全 文 ：生物物理学报 第二十四卷 第六期 二八年十二月
ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.24 No.6 Dec. 2008
收稿日期： 2008-07-13
基金项目： 国家自然科学基金资助项目 (30570165)， 广东省科技
攻关 (2006A20101007) 资助项目
通讯作者： 王小菁， 电话： (020)85216417，
E-mail： wangxj@scnu.edu.cn
0 引 言
隐花色素 1 （cry1） 是第一个被分离并鉴定的
蓝光 / 近紫外光受体 [1]， 它介导了植物光形态建成
反应， 如下胚轴伸长抑制、 子叶扩大、 花色素苷
（anthocyanin） 积累、 开花时间控制等 [2,3]。 在拟南
芥中还克隆到 cry2[3]和拟南芥 cry3[4,5]。 目前已知，
动物以及人类中也存在着与拟南芥隐花色素同源的
基因以及蛋白， 它们在调控生物节奏中发挥重要功
能[6,7]。 蓝光 / 近紫外光如何激活隐花色素并推动下
游的信号转导是近年来研究的焦点。 研究表明， 照
射蓝光后， 隐花色素的发色团黄素腺嘌呤二核苷酸
（FAD） 发生分子内电子传递， 使 N 端二聚体发生
改变， 进而改变 C 端构象， 激活 C 端而激发信号
转导途径[8,9]。 参与隐花色素下游信号途径的组分也
陆续得到研究， 细胞膜阴离子通道的活化、 Ca2+结
合蛋白基因的表达、 细胞内 Ca2+ 的变化等等都可
能参与了隐花色素介导的反应[10]。 由于隐花色素介
导了多个不同的发育过程和光形态建成反应， 而这
些反应机制具有时空特异性， 这就决定了信号转导
途径和下游组分的多样性。 利用不同的生长发育过
程与实验系统分别研究隐花色素信号转导途径十分
必要。
花色素苷是类黄酮中的一种主要色素， 在植物
花、 种皮、 果皮、 茎杆等器官颜色形成中作用重
要， 并在植物抗病、 抗逆境中发挥功能[11]。 在花色
素苷生物合成途径中， 至少有 15 种结构基因编码
的酶催化不同中间产物的形成， 其中查尔酮合成酶
（CHS） 是关键酶 [11]。 蓝光、 近紫外光诱导花色素
苷的积累已有报道[12～17]。 Christie 和 Jenkins[12]报道
了蓝光诱导拟南芥悬浮培养细胞 CHS 基因表达增
强， 我们也曾发现， 蓝光诱导 2 d 龄拟南芥幼苗的
花色素苷积累， cry1 是介导蓝光反应的光受体 [13]。
hy4 是 CRY1 缺失的突变体， 在蓝光下下胚轴伸长
的抑制特性丧失， 出现了长的下胚轴， 花色素苷积
累也明显下降[14]。
本研究以拟南芥野生型 （WT） 与 hy4 突变体
为材料， 运用药物学研究的方法， 对蓝光诱导拟南
芥幼苗花色素苷积累和 CHS 表达过程中外源 Ca2+
以及膜组分的作用进行研究， 为阐明蓝光诱导花色
素苷积累的分子机制提供实验证据。
胞外钙离子以及细胞膜组分参与蓝光诱导
拟南芥叶片花色素苷的积累
王 曼， 张玉进， 王小菁
（华南师范大学生命科学学院， 广东省植物发育生物工程重点实验室， 广州 510631）
摘要： 以野生型和 hy4 突变体拟南芥为材料， 运用药物学方法研究可能参与蓝光诱导叶片花色素苷积累和
CHS基因表达的信号组分。 培养基中外施 Ca2＋、 钙离子通道剂 A23187、 螯合剂 EGTA、 钙通道阻断剂尼群地平
（nifedipine， Nif） 以及异博定 （verapermil） 的实验证实， 蓝光诱导 13 d 龄叶片花色素苷积累和 CHS 基因表达需
要胞外 Ca2＋的参与 ， 而蓝光作用是由 cry1 （ cryptochrome1） 介导的 。 此外 ， 质膜黄素蛋白抑制剂 DPI
（diphenylene iodonium） 抑制蓝光诱导的花色素苷积累， 质膜 H＋-ATPase 激活剂壳梭胞素 （fusicoccin， FC） 抑制
蓝光反应， 而抑制剂钒酸钠则起促进作用。 CaM 拮抗剂 W7、 Ca2＋-ATPase 抑制剂 EB （erythrosine B）、 G 蛋白激
活剂霍乱霉素 （cholera toxin， CTX） 以及抑制剂百日咳毒素 （pertussis toxin， PTX） 对蓝光下野生型与 hy4 的花
色素苷积累都有影响。 对药物实验的分析表明， 质膜氧化还原系统、 H＋-ATPase 可能参与依赖于外源 Ca2＋的蓝光
反应。
关键词： 拟南芥； 蓝光； 隐花色素； 花色素苷； CHS 基因表达； hy4
中图分类号： Q682
2008年生 物 物 理 学 报
1 材料与方法
1.1 材料培养
拟南芥 （Arabidopsis thaliana， Landsberg 生态
型 ） 野生型 （WT） 和突变体 （ hy4） 种子从
Arabidopsis Biological Resource Center （ Ohio
State University, Columbus, OH, USA） 获得， 并
在实验室扩大繁殖。 种子在黑暗、 4℃下浸种 2～
4 d， 用 75%的乙醇消毒 30 s， 无菌蒸馏水冲洗 3
次后用 10% （v/v） NaClO 浸泡 15～20 min， 用无
菌蒸馏水冲洗 5 次。 将灭菌后种子播种于含有 2%
蔗糖， 0.8%琼脂的 B5固体培养基上， 置于光照培
养室， 在 （21±1）℃、 20 μmol·m－2·s－1的白光下培
养 13 d后， 转到 50 μmol·m－2·s－1蓝光下培养。
1.2 花色素苷的测定
花色素苷的测定参照 Deikman 和 Hammer[18]、
Noh 和 Spalding[19]的方法。 不同处理的拟南芥叶
片称重后 ， 置于 propanol∶HCl∶H2O （18∶1∶
81） 的提取液中， 沸水浴 3 min， 室温过夜提取花
色素苷， 用分光光度计 （UV-1206， 日本岛津） 测
定波长在 535 和 650 nm 处的 OD 值， 花色素苷的
相对含量按(A535－A650) /鲜重 （g－1） 计算。
1.3 Northern杂交
参照 Trizol （购自上海生工生物工程技术服务
有限公司） 试剂盒方法。 材料在液氮中研磨成粉，
每 100 mg 组织加入 1 ml Trizol， 经氯仿去蛋白、
异丙醇沉淀 RNA、 70%的乙醇洗涤 、 干燥后 ，
RNA 沉淀用适量的 DEPC 水溶解待用。 用分光光
度计测定 260 nm 和 280 nm 的吸收值并采用甲醛
变性胶电泳对 RNA 进行纯度分析和定量。 按照
Sambrook 等 [20]的常规方法进行杂交 。 取 RNA
15 μg， 经电泳、 转膜、 预杂交、 杂交后， 放射自
显影。 [α-32P]dCTP 购自北京福瑞公司， 探针标记
试剂盒购自 TaKaRa Biotechnology Co. Ltd， CHS
探针由美国 Virginia Polytechnic Institute and State
University 的 Shirley BW教授赠送。 Northern 杂交
条带的相对比值参照常用的方法[21]， 将杂交条带和
18S RNA条带用 Bio Image （Gene company Ltd.）
系统进行拍照 ， 采用 Gene Tools 软件 （Gene
company Ltd.） 对条带进行相对量化计算， 计算目
的基因条带的吸光度峰值与 RNA 条带的吸光度峰
值的比值 ， 设 WT （CK） 为 1， 其它与此进行
比较。
1.4 光源
以 40 W蓝色荧光灯 （广州灯泡厂生产） 作为
光源， 透过蓝色滤膜 （#73， 日本クティェん株式
会社生产） 获得蓝光的最大波长为 456 nm， 半高
宽 50 nm。 白光为 40 W 冷光型国产白色荧光灯。
光源的光强测定： 白光用 L1-6200 光合作用测定仪
测定， 蓝光用日本产 Optical Power Meter TQ8210
型手持测定仪测定， 光强通过开启灯管数目和植物
材料与光管的距离进行调节。
1.5 化学药品
A23187、 EGTA、 nifedipine （Nif）、 verapermil、
W7、 diphenylene iodonium （DPI） 、 fusicoccin
（ FC） 、 vanadate、 erythrosine B （ EB） 、 cholera
toxin （CTX） 和 pertussis toxin （PTX） 等药品均
购自 Sigma 公司 ， 无水 CaCl2 为国产分析纯 。
A23187、 Nif、 W7、 DPI， 用少量 DMSO 溶解 ；
其它均用无菌水溶解。
2 结 果
2.1 胞外 Ca2＋对蓝光诱导拟南芥叶片花色素苷积
累的影响
前期工作已经证明， 蓝光不仅诱导 2 d 龄黄化
拟南芥幼苗花色素苷积累 [13]， 还能诱导 13 d 龄拟
南芥绿色幼苗叶片的花色素苷积累， 在蓝光下， 突
变体 hy4 叶片的花色素苷含量显著降低[17]。 为了研
究外源钙离子在蓝光反应中的作用， 将萌发的拟南
芥种子置于含 Ca2＋或无 Ca2＋的 B5培养基上， 在白
光 （20 μmol·m－2·s－1） 下培养至 13 d， 再将幼苗转
到 50 μmol·m－2·s－1蓝光下培养 24 h 后， 分别测定
其花色素苷的含量。 图 1A 表明， 在含 Ca2＋条件
下， 野生型 （WT） 幼苗积累的花色素苷比 hy4 的
高 48%； 在无 Ca2＋培养基上的野生型幼苗叶片，
蓝光诱导的花色素苷积累受到约 40%的抑制， 而
对 hy4的影响不大。 说明蓝光对花色素苷积累的诱
导作用需要培养基中 Ca2＋的存在。
A23187 作为钙离子载体， 可以携带胞外的钙
离子进入胞内， 使胞质中 Ca2+的浓度升高[12, 23]。 将
13 d 龄拟南芥幼苗转入加或不加 A23187 的含 Ca2＋
培养基中， 在 50 μmol·m－2·s－1蓝光下处理 24 h 后，
测定叶片花色素苷的含量。 图 1B 表明， WT 花色
素苷含量比未加 A23187 的对照增加 38%， 说明钙
离子的流入可以促进蓝光诱导的花色素苷积累。 而
452
第 6 期 胞外钙离子以及细胞膜组分参与蓝光诱导拟南芥叶片花色素苷的积累
2.2 钙离子通道阻断剂和钙调素拮抗剂对蓝光诱
导拟南芥幼苗花色素苷积累的影响
尼群地平 （nifedipine， Nif） 是 L- 型钙离子通
道阻断剂[23]。 如图 2A 显示， 它对蓝光诱导拟南芥
WT 叶片花色素苷的积累有抑制作用 。 浓度为
30 和 60 μmol/L时， 花色素苷含量下降了约 35%；
当 Nif的浓度继续升高到 90 μmol/L时， 花色素苷
含量继续下降， 比对照降低了约 50%。 hy4 花色素
苷的含量没有受到尼群地平的影响， 也没有随着浓
度升高而发生变化。
另一种质膜 L- 型钙离子通道阻断剂异搏定
（verapermil）[23]对蓝光诱导叶片花色素苷的积累也
有抑制作用。 随着培养基中浓度的升高， WT 叶片
花色素苷含量呈现下降的趋势。 浓度为 10 μmol/L
时， 花色素苷含量比无阻断剂对照降低了约 45%；
浓度为 10 和 50 μmol/L 时， 降低了约 50%。 而异
搏定处理后， 对蓝光下 hy4叶片花色素苷的积累没
有明显影响。
W7 是钙调素的拮抗剂 [24]。 当培养基中含有
100 μmol/L W7 时， 蓝光下的 WT 叶片花色素苷
的含量明显降低， 比无拮抗剂对照降低约 60%。
W7 对 hy4 也有影响， 加入 W7 的培养基中的花色
素苷含量比对照培养基中降低约 35% （图 2C）。
2.3 膜组分相关药物对蓝光诱导拟南芥幼苗花色
素苷积累的影响
DPI （diphenylene iodonium） 是一种黄素蛋白
抑制剂， 它可以从还原的黄素蛋白上夺取一个电子
而阻断电子的正常传递 [25]。 在我们的实验中， DPI
对蓝光诱导 WT 叶片花色素苷的积累有抑制作用
（图 3A）。 随着 DPI 浓度的升高， WT 中花色素苷
的积累呈现下降的趋势， 10、 20 和 30 μmol/L 的
处理对花色素苷含量的抑制作用相似， 含量比无拮
抗剂对照降低 40%～50%。 而 DPI对 hy4 花色素苷
的积累影响不明显。
壳梭胞素 （FC） 是质膜 H＋-ATPase 的激活
剂[26]。 图 3B显示， FC抑制花色素苷积累， 浓度为
50 μmol/L 时， 花色素苷含量比对照降低约 55%。
FC 对蓝光诱导 hy4 花色素苷的积累没有显著的
影响。
Fig.1 Requirement of extracellular Ca2+ for the anthocyanin accumulation induced by BL in Arabidopsis leaves. The seeds
were germinated on B5 medium with (＋Ca2+) or without (－Ca2+) 1 mmol/L of CaCl2 (A). 13 d-old seedlings of WT and hy4
grown under white light transferred to the medium with or without A23187 (B) and different concentration of EGTA (C)
for another 24 h under BL (50 μmol·m －2·s －1) before harvesting. Anthocyanin contents were determined in the harvested
leaves and data are the means (n≥20) of three independent experiments ± SE. ■: WT; □: hy4
160
120
100
60
40
20
0
140
80
A
nt
ho
cy
an
in
re
la
tiv
e
co
nt
en
t(
%
)
＋Ca2+ －Ca2+ ＋A23187－A23187 0 10 100 1000
EGTA (μmol/L)
(A) (B) (C)
对于突变体 hy4， 无论培养基中有无 A23187， 其
花色素苷的含量没有明显变化， 说明缺乏 CRY1，
即使有 Ca2＋， 蓝光诱导花色素苷的积累仍不能
发生。
在 B5 培养基中加入钙离子的螯合剂 EGTA，
使培养基中 Ca2＋浓度降低后， 蓝光诱导的叶片花
色素苷积累受到抑制。 从图 1C 可以看出， EGTA
的浓度在 10 μmol/L 和 100 μmol/L 时， 蓝光诱导
WT花色素苷积累变化不明显， 而当 EGTA浓度升
高到 1 mmol/L 时， 花色素苷含量下降约 38%。 而
hy4 的花色素苷含量并没有随着在培养基中加入
EGTA而发生变化， 3 种 EGTA浓度下的花色素苷
含量没有明显差异。
453
2008年生 物 物 理 学 报
Fig.3 Effects of plasma membrane components on BL response. 13 d-old seedlings of WT and hy4 grown under white
light transferred to the B5 medium with or without different concentrations of DPI (A), FC (B), vanadate (C) and EB (D),
respectively, for another 24 h under BL (50 μmol·m－2·s－1) before harvesting. Anthocyanin contents were determined in the
harvested leaves and data are the means (n≥20) of three independent experiments ± SE. ■: WT; □: hy4
0 10 20 30
200
150
125
75
50
25
0
175
100
A
nt
ho
cy
an
in
re
la
tiv
e
co
nt
en
t(
%
)
DPI (μmol/L)
(A)
0 5 10 50
FC (μmol/L)
(B)
0 25 50 100
200
150
125
75
50
25
0
175
100
A
nt
ho
cy
an
in
re
la
tiv
e
co
nt
en
t(
%
)
Vanadate (μmol/L)
(C)
0 50 100 200 400
EB (nmol/mL)
(D)
Fig.2 Effects of Ca2+ channel blockers and CaM antagonist on BL response. 13 d-old seedlings of WT and hy4 grown
under white light transferred to the B5 medium with or without different concentrations of Nif (A), verapermil (B) and
100 μmol/L W7, respectively, for another 24 h under BL (50 μmol·m－2·s－1) before harvesting. Anthocyanin contents were
determined in the harvested leaves and data are the means (n≥20) of three independent experiments ± SE. ■: WT; □: hy4
0 30 60 90 0 10 30 50 W7－ W7＋
Nif (μmol/L)
(A)
Verapermil (μmol/L)
(B) (C)
120
80
60
40
20
0
100
A
nt
ho
cy
an
in
re
la
tiv
e
co
nt
en
t(
%
)
454
第 6 期 胞外钙离子以及细胞膜组分参与蓝光诱导拟南芥叶片花色素苷的积累
Fig.4 Effects of activator and inhibitor of G protein on BL response. 13 d-old seedlings of WT
and hy4 grown under white light transferred to the B5 medium with or without different
concentrations of CTX (A) and PTX (B), respectively, for another 24 h under BL (50 μmol·m－2·s－1)
before harvesting. Anthocyanin contents were determined in the harvested leaves and data are the
means (n≥20) of three independent experiments ± SE. ■: WT; □: hy4
180
150
120
90
60
30
0
0 100 200 400
CTX (ng/mL)
(A)
A
nt
ho
cy
an
in
re
la
tiv
e
co
nt
en
t(
%
)
0 100 200 400
PTX (ng/mL)
(B)
矾酸钠 （vanadate） 是质膜 H＋-ATPase 的抑制
剂[27]， 与 FC 的作用相反， 对蓝光诱导 WT 花色素
苷的积累有促进作用 。 在浓度为 25 μmol/L 和
50 μmol/L时， 花色素苷的积累略有升高， 当浓度
达到 100 μmol/L 时， 花色素苷的含量比对照提高
约 70% （图 3C）。 高浓度矾酸钠对蓝光诱导 hy4 花
色素苷的积累也有促进作用， 但变化幅度不如对
WT的高， 仅提高 10%左右。
EB (erythrosine B) 是 Ca2＋-ATPase 的抑制剂，
它在 nmol/L范围内就可以特异性抑制 Ca2＋-ATPase
的 活 性 [28,29]。 在 EB 浓 度 分 别 为 50、 100 和
200 nmol/L时， 对蓝光诱导WT中花色素苷的积累
有促进作用 ， 50 nmol/L 时 ， 含量比对照提高约
60%。 但高浓度 （400 nmol/L） 时表现出抑制作用。
EB对 hy4也有明显的促进作用 （图 3D）。
霍乱毒素 CTX （cholera toxin） 是 G蛋白的激
活剂[30]。 从图 4A可知， CTX对蓝光诱导拟南芥叶
片花色素苷积累有抑制作用， 当浓度为 100 ng/mL
时 ， 花色素苷的含量比对照降低了约 15% ；
400 ng/mL 时约 20%。 hy4 与 WT 有相似的趋势，
随 CTX 浓度升高， 花色素苷含量逐渐降低。 当浓
度达到 400 ng/mL时， hy4 中的花色素苷含量降低
了 40%。
百日咳毒素 PTX （pertussis toxin） 是 G 蛋白
的抑制剂 [30]。 与 CTX 作用相反， 对蓝光诱导 WT
花色素苷积累有促进作用 ， 当 PTX 浓度为
400 ng/mL 时 ， 花色素苷的含量比对照提高约
60%。 而 PTX 对 hy4 中花色素苷的积累却表现出
抑制的作用。 在 PTX 浓度为 100 和 200 ng/mL时，
花色素苷含量比未加药物时降低约 37% （图 4B）。
2.4 不同药物处理对 CHS 表达的影响
先前的研究[17]已经证实， 蓝光诱导拟南芥 WT
叶片 CHS 基因的表达， 图 5 的结果表明， 当含钙
培养基中加入离子通道剂 A23187 后， 蓝光处理叶
片 （图 5 泳道 2） 与未加通道剂的对照 （图 5 泳道
1） 相比， CHS 基因表达有所上调。 相反， 含钙培
养基中加入钙离子螯合剂 EGTA 则使基因表达下
调 （图 5 泳道 3）。 拟南芥 hy4 突变体在蓝光处理
后 CHS 基因基本没有表达 （图 5 泳道 6）， A23187
处理后基因表达量略有上调 （图 5泳道 7）。
蓝光下生长的 WT 幼苗如果用尼群地平处理，
其叶片 CHS 基因表达明显上调 （图 5 泳道 4）， 与
尼群地平处理后花色素苷含量下降的结果 （图 2A）
不一致， 而异博定处理后的基因表达量与对照相比
下调 （图 5 泳道 7）， 与其抑制花色素苷含量积累
的结果 （图 2B） 相一致。
455
2008年生 物 物 理 学 报
3 讨 论
3.1 胞外钙离子参与蓝光诱导的叶片花色素苷
积累
胞内 Ca2+ 浓度变化与生物和非生物信号转导
相关， 红光、 蓝光、 紫外光等可分别通过不同的受
体引发 Ca2+ 浓度变化 [31～34]。 Christie 和 Jenkins[12]
以药物学的方法证实， 胞质 Ca2+ 浓度的升高参与
了悬浮细胞中 CHS 的表达。 但 Lewis 等 [35]认为 ，
蓝光不能诱导拟南芥幼苗胞质 Ca2+ 浓度的变化。
我们以药物实验证实， 在蓝光诱导 13 d 龄拟南芥
绿色幼苗叶片的花色素苷积累和 CHS 基因表达中，
需要细胞外 Ca2+的参与。 如果培养基中没有 Ca2+，
花色素苷含量受到明显抑制 （图 1A）， 如果向含
Ca2+的培养基中加入钙离子载体 A23187， 则明显
促进了蓝光诱导的花色素苷积累， 也使 CHS 的表
达信号略有增强 （图 5A）， 而钙离子螯合剂 EGTA
处理后强烈抑制了花色素苷积累和 CHS 的表达
（图 1C， 5A）。
一些 Ca2+ 参与的信号途径会被钙离子通道阻
断剂尼群地平和异搏定所阻断 [34,36,37]。 在一些实验
中， 两种抑制剂的作用相同 [36,37]， 而在另一些实验
中， 两者具有不同的作用 [34,38]。 在实验中， 尼群地
平对蓝光诱导的 WT 中 CHS 的表达有促进， 但对
花色素苷的积累有抑制作用； 而另一种阻断剂异搏
定则对蓝光诱导的 CHS 表达和花色素苷的积累都
有抑制作用 （图 2A, B； 图 5A）。 由于这两种抑制
剂可以抑制胞外 Ca2+ 通过离子通道进入胞内， 再
次说明了胞外 Ca2+ 参与蓝光诱导的花色素苷积累
和 CHS 的表达。 而二者作用上的差异原因， 还需
进一步探讨。 花色素苷的合成积累是受多因素调控
的过程， 十分复杂[11]。 尼群地平对基因表达与花色
素苷积累影响的不一致性， 暗示光对尼群地平敏感
性钙离子通道在基因水平和蛋白水平可能具有不同
的调控作用， 也说明蓝光诱导花色素苷的积累是通
过一个非常复杂的信号转导网络来实现的。
Ca2+ 可通过与 Ca2+ 结合蛋白的结合在胞内传
递信号， 引起下游的反应。 研究[22,39]表明， CaM 抑
制 UV 诱导的 CHS 表达。 在我们的实验中， CaM
拮抗剂W7对蓝光诱导的拟南芥花色素苷积累有抑
制作用， 说明 CaM 也可能参与了蓝光反应， 但
W7 对 hy4 也有抑制， 因此要排除药物的作用还需
进一步实验。
此外， 实验结果进一步证明 cry1 是蓝光诱导
花色素苷积累反应的主要光受体。 这是因为， 无论
培养基中有无 Ca2+， 蓝光下 hy4 的花色素苷积累没
有明显变化， A23187、 EGTA、 尼群地平和异搏定
等处理都不能明显影响 hy4 叶片的花色素苷积累。
这个结果与前人的报道 [40,41]以及本实验室的结果 [13]
一致。
3.2 质膜氧化还原系统和 H+-ATPase 可能参与蓝
光诱导的叶片花色素苷积累
植物的质膜是细胞与外部环境分隔的一个屏
障， 它除了控制物质进出细胞、 保持细胞正常的生
理功能之外， 也是各种信号跨膜转换的重要场所。
质膜上的黄素蛋白在质膜电子传递系统中起作用。
CRY1 的色素是黄素， 它作用机理的假说之一就是
与质膜作用启动电子传递， 引发信号转导， 这可能
是通过 C- 端实现的 [8,9]。 DPI 是一种黄素蛋白拮抗
剂 [22]， 它可以从还原型的黄素的靶蛋白上汲取电
子 ， 还可以抑制植物质膜上的氧化还原酶 ， 如
NADPH氧化酶[42]和 NAD(P)H醌氧化还原酶[43]。 在
我们的实验中， DPI抑制了蓝光诱导的拟南芥花色
素积累 （图 3A）， 但对 CHS 表达没有明显作用。
DPI对 hy4 中花色素苷含量没有明显的影响， 说明
DPI抑制的电子传递可能与蓝光反应有关。 蓝光是
Fig.5 Effects of Ca2+ and other chemicals on CHS gene
expression in response to BL. 13 d-old seedlings of WT
and hy4 grown under white light transferred to the B5
medium containing 1 mmol/L of CaCl2 and other different
chemicals for 1 h in the darkness followed by the
irradiation of BL (50 μmol·m－2·s－1) before harvesting. CHS
gene expression was detected by Northern blot and RNA
bands were as the control. The chemical concentrations as
follows: 10 μmol/L A23187, 1 mmol/L EGTA, 90 μmol/L
Nif and 50 μmol/L verapermil (Ver). The relative
expression level was calculated by the ratio of absorbance
peak value of purpose gene band to the value of 18S RNA
using Gene Tools of Gene Company Ltd
1 1.3 0.8 4.3 0.6 0.1 0.3
CK A23187 EGTA Nif Ver CK A23187
WT hy4
Relative ratios
456
第 6 期 胞外钙离子以及细胞膜组分参与蓝光诱导拟南芥叶片花色素苷的积累
否仅仅通过 CHS 基因表达来促进花色素苷积累还
需进一步证实。
植物质膜 H＋-ATPase 和 Ca2＋-ATPase 调控着
植物多种生理反应， 在植物生长发育的过程中起着
十分重要的作用。 Wang 和 Iino[27]发现， 质膜 H＋-
ATPase 的抑制剂矾酸钠可抑制由蓝光引起的拟南
芥原生质体的收缩。 蓝光引起气孔的开放也与蓝光
激活保卫细胞质膜 H＋-ATPase 有关[44]。 实验发现，
H＋-ATPase 的激活剂 FC 对蓝光诱导的拟南芥 WT
花色素苷的积累和 CHS 表达有抑制作用， 而抑制
剂矾酸钠则促进花色素苷的积累和基因表达 （图
3B、 C）。 说明质膜 H＋-ATPase 在蓝光反应中起着
负调节的作用。 两种药物对拟南芥 hy4 的花色素苷
积累影响不明显， 进一步说明 H＋-ATPase 参与了
蓝光反应。 此外， 一定浓度的 Ca2＋-ATPase 抑制剂
EB与矾酸钠相似， 促进蓝光诱导的反应 （图 3D），
但对WT与 hy4均表现出相似的促进作用， 意味着
Ca2＋-ATPase 参与的调节并不具有 CRY1 反应的特
异性。
蓝光可激活位于质膜上的异三聚体 G 蛋白[45]，
但 G 蛋白是否参与蓝光诱导的拟南芥花色素苷积
累的信号转导过程未见报道。 在实验中， G蛋白的
促进剂 CTX 使蓝光下 WT 和 hy4 中的花色素苷含
量都减少 （图 4A）， 当加入了 G 蛋白的抑制剂
PTX， WT 中花色素苷的积累会升高， 但 hy4 中的
花色素苷下降 （图 4B）， 基因表达的测定结果表
明 ， CTX 和 PTX 都抑制 WT 基因的表达 （图
5B）。 这些实验结果说明 G蛋白在蓝光诱导拟南芥
花色素苷积累的信号途径中是否具有特异的作用还
需进一步探讨。
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第 6 期 胞外钙离子以及细胞膜组分参与蓝光诱导拟南芥叶片花色素苷的积累
This work was supported by grants from The National Natural Sciences Foundation of China (30570165) and Natural Science Foundation
of Guangdong Province of China (2006A20101007)
Received: Jul 13, 2008
Corresponding author: WANG Xiao-jing, Tel： +86(20)85216417， E-mail： wangxj@scnu.edu.cn
EXTRACELLULAR Ca2+ AND CELL MEMBRANE COMPONENTS INVOLVED IN
ANTHOCYANIN ACCUMULATION INDUCED BY BLUE LIGHT IN Arabidopsis thaliana
WANG Man, ZHANG Yu-jin, WANG Xiao-jing
(College of Life Sciences, South China Normal University, Guangdong Key Laboratory of
Biotechnology for Plant Development, Guangzhou 510631, China)
Abstract： Previous research demonstrated that blue light (BL)(50 μmol m－2 s－1) induced anthocyanin
accumulation in 13-day old Arabidopsis seedling. In this studies, a sets of pharmacological experiments
were conducted to evaluate weather the influx of extracellular Ca2+ and the membrane components were
involved in blue light induced anthocyanin accumulation and CHS gene expression. When the seedlings
were cultured on the B5 medium with or without Ca2+, A23187, EGTA, nifedipine (Nif), verapermil, the
changes of anthocyanin accumulation induced by BL were determined. It was found that the extracellular
Ca2+ was required for the BL induced pigmentation and the CHS gene expression and cry1 is one of the
main photoreceptors mediating the BL response. DPI, an inhibitor of plasma membrane (PM)
flavoenzymes, inhibited the BL response in WT leaves. FC, an activator of PM H+-ATPase showed the
inhibition of BL induced anthocyanin accumulation whereas vanadate, an inhibitor of the H+-ATPase had
promoting effect. Moreover, W7 (N- (6-aminohexyl)-5-chloro-1- naphthalenesulfonamide), an antagonist of
calmodulin, erythrosine B (EB), an inhibitor of the Ca2+-ATPase, cholertha toxin (CTX), a G protein
activator and pertussis toxin (PTX), a G protein inhibitor were all affected the anthocyanin accumulation
induced by BL both in WT and in hy4 leaves. The results suggested that PM redox system, H+-ATPase
are involved in the Ca2+ dependent BL induction of anthocyanin accumulation in the leaves of
Arabidopsis.
Key Words: Arabidopsis; Blue light; Cryptochrome; Anthocyanin; CHS gene expression; hy4
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