit
购自 Roche 公司;Western Blotting Luminol Reagent
sc-2048 Trial kit购自美国 Santa Cruz公司。
1.2　重组质粒 p1390MDo 的构建
p1390Do 质粒是以 pCAMBIA1390 为蓝图 ,在
pCAMBIA1390 上插 入大 豆油体 蛋白启 动子
(DDprm)和大豆油体蛋白基因(DDoil)。为了用
PMI 替换 p1390Do 质粒中的潮霉素(hyg romycin)
抗性基因(hpt Ⅱ构建而成),根据 GenBank (acces-
sion M 15380)中 PMI 的序列设计 1 对特异
性引物。引物序列为:PMIP1 ,5′-GGC CTCGAGCA
TGCAAAAACTCA TTAACT-3′;PMIP2 ,5′-GGC-
CTCGAGCTCTTACAGCT TGT TG TAAAC-3′,并
在上 、下游引物的 5′端引入核酸限制性内切酶
XhoⅠ的识别位点(下划线处),扩增片段大小约 1.2
kb 。扩增体系:以质粒 pM 390为模板 ,10×buffer 5
μL , dN TP 4 μL (2.5 mmo l/L),上 、下游引物各 1
μL(10 μmol/ L), Py robest DNA polymerase 0.25
μL (10 U/μL),加水至 50 μL 。扩增条件:94 ℃变
性 5 min;94 ℃35 s , 58 ℃90 s , 72 ℃35 s , 28个循
环;72 ℃3 min。扩增产物用 10 g/L 琼脂糖凝胶电
泳检测 ,在紫外灯下用凝胶回收试剂盒纯化回收
PMI 目的片段 ,用XhoⅠ单酶切 ,得到约 1.2 kb的
PMI 小片段;将 p1390Do 质粒用 Xho Ⅰ酶切 ,用
PCR纯化回收试剂盒回收目的载体大片段 ,将其与
PMI 小片段用 T4 DNA连接酶连接 ,转化大肠杆菌
感受态 DH5α,通过菌落 PCR筛选阳性克隆菌 ,用
Xho Ⅰ 酶切检测 PMI 基因是否已连接重组到
p1390Do 中 ,将阳性克隆送上海生工生物工程技术
服务有限公司测序 ,得到正向连接的中间表达载体 ,
将其命名为 p1390MDo 。
1.3　FGF21基因的 PCR扩增
为了便于目的蛋白分离纯化 ,在 FGF21上游引
物 F21P1 5′端引入 EcoR Ⅰ和保护碱基以及 6个组
氨酸(His)标签序列 , 则 F21P1 的序列为:5′-
GGGG TACCA TGCACCACCACCACCACCAC-3′,
下划线为 EcoR Ⅰ酶切位点;在 FGF21 下游引物
F21P2 5′端引入 Bgl Ⅱ酶切位点和保护碱基 , 则
F21P2 序列为 5′-GAAGA TCT TTA AGAAGCG-
TAAGATGGAGACCT TCCT TGAGAAG-3′, 下划
线为 Bgl Ⅱ酶切位点 。扩增体系:以质粒 pUC19-
FGF21为模板 ,10× buffer 5 μL , dN TP 4 μL (2.5
mmo l/L),上 、下游引物各 1 μL(10 μmo l/L), Py-
robest DNA po lymerase 0.25 μL (10 U/μL),加水
至 50 μL。扩增条件:94 ℃变性 5 min;94 ℃ 35 s ,
60 ℃35 s ,72 ℃ 35 s , 28个循环;72 ℃ 3 min。用
10 g/ L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 ,用凝胶回收
试剂盒纯化回收 FGF21目的片段 。
1.4　植物双元表达载达的构建
将重组质粒 p1390MDo 和 FGF21基因片段分
别用 EcoRⅠ和 Bg l Ⅱ进行双酶切 ,用 PCR纯化回
收试剂盒分别回收目的片段 ,连接 、转化大肠杆菌感
受态 DH5α,通过菌落 PCR筛选阳性克隆菌 ,将其
命名为 p1390MDoFGF21 ,并用 EcoRⅠ和 Bg lⅡ双
酶切对其进行鉴定 ,将阳性克隆送上海生工生物工
程技术服务有限公司测序 。采用冻融法将测序正确
的植物双元表达载体 p1390MDoFGF21转化到农杆
菌GV3101中。
1.5　拟南芥甘露糖选择压的筛选
根据文献[ 20]优化配置 ,将甘露糖设 5个质量
浓度梯度(0 , 360 , 540 ,720 , 900 mg/L),每个梯度 3
个重复 。拟南芥种子经无菌处理后 ,播种于加有不
同质量浓度甘露糖的 1/2 MS 培养基上 , 10 ～ 14 d
后观察种子萌发和幼苗生长情况 ,最终确定适合的
甘露糖质量浓度 。
1.6　拟南芥的转化
于超净工作台上 ,将转基因拟南芥种子用体积
分数 70%乙醇消毒 30 s ,10%次氯酸钠消毒 10 min
后 ,无菌水冲洗 3遍 ,然后播种于 1/2 MS 固体培养
基中 , 4 ℃春化处理 3 d 。然后播种于装满蛙石的培
养钵中 ,置于相对湿度为 70 %、温度 22 ℃、16 h光
照/8 h黑暗条件下培养。待拟南芥长出 2 ～ 3片真
叶时 ,移栽到基质(V(蛭石)∶V(营养土)=1∶1)中
继续培养。在花后 1周 ,采用花粉管导入法[ 21] 进行
农杆菌介导的拟南芥转化 ,将通过甘露糖平板初步
筛选出的转基因植株移栽到基质中培养 ,并提取叶
片总 DNA ,用油体正向引物 DDoi lP1和 FGF 21基
因反向引物 FGF21P2进行 PCR检测 。
1.7　转基因拟南芥的 Southern blot分析
用 CTAB 法[ 22] 提取经 PCR 检测呈阳性的转
192 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 39 卷
FGF21基因拟南芥植株的总 DNA ,用限制性内切
酶 Bg l Ⅱ酶切 40 μg 的总 DNA ,经 8 g/L 琼脂糖凝
胶电泳分离后 ,用碱变性方法[ 22] 处理凝胶 ,利用毛
细管法将酶切片段由凝胶转移到固相硝酸纤维素膜
上 ,用地高辛标记的 FGF21 基因片段作为探针 ,按
照地高辛检测试剂盒说明书进行 Southern blot 。
1.8　转基因拟南芥种子总蛋白的提取及 Western
blot分析
取转基因拟南芥与非转基因拟南芥(对照)种子
各 100粒 ,于液氮中迅速研磨 ,按 1∶3(m/V)加入
粗蛋白提取 缓冲液 (50 mo l/L T ris-HCl , pH
8.0)[ 6] ,4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min ,收取中间
上清 ,经 SDS-PAGE 电泳 ,电转印至 PVDF 膜 ,依次
加入 FGF21 的单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的
IgG抗体 ,用Western blot 发光试剂盒检测免疫反
应条带 ,并用 BandScand 5.0软件对 SDS-PAG E凝
胶图像进行灰度分析 ,以估计 FGF21融合蛋白的表
达量。
2　结果与分析
2.1　含 PMI 安全筛选标记基因植物中间表达载体
的构建
以 PM IP1和 PM IP2为引物 、质粒 pM 390 为模
板的 PCR扩增产物 ,经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检
测 ,结果显示 ,在约 1 200 bp 处出现 1条特异条带 ,
与报道基因 PMI 的大小一致(图 1)。
将 XhoⅠ酶切回收的 PMI 基因定向插入到质
粒p1390Do 中 ,获得了重组质粒p1390MDo ,将其用
XhoⅠ酶切得到约 1 200 bp的 PMI 基因小片段和
载体大片段(图 2),说明目的基因 PMI 已经正确插
入到质粒 p1390Do 的 Xho Ⅰ位点 ,序列分析结果证
实 PMI 基因已正向重组到质粒 p1390Do 中 。
图 1　PMI 全长基因的检测结果
M.DL2000 DNA Marker;1.PMI 全长基因
Fig.1　PCR amplifica tion of PMI gene
M .DL2000 DNA Marker;1.Fu ll leng th of PMI gene
图 2　重组质粒 p1390M Do的 X ho Ⅰ单酶切鉴定结果
M.DL2000 DNA Marker;1.X ho Ⅰ单酶切的 p1390MDo 重组质粒
Fig.2　Restriction dig estion ana ly sis o f recombinant
plasmid p1390MDo by X ho Ⅰ
M.DL2000 DNA M ark er;1.p1390MDo digested by X ho Ⅰ
2.2　含 FGF21基因植物双元表达载体的构建
将FGF21基因定向插入到植物中间表达载体
p1390MDo ,获得重组质粒 p1390MDoFGF21。经 PCR
鉴定(图 3)以及 EcoRⅠ和Bgl Ⅱ双酶切鉴定(图 4),均
得到了 589 bp的目的基因小片段和载体大片段 ,说
明目的基因 FGF21已经正确插入到 p1390MDo 的
EcoRⅠ/Bgl Ⅱ位点 ,且序列分析证实目的基因已重组
到植物中间表达载体 p1390MDo中。
　　观察播种在 1/2 MS甘露糖筛选培养基上 10 ～ 14
d的拟南芥种子 ,发现在360 mg/ L甘露糖作用下 ,仅有
少部分种子萌发且生长正常;在甘露糖质量浓度大于
540 mg/L时 ,绝大部分种子的萌发和生长都受到严重
抑制 ,且随着时间的延长 ,这些植株最终黄化死亡。因
此 ,确定甘露糖的最佳质量浓度为540 mg/L。
2.3　转 FGF21基因拟南芥的 PCR检测
收集转 FGF21 基因当代植株的种子(T 0 代),
在含甘露糖(540 mg/ L)的 1/2 M S培养基上进行筛
选 ,结果表明 ,大部分非转化植株叶片由绿色变为黄
色 ,最终黄化死亡;只有少数植株(T 1 代)能正常生
长。将长势正常的拟南芥苗移栽到基质中 , 1个月
后提取叶片总 DNA ,用油体正向引物 DDoilP1 和
FGF21基因反向引物 FGF21P2 进行特异性 PCR
检测 , 结果(图 5)显示 , 在 3 , 5 , 6 , 9 和 10 号转
FGF21基因拟南芥株系中都扩增到 1 280 bp左右
的条带 ,表明大豆油体基因(DDoil)和 FGF21的融
合基因已整合到拟南芥基因组中。
193第 8 期 付宏岐 ,等:人成纤维细胞生长因子-21 的拟南芥油体表达系统构建
图 3　重组质粒 p1390MDoFGF21 的 PCR 鉴定结果
M.DL2000 DNA Marker;1.FGF21全长基因
Fig.3　PCR amplification o f recombinant
plasmid p1390MDoFGF21
M.DL2000 DNA Marker;1.Fu ll length of FGF21 gene
图 4　重组质粒 p1390MDoFGF21 的 EcoRⅠ/ Bgl Ⅱ
双酶切鉴定结果
M.DL2000 DNA Marker;1.EcoRⅠ/ B g l Ⅱ双酶切的
p1390MDoFGF21重组质粒
Fig.4　Rest riction dig estion analy sis o f recombinant plasmid
p1390MDoFGF21 by EcoRⅠ/B gl Ⅱ
M.DL2000 DNA Mark er;1.p1390MDoFGF21
digested by EcoRⅠ/ B g l Ⅱ
2.4　转 FGF21基因拟南芥的 Southern blot分析
对经 PCR检测为阳性的转 FGF 21基因拟南芥
株系进行 Southern blo t分析 ,结果见图 6 。图 6显
示 ,在受检的 5个转基因拟南芥株系中 , 3个株系有
杂交信号 ,其中 2个株系各有 1个基因拷贝 ,另 1个
株系有 3个基因拷贝;而 2个非转基因拟南芥株系
没有杂交信号 。表明外源基因 FGF21已稳定整合
到拟南芥基因组中。
图 5　转 FGF21基因拟南芥植株的 PCR检测结果
M.DL2000 DNA M arker;1.阳性质粒 p1390MDoFGF21;
2.非转基因植株;3～ 10.转基因植株
Fig.5　PC R detection of the FGF21 gene in
transgenic A.thaliana plants
M.DL2000 DNA Marker;1.Posi ti ve plasmid cont rol
p1390MDoFGF21;2.Wild ty pe plant;3-10.Transgenic plants
图 6　转 FGF21 基因拟南芥植株的 Southern blo t分析
M.λH ind Ⅲ M ark er;1.阳性质粒 p1390MDoFGF21;
2 , 3.非转基因植株;4～ 8.转基因植株
Fig.6　Southern blo t analy sis o f the FGF 21 gene in
transgenic A.thaliana plants
M.λHind Ⅲ Marker;1.Posi tive p lasmid cont rol p1390M DoFGF21;
2 , 3.Wild type plant;4-8.Transgenic lines
2.5　转基因拟南芥表达 FGF21蛋白的检测
提取经 Southern blo t鉴定为阳性的 T 1 代拟南
芥种子总蛋白 ,进行 SDS-PAGE和 Weste rn blot检
测 ,结果(图 7 和图 8)显示 ,转基因拟南芥在约 46
ku 处有 1条很明显的目的条带 ,与预计的融合蛋白
O leo sin-FGF21的条带大小一致 ,而野生型拟南芥
种子没有特异性条带出现 ,说明 FGF21蛋白已在转
基因拟南芥中表达并具有良好的抗原性 。用 Band-
Scand 5.0软件对 SDS-PAGE 凝胶图像(图 7)进行
灰度分析 ,结果显示 , FGF21融合蛋白约占转基因
拟南芥种子可溶性蛋白的 3.76%。
194 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 39 卷
图 7　转 FGF21基因拟南芥种子蛋白的
SDS-PAGE 检测结果
M .蛋白分子质量 Marker;1.野生型拟南芥种子蛋白;
2～ 4.转 FGF 21基因拟南芥种子蛋白
Fig.7　SDS-PAGE analy sis of t ransfo rmed A.thaliana seeds
M.M olecular mas s Marker;1.Protein of w ild ty pe A.tha liana
s eeds;2-4.Protein of t ran sformed A.tha liana seeds
图 8　转 FGF21 基因拟南芥种子蛋白的Western blot 分析
M.蛋白分子质量 Marker;1.野生型拟南芥种子蛋白;
2～ 4.转 FGF 21基因拟南芥种子蛋白
F ig.8　Western blo t analysis of tansfo rmed
plants FGF21 pro teins
M.Molecular mass Marker;1.Protein of w ild type A.tha liana
seeds;2-4.Protein of t ransformed A.tha liana
3　结论与讨论
本研究初步建立了以 PMI 为安全筛选标记的
拟南芥遗传转化体系 ,成功获得了表达 FGF21蛋白
的转基因拟南芥株系 ,并收获了 T 1 代拟南芥种子;
PCR 扩增和 Southern blot 检测结果证实 , 重组
FGF21基因以单拷贝和多拷贝 2 种方式插入到转
基因拟南芥基因组中;BandScand 5.0软件和 West-
ern blo t分析检测结果显示 ,FGF21 融合蛋白约占
转基因拟南芥种子可溶性蛋白的 3.76%,并具有良
好的免疫原性。
　　近年来 ,利用植物生物反应器表达生产药用蛋
白(如疫苗 、抗体 、胰岛素等)已成为生物制药产业的
热点领域 ,具有广阔的市场前景和商业价值 。但植
物生物反应器自身存在的一些瓶颈问题 ,如蛋白表
达量低 、下游分离纯化成本高等 ,促使人们采取对外
源基因进行优化 、合理选择启动子并加以改造 、蛋白
质靶向定位以及特殊的分离纯化策略等措施来解决
这些问题 。
Banilas等[ 23] 发现 ,油体的二聚体或三聚体与
GFP 融合后(即 Oleosin-Oleosin-smGFP , O leo sin-
O leo sin-Oleo sin-smGFP ,Oleo sin-smGFP-O leo sin),
也能在油体中正确定位 ,与单一油体基因与目的基
因融合(即 Oleosin-目的基因)表达相比具有明显优
势 ,其融合蛋白表达量占到种子总蛋白的 2.3%,是
对照的 1.8 ～ 2.0倍 ,并且转基因拟南芥植株及后代
与野生型拟南芥植株的表型等农艺性状相似。因
此 ,从生物技术的角度来看 ,这种 3个油体蛋白基因
与目的基因融合或者目的基因插入 2个油体蛋白基
因之间的高表达策略 ,以及这种生物技术平台的商
业化前景均优于单一油体蛋白基因与目的基因融合
的表达策略[ 23] 。同时也说明 ,本试验中的单一油体
蛋白基因 Oleosin 与目的基因 FGF 21 的融合策略
还有更大的改进和提升空间 ,其外源蛋白表达量还
可能会有进一步提高 。
Parmenter 等[ 24] 发现 ,虽然 Oleo sin-GUS 的融
合蛋白具有生物学活性 ,但 Oleosin-水蛭素融合蛋
白却没有水蛭素特有的抗凝血酶活性 ,因此在 Oleo-
sin编码基因和目的基因之间引入蛋白酶 Xa因子的
识别位点后 ,可以通过酶切获得目的蛋白 ,并利用拟
南芥 Oleosin-目的蛋白重组技术 ,在转基因油菜中
表达了对血栓病有预防和治疗作用的水蛭素 。本试
验通过在 Oleosin 编码基因和 FGF 21 基因之间增
加凝血酶因子的识别位点 , 可以从分离纯化后的
Oleo sin-FGF21融合蛋白切下目的蛋白 FGF21 ,以
保证其生物学活性。
本研究改进了利用植物油体系统表达重组人
FGF21的技术 ,并成功地在拟南芥种子中融合表
达 ,Western blo t结果证明 ,Oleo sin-FGF21的融合
蛋白具有一定的免疫原性。带有 FGF21油体融合
蛋白的种子已被收集 ,下一步将会对 FGF21蛋白的
分离纯化和活性进行研究 。
195第 8 期 付宏岐 ,等:人成纤维细胞生长因子-21 的拟南芥油体表达系统构建
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