全 文 ：基因组学与应用生物学，2012年，第31卷，第6期，第582-586页
GenomicsandAppliedBiology,2012,Vol.31,No.6,582-586
研究报告
ResearchReport
农杆菌介导 DR1172基因转化拟南芥
张新 1 崔广艳 1 陈翠娜 1 张思维 1 代其林 1 王劲 2*
1西南科技大学极端环境生物资源利用实验室,绵阳, 621000;2中国农业科学院生物技术研究所,北京,100084
*通讯作者,wjdsz@vip.sina.com
摘 要 耐辐射奇球菌(D. radiodurans,DR)能在极端胁迫条件下生存，并且拥有一个独特的极端环境抗性基
因组而被广泛用于研究。其中 DR1172是在耐辐射球菌中分离出的一段基因，与LEA76家族同源，参与植物
的抗旱机制。本研究利用基因工程手段以载体pBI121为基础构建植物DR1172-GV3103表达载体，然后利
用花序浸染法将目的基因 DR1172转入模式植物拟南芥中，T2代得到50株植物，阳性为15棵，转化率为
30%。该研究为探讨 DR1172基因的功能以及植物抗逆机制提供了丰富的拟南芥材料，而且对利用基因工程
技术手段改良植物性状，培育出抗逆性强的植物优良品种有重要的指导价值。
关键词 拟南芥,DR1172,载体构建,遗传转化,抗旱
Preliminary Study on Agrobacterium-mediated Transformation ofDR1172
GeneintoArabidopsis
ZhangXin1 CuiGuangyan1 Che Cuina1 Zh ngSiwei1 DaiQilin1 Wa gJin2*
1LaboratoryforApplicationofBiologicalResourcesinExtremeEnvironment,SouthwestUniversityofScienceandTechnology,Mianyang,621000;
2BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing,100084
*Correspondingauthor,wjdsz@vip.sina.com
DOI:10.3969/gab.031.000582
Abstract DR1172isapartofgenefromD. radioduranswhichhashighresistancetoradiationresistance.DR1172
and LEA76 are actually homologous in some way that they both participate in the drought resistant in plants. In
thisresearch, DR1172-GV3103 vector wasconstructed successfullyand theDR1172 gene was inserted intoAra-
bidopsisbyusingthetransgenictechnique.TransgenicArabidopsis wereidentifiedbythemolecularidentification
PCR. 15 positive plants were obtained from 50 T2Arabidopsis and its conversion rate was 30%. The researches
notonlyprovideabundantplantresourcestostudythefunctionofDR1172,b talsohavegreatimporta tapplica-
tionvalueinplantgeneengineeringtechnologyandcultivatequalityvarietyofplantsandagriculturalproduction.
Keywords Arabidopsis,DR1172,Constructionofexpressvector,Genetictransformation,Droughtresisting
基金项目：本研究由转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08009-091B)、国家自然科学基金(30871555)、教育部新世纪优秀
人才支持计划(NCET-08-0940)、四川省教育厅(09ZA034)和西南科技大学博士研究基金(11zx7104)共同资助
耐辐射球菌(D. radiodurans,DR)是1956年由美
国科学家Anderson等(1956)从X-射线灭菌处理后
的肉罐食品中发现的一种红色的非致病性球菌，它
是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的生物之
一，因对电离辐射、紫外线、干燥及一些DNA损伤试
剂显示超强的抗性，一直倍受生物医学界和环境工
程界的关注和重视。耐辐射奇球菌R1属可以在一个
细胞中完成DNA修复，DNA损伤信号输出，干旱和
饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功能。据预计，
在耐辐射球菌R1中的抗旱性研究将用于引导较高生
物体的抗旱性研究(Battistaetal.,2001)。
DR1172是在耐辐射球菌中分离出的一段基因，
该基因全长897bp，属于 LEA第三族的基因，其功
能目前尚未见报道，所以此类蛋白有广阔的研究前
景(李剑等,2010)。第3族的LEA蛋白含有多拷贝的
11个氨基酸组成的基元序列(TAQAAKEKAGE)(Ba-
keretal.,1988)，该族氨基通常附带高电荷可以结合
细胞内的水分子和盐离子,避免了干旱胁迫时对植
物细胞的损伤,同时也可防止植物组织过度脱水
(Dureetal.,1993;IngramandBartels,1996)。
LEA蛋白是在种子富集的一类脱水保护蛋白
(Dure et al., 1981)，不仅是在胚胎发育后期，而且在
其它的个体发育阶段，LEA蛋白的表达也能在干旱
脱水的胁迫下高水平表达。LEA蛋白基因的表达与
植物的渗透胁迫抗性呈正相关。虽然关于LEA蛋白行
使功能的具体机制仍不十分清楚，但在植物受到水分
胁迫时通常都伴随着LEA蛋白的积累，异源表达发
现某些LEA蛋白可以增强转基因植物和酵母菌对
水分胁迫的抗性(Zhangetal.,2000)，最近有研究发现，
LEA蛋白的积累与植物抗性存在一定的相关性(詹立平
等, 2007)。
DR1172是在耐辐射球菌中分离出的一段基因，
经过NCBI序列比对，该基因全长897bp，属于LEA
第三族的基因，其功能尚未见报道。DR1172 与
LEA76家族同源，LEA76蛋白质参与植物的抗旱
性，而且相似的 DR1172基因在植物脱水反应中诱
导产生某些蛋白质产物，这些间接证据表明 DR1172
可能为抗旱性相关的基因。将 lea基因通过遗传转化
导入植物，使其整合到植物染色体组中，并使其表达，
是验证 lea基因编码蛋白授予功能和耐性的良好系统。
本研究利用基因工程手段构建植物 DR1172-
GV3103表达载体，将 DR 172 转入拟南芥中，得到
转基因拟南芥，为后续的研究提供了丰富的植物材
料，为研究 DR1172的功能以及LEA蛋白的功能奠
定了基础，对植物育种工作也有一定的指导意义。
1 结果与分析
1.1 pBI121-D1172质粒的构建
电泳结果(图1)显示DR1172质粒的提取，从图
中可以看出，所提基因条带整齐，无弥散现象，可以
用于PCR扩增。
利用DR1172-F以及DR1172-R引物扩增 DR-
1172基因(图1B)。DR1172大小为897bp，电泳结果
正确，且条带特异。PCR产物进行胶回收(图1C)。
DR1172 胶回收产物进行 XbaⅠ、SacⅠ双酶切
(图1D)，胶回收验证(图1E)，pBI121质粒进行 XbaⅠ、
SacⅠ双酶切(图1F)，胶回收验证(图1G)。电泳结果
显示经过双酶切后，DR1172 以及 pBI121有相关片
段被切开，尤其pBI121很明显地被切成了大小两个
片段。结果显示回收到的片段单一，没有杂带。
酶切后产物连接转化JM109，菌落PCR部分结
图1pBI121-DR 172构建载入JM109
注:A:DR1172+Z3质粒条带;B:DR1172基因PCR产物;C:DR1172产物胶回收电泳;D:DR1172双酶切图(XbaⅠ,SacⅠ);E:
DR1172双酶切后胶回收验证; F: pBI121双酶切图(XbaⅠ,SacⅠ);G:pBI121双酶切后胶回收验证;H:JM109菌落PCR产物
(M:DL2000Marker;1~10:挑取的JM 09单菌落PCR产物;11:阴性对照;12:阳性对照)
Figure1pBI121-DR1172constructedintoJM109
Note: A: Plasmid strip of DR1172+Z3 after agarose gel electrophoresis; B: PCR products ofDR1172; C: Products ofDR1172 by
agarosegelextraction;D:ProductsofDR1172digestedbydoubleenzyme(XbaⅠ,SacⅠ);E:ProvingofDR1172products，extracti n
afterdigestedbydoubleenzyme;F:ProductsofpBI121digested bydouble enzyme (XbaⅠ,SacⅠ);G:ProvingofpBI121 products,
extraction after digested by double enzyme; H: PCR products of JM109 colonies (M:DL2000Marker;1~10:PCRproductsofJM109
singlecolony;11:Negativecontrol;12:Positivecontrol)
农杆菌介导 DR1172基因转化拟南芥
PreliminaryStudyonAgrobacterium-mediatedTransformationofDR1172GeneintoArabidopsis
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基因组学与应用生物学
GenomicsandAppliedBiology
果(图1H)显示有73%显示了阳性条带，阳性克隆送
去测序，测序结果正确的单菌落占25%，阳性单菌落
用于后续转化。测序结果经过 DNAStar分析与
Genbank中报道的DR1172序列同源性为100%，可
以确定 DR1172外源基因导入到了大肠杆菌中。
1.2 DR1172-GV3103植物表达载体的构建
将测序正确的JM109单菌落质粒转化GV3103
感受态，得到的单菌落进行菌落PCR验证(图2)。由
图2可以选择3号、4号、6号、7号菌种可用于保存
菌种，并用于转化拟南芥。
1.3 转 DR1172 基因拟南芥体系的建立及抗性苗的
获得
1.3.1转 DR1172基因拟南芥体系的建立
花序浸染法转染野生型拟南芥(图3)，所收种子
用50mol/L卡那霉素筛选，得到20株阳性苗，PCR
检测出10株阳性苗，收获T1代种子，由于孟德尔遗
传比例的出现，进一步对T1代种子进行筛选，得到
纯合的转基因阳性植株，T2代得到 50株阳性苗，
PCR检测出15棵纯合的阳性苗，阳性率为30%。
1.3.2卡那霉素抗性拟南芥的PCR检测
将具有卡那霉素抗性的转化植株进行 PCR检
测，部分结果如图4所示，植株有清晰的897bp大小
的扩增条带，与质粒阳性对照相符，而阴性对照(未转
化苗)没有，说明外源 DR1172基因已进入到受体植
物细胞。共检测出15株阳性植株。
2讨论
耐辐射奇球菌是迄今地球上发现的辐射耐受性
最强的生物之一(Andersonetal.,1956)，因为其可以
在一个细胞中完成DNA修复，DNA损伤信号输出，
干旱和饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功能，
所以DR1属的抗旱性研究将用于引导较高生物体
的抗旱性研究(Battistaetal.,2001)。通过NCBI数据
比，发现 DR1172属于耐辐射奇球菌R1属的一段基
因，与LEA第三族的基因同源，其功能尚未见报道。
DR1172是一个与LEA76家族同源的基因，大量间
接证据表明，LEA76蛋白质参与植物抗旱性。由此推
图3转基因拟南芥体系的建立
注:A:花序浸染后拟南芥;B:T1代抗性苗;C:抗性拟南芥;D:T1代种子;E:T2代抗性苗;F:T2代抗性拟南芥;G:T2代种子
Figure3RegenerationoftransgenicArab dopsis
Note:A:TheimpregnatedArabidopsis;B:R sistantshootsofT1genera ion;C:ResistanceArabidopsis;D:TheseedsofT1generation;
E:ResistantshootsofT2generati n;F:ResistanceArabidopsis;G:Thes edsofT2generation
图2DR1172-GV3103的菌落PCR
注:M:DL2000Marker;1:水对照,2~15:单克隆菌落PCR,16:
阳性对照
Figure2AnalysisofDR1172-GV3103
Note:M:DL2000Marker;1:Negativecontrol;2~15:PCRprod-
uctsofsinglecolonyafterpBI121-DR1172constructedintoGV-
3103;16:Positivecontrol
图4转 DR1172基因拟南芥PCR检测
注:M:DL2000Maker;1:阴性对照(未转化苗);17:阳性对照(质
粒);其余:卡那霉素抗性植株
Figure4PCRtestofDR1172geneintransgenicplants
Note:M:DL2000Maker;1:Negativecontrols(WT);17:Positive
control (plasmid); Others:Transformedplants
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农杆菌介导 DR1172基因转化拟南芥
PreliminaryStudyonAgrobacterium-mediatedTransformationofDR1172GeneintoArabidopsis
断 DR1172 基因转入植物中可能会提高植物抗旱
性，培育抗旱品种，以降低干旱对农作物产量的影
响。所以本研究以 DR1172为研究基因通过将其转
入植物中为探讨LEA蛋白的功能奠定基础。
拟南芥作为转基因的模式植物，它是自花授粉植
物，基因高度纯合，可以通过拟南芥来快速鉴定基因
的相关作用，所以本研究选择了拟南芥导入 DR1172
基因。通过基因工程手段使作物获得抗旱、耐盐抗寒
等方面的优良性状，具有广阔的应用前景。本研究选
择了DR1172基因作为外源基因，以pBI121为载体，通
过双酶切、连接、转化等步骤构建的DR1172-pBI121
载体带有 GUS基因，以及CaMV35S强启动子和NOS
终止子，调控 DR1172基因在植物中表达，带有 Kan
基因，可以进行抗性筛选。利用冻融法将植物表达载
体DR1172-pBI121导入农杆菌GV3103，利用用根癌
农杆菌介导转录因子基因DR1172转化拟南芥，成功
的将 DR1172导入植物中。
在用花序浸染法转化拟南芥的过程中，影响转
化效率的因素有花序的开放状态，浸染时间，农杆菌
浓度等。本研究选择未开放的花序，在自花授粉之
前，选用OD值为0.5的MS重悬菌液侵染花序10s，
侧放暗培养2d，完成外源基因向受体细胞转移并整
合到细胞核基因组的过程。在进行卡那霉素筛选的
过程中，选择50mol/L的浓度，达到最优筛选效果。因
为孟德尔遗传定律，在转化过程中出现9:3:3:1的筛
选比例，所以拟南芥要筛选到T2代，才能出现纯合
地转基因拟南芥。
本研究预期目标是构建植物表达载体，获得转
基因阳性植株，为后续的植物抗逆研究奠定基础。该
项研究获得了转 DR1172拟南芥植株，为鉴定 DR1172
在植物中的作用提供了丰富的植物材料，而且对应
用基因工程手段改良和培育植物优秀品种具有重要
的现实意义。
3材料与方法
3.1 植物材料及菌株
拟南芥野生型 col-0生态型为本实验室所有。
DR1172+Z3，DR菌内与干旱相关的基因 DR1172与
穿梭质粒pRADZ3连接转大肠杆菌JM109、pBI121，
JM109、GV3103。
3.2构建 DR1172-GV3103植物表达载体
3.2.1DR1 72基因的引物设计
根据 DR1172序列，利用生物软件primer5设计了
该基因的上下游引物(由华大基因合成分别命名为
DR1172-F,DR1172-R)，根据PBI121质粒图谱分别
引入 XbaⅠ，SacⅠ限制性酶切位点，引物序列如下：
Sence：5-GCTCTAGAATGTTTGAACGCGATGAAC
AT-3；Antisence：5-CGAGCTCTCAGTTCTTGCGG
GTGTTGGT-3，加粗标记示酶切位点。
3.2.2PCR扩增目的基因 DR1172及产物的胶回收
用天根的普通质粒小提取试剂盒(TIANGEN)提
取DR1172+Z3质粒，以此为模版进行PCR。
PCR经电泳检测后，使用(TIANGEN)琼脂糖凝
胶DNA回收试剂盒回收扩增片段。
3.2.3DR1172基因和pBI121的酶切，连接，筛选及鉴定
(1)胶回收后的 DR1172 基因和 pBI121质粒分
别用 XbaⅠ，SacⅠ(购自TaKaRa公司)双酶切，37℃酶
切过夜，回收目的片段。
(2)将酶切回收的基因片段和pBI121质粒片段，
16℃连接过夜，重组质粒转化 E. coli，JM109感受
态细胞。
(3)阳性克隆检测：挑取经过转化的JM109单克
隆，菌落PCR初步鉴定，将PCR检测出的阳性克隆
摇菌后送华大基因测序。
3.2.4构建DR1172-GV3103植物表达载体
测序成功的JM109菌落，提取质粒，构建DR1172-
GV3103植物表达载体。
3.3花序浸染法转化拟南芥
3.3.1主要培养基
MS培养基中抗性筛选平板加入Kan(50mg/mL)。
3.3.2拟南芥种子的消毒、铺板及植株培养
拟南芥种子约100粒，加入75%乙醇1mL，1min
后倒出乙醇，无菌水洗1遍后，加入2.5%次氯酸钠1mL，
5min后用无菌水洗5遍后，再加一遍无菌水放4℃
冰箱冷处理2d后铺板。按照每板大约25mLMS配
制固体平板，col-0生态型铺于无抗性培养基上，封
口后放于光照培养箱中22℃，16/8小时光周期(L/D,
光强130μmol·m-2·s-1)。培养10d后移栽至营养土和蛭
石1:1的培养土中，相同温度和光照条件下继续培养，
每3~4d浇一次水。在拟南芥开出花蕾是准备浸染。
3.3.3花序浸染法浸染拟南芥的过程
(1)农杆菌培养：在200mLLB液体LB摇菌培养
基中加入0.2mLDR1172-GV3103菌液，在28℃下，
220r/min振荡培养16h左右，室温下4000r/min离心
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基因组学与应用生物学
GenomicsandAppliedBiology
10min，弃上清夜，菌体用灭菌的1/2MS液体培养基(含
AS100μmol/L)悬浮，稀释到原体积的5~20倍，在28℃
下220r/min振荡培养1h，使菌液的OD600= .5左右。
(2)浸染，将未开花的花序浸入菌液中2~3s，倒放
24 h，并用薄膜覆盖(避光)，24 h后，将其摆正，24 h
后，放在培养架下，光照培养。
3.3.4转化后遗传稳定性的鉴定
拟南芥第一代种子收获后，进行Kan板上的筛
选，阳性苗进行PCR鉴定，一直到T2代，得到纯合体。
作者贡献
本文主要由张新完成，部分实验由崔广艳、陈翠
娜和张思维帮助完成。王劲和代其林为本文的指导老
师。王老师和代老师在实验中为我提供了良好的实
验环境，同时在科研上给了我大量的、极其有益的建
议和指导。
致谢
本研究由转基因生物新品种培育重大专项(2009
ZX08009- 91B)、国家自然科学基金(30871555)、教育
部新世纪优秀人才支持计划(NCET-08-0940)、四川
省教育厅(09ZA034)和西南科技大学博士研究基金
(11zx7104)共同资助。
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