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论 文 第 50卷 第 22期 2005年 11月
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分离鉴定拟南芥开花调控基因 Flowering Locus D
(FLD)的一个新等位突变
陈瑞强①②* 张素芝①②* 孙姝兰①②* 常建红①② 左建儒①†
(① 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101; ② 中国科学院研究生院, 北京 100049. * 同等贡献. † 联系人,
E-mail: jrzuo@genetics.ac.cn)
摘要 高等植物的开花是由植物的内在因素和环境因素两方面控制的. 在拟南芥中, 控制开花的几个
主要的遗传位点已经被鉴定. 拟南芥Flowering Locus C基因(FLC)通过作用于自主途径抑制由营养生长
向生殖生长的转化. FLC的表达能被 FLD抑制, 而后者编码组蛋白去乙酰化酶复合体的一个成分. 本研
究分离鉴定了一个新的 FLD等位突变体 fld-5. 遗传分析表明, fld-5(Wassilewskija生态型)和前人报道的
fld-3和 fld-4(Colombia-0生态型)是等位突变体. 遗传学和分子生物学分析表明, fld-5在FLD编码区有一
个移码突变, 从而导致其可读框的提前终止. 在 fld-5 突变体中 FLC 的表达显著增加, 因此可能导致该
突变体呈现出异常的晚花表型.
关键词 拟南芥 FLC fld-5 开花
高等植物在营养生长向生殖生长转变期间 , 开
花是其中最重要的过程之一 . 正确的开花时间是保
证植物最大程度上繁殖成功的关键 . 在拟南芥中存
在 4个调控开花时间的遗传途径, 这些途径通过整合
内在发育和外在环境两方面的因素参与调控开花时
间[1]. 感受和传递日照长短信号的遗传位点属于光周
期途径 , 而感受和应答环境温度变化的遗传位点则
被定位在春化途径上[1,2]. 另外 2 条途径上的基因能
够不依赖于环境信号而调控开花 . 其中自主途径通
过应答未知的植物内部因子来促进开花 , 而赤霉素
(GAs)能够不依赖于光周期促进开花, 并且在短日照
下 GAs对于植物的开花是绝对必需的[3]. 此外, 越来
越多的证据也表明这几条开花调节途径通过几个整
合因子, 如 FT, SOC1和 LFY互相联系[1~3].
自主途径上的突变体在不同的日照长度下均呈
晚花表型, 在短日照条件下则尤为明显, 并且这一晚
花表型能够被春化和红光或远红光处理部分恢复[4].
与 FRI 促进 FLC 表达不同, 自主途径上的基因均能
抑制 FLC mRNA的积累[4~8]. 在这些自主途径基因中,
FCA, FPA和 FLK编码 RNA结合蛋白[9,10], 而 FY参
与mRNA 3′-末端剪接并且作为 FCA的辅助因子来调
控开花时间[11]. 自主途径的另 2个基因参与了组蛋白
的修饰 , 而这种修饰对许多基因的调控具有重要作
用. FVE 和 FLD 分别编码 retinoblastoma-associated
protein和 KIAA0601的同源蛋白, 它们可能通过调节
组蛋白的去乙酰化来调控开花[12,13].
在本文中 , 我们报道鉴定并分析了一个晚花突
变体 fld-5, 其野生型等位基因属于自主途径. 分子遗
传学分析表明, fld-5是一个新的 fld突变体, 证明FLD
抑制了FLC的表达, fld-5的晚花表型很可能是突变体
中 FLC高表达引起的.
1 材料与方法
(ⅰ) 植物材料与生长条件. 所用植物材料是拟
南芥 Wassilewskija(WS)和 Columbia(Col-0)两种生态
型. 除特别指明外 , 植物材料均培养在 MS 培养基
上[14] (1×Murashige and Skoog, 3%蔗糖(质量体积比)
和 0.8%琼脂(质量体积比)), 生长条件为 16 h光照/8 h
黑暗, 22℃.
(ⅱ) 赤霉素处理. 植物在连续光照下生长在土
中, 分别用水(对照)或 1 mmol/L赤霉素(GA3, Sigma,
St Louis, MO, USA)每 3 d喷一次植物直到其抽苔.
(ⅲ) 图位克隆 fld-5. 用于遗传学定位的 F2 群
体通过 fld-5 (WS)和野生型(Col-0)杂交得到. 利用分
离群体分组分析法 (Bulked Segregation Analysis)对
100 个 fld-5 F2 分离单株进行初步定位, 将突变基因
定位于第 3 染色体前端[15]. 初步定位使用了 18 个简
单序列长度多态性标记 (SSLP marker) (F21M12,
CIW12, CIW1, NGA280, NGA111, NGA168, NGA172,
NGA162, CIW11, NGA6, NGA8, CIW6, CIW7,
NGA1107, CTR1, NGA249, NGA239, PHYC). 更多







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的 SSLP标记用于突变基因的精细定位.
(ⅳ) 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR). RT-PCR
根据 Zuo 等人[16]的方法修改后进行. 在逆转录反应
中, 用 SuperScriptⅡ(Invitrogen)为逆转录酶, 底物为
1 µg总 RNA和 oligo(dT)引物, 参照试剂盒说明书进
行逆转录反应. 反应结束后, 用 RNase A在 37℃温育
30 min消化模板 RNA. 取 1 µL处理后的逆转录反应
产物用相应的引物进行 PCR 反应. PCR 反应的条件
是: 94℃, 20 s, 58℃, 30 s, 72℃, 2 min, 25个循环.
用于 PCR的引物对(所用的序列均为 5′→3′):
FLCF1: CTACAGCTTCTCCTCCGGCGAT;
FLCB1: CAACCGCCGATTTAAGGTGGCTA;
FTF1: CAGGCAATGAGATTGTGTGTTACG;
FTB1: CACTCTCATTTTCCTCCCCCTCTC;
COF1: GCCCCTTCTTTCAGATACCAGC;
COB1: GTCTGAATTAGGGAACAGCCACG;
LFYF1: GATTATGGATCCTGAAGGTTTCACG;
LFYB1: GTACCTTCTTGGGAGAGAGCATC;
FLDF3: GGGATTATAGCGAGACAGCTTG;
rtFLDB1: CTAACCAGATTTTGTGCCTGAG
FLDB3: GTGGATCAGGGACATTTATTCC;
Act3F1: GTATGTGGCTATTCAGGCTGT;
Act3B1: CTGGCGGTGCTTCTTCTCTG.
其他所有的分子生物学实验根据标准方法进行
操作[17]. fld-5 等位基因的分子生物学分析是将相应
引物对扩出的 PCR产物进行直接测序.
2 结果
2.1 fld-5突变体的鉴定和遗传分析
我们构建了大约包含 40000 个独立转化株的拟
南芥突变体库. 这些转化株系的背景分别是 WS(大
约 6000个株系)和Col-0(其他所有株系)[18]. 为了获得
影响植物生长和发育的突变体 , 我们利用这些
T-DNA插入突变体进行遗传筛选. 将 T2代突变体种
子直接播种在土中, 在连续光照和 22℃的培养条件
下, 观察植物的生长发育表型. 在筛选了约 6000 个
WS 株系后获得一个晚花突变体. 由于其异常晚花表
型, 该突变体最初被命名为 delayed shoot formation.
进一步的研究表明, 该突变体和以前研究过的 fld 是
等位突变. 因此, 我们将这一突变体重新命名为 fld-5,
其晚花表型在 T3代得到确证.
在卡那霉素选择性 MS 培养基上, 所有 T3 后代
均表现出抗性 . 为分析突变的性质以及突变是否与
T-DNA 插入连锁, 将突变体和野生型(WS)进行了杂
交. F1 开花时间表型正常, 表明该突变为隐性突变.
F1 自交得到的 F2 群体中野生型和 fld-5 的分离比是
3︰1 (WT︰fld-5 = 212︰67; χ2 = 0.69), 表明该突变
为隐性单基因突变. 而在卡那霉素培养基上 F2 代群
体中抗性植株与敏感植株的分离比是 63︰1, 表明突
变体中至少有 3 个 T-DNA 插入. 然而进一步研究表
明, fld-5突变没有被任何 T-DNA插入所标记(数据未
显示).
最初的 fld-5 突变体与野生型回交两次后, 纯合
的 F3 代用于后述实验. 这些 fld-5 的 F3 代及其后代
中的 T-DNA 插入已被分离出去, 因此它们对卡那霉
素敏感.
2.2 fld-5突变体的表型
与野生型相比, fld-5的莲座叶数目显著增加, 并
且由营养生长到生殖生长的转型被显著推迟(图 1(a)
和(b)). 在连续白光下, 野生型通常在长出 7~8 片莲
座叶或萌发 18~20 d后便抽苔开花. 而 fld-5在开花前
可以产生 30 片以上的莲座叶, 往往需要 10~12 周的
时间(图 1(d)). 在突变体上有时能观察到侧生花序的
出现 , 在这些侧生花序上通常产生莲座叶而不是茎
生叶(图 1(c)). 此外, fld-5 突变体的叶子比野生型的
绿且明显增厚. 与野生型相比, 成熟的 fld-5 突变体
株型更大同时产生更多的种子.
2.3 FLD可能在自主途径行使功能
在拟南芥中, 开花时间主要由 4 条途径调控, 包
括自主途径、光周期途径、春化途径和赤霉素途径[1,2].
为了确定 fld-5 突变体中哪条途径受到了影响, 我们
进行了下述实验. 将突变体种植在不同光周期下, 以
确认 fld-5 的表型是否受光周期影响. 所有被检测的
光周期条件(连续白光照, 16 h光照/8 h黑暗和 8 h光
照/16 h 黑暗)均不能补救突变体的晚花表型(图 2(a)
和(b)). 特别是在短日照条件下, 突变体开花显著地
晚于野生型. 此外, 与前人报道的 fld-3 和 fld-4 类
似[13], 春化处理能够部分地补救 fld-5的晚花表型(数
据未显示). 上述特征均是自主途径突变体的特点[1,2].
综上所述, fld-5可能影响了自主途径.
2.4 赤霉素能部分互补 fld-5的晚花表型
在某些情况下 , 施加外源赤霉素也能够部分地
互补自主途径突变体的晚花表型 [19,20]. 为了进一步
研究 FLD 介导的开花途径, 我们分析比较了 fld-5 突







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图 1 fld-5 突变体表型
(a) 生长 6周的 fld-5 植株具有过多的莲座叶; (b) 生长 7周的 fld-5 植株俯视图; (c) 生长 7周的 fld-5 植株侧视图; (d) 野生型(左,
WS)和 fld-5(右)植株在 16 h光照/8 h黑暗长日照光周期下生长 7周; (a)~(c)为植株在连续白光照下生长

变体在赤霉素处理和非处理条件下的开花表型 . 经
赤霉素处理, fld-5突变体的抽苔时间略有缩短, 与野
生型的抽苔时间变化基本一致(图 3(a)). 但是赤霉素
处理后, fld-5突变体的莲座叶数目相对于野生型显著
减少(图 3(b)), 这表明赤霉素能部分互补 fld-5突变体
的晚花表型. 以上结果进一步支持了 fld-5 突变体可
能影响自主途径这一观点.
2.5 FLD抑制 FLC表达
为了研究 fld-5突变体的分子表型, 我们用RT-PCR
分析了几个调控开花时间的基因的表达情况 . 自主
途径的绝大部分晚花突变体都具有 FLC 高表达的特
征, 而 FLC 具有抑制营养生长向生殖生长转变的作
用[21]. 在 fld-5突变体中 FLC的表达显著高于野生型
(图 4). 与预料一致, 2个受 FLC负调控的调节开花的
重要整合因子 FT和 SOC1在 fld-5中的表达与野生型
相比则明显下降(图 4). 然而, 光周期途径的 CO 基
因、另一个调节开花的整合因子 LFY(图 4)以及自主
途径 FCA(数据未显示)的表达在 fld-5 中没有受到影
响. 这些结果表明, FLD 在 FLC 的上游抑制其表达,
随后 FLC又负调控 FT和 SOC1的表达. 上述结果表
明, FLD在自主途径行使功能.
2.6 fld-5突变体的分子鉴定
如上文中提到, fld-5 突变没有被 T-DNA 插入标
记, 因此采用图位克隆的方法鉴定 FLD 基因. 利用
fld-5 和野生型 Col-0杂交得到的 F2群体我们将突变
定位在第 3 条染色体的 2 个 SSLP 标记 nga162 和
nga172之间, 二者相距 13.6 cM(图 5(a)). 在这个区域
所报道的晚花突变体只有 fld-1 和 fld-2[19,22], 它们的
表型和 fld-5非常相似, 并且 fld-1和 fld-2也影响自主
途径[19,22].
在本实验过程中, He 等人[13]报道了他们用类似
的方法鉴定出了 FLD 基因[13]. 由于表型和遗传定位
的相似性我们推测 fld-5可能是 fld的等位突变体. 因
此我们通过 DNA 测序分析了 fld-5 突变体中 FLD 位
点中是否存在突变. 通过测序发现在 fld-5 中 FLD基
因(GenBank 登录号: At3g10390)存在 2 个突变(图
5(b)). 在 fld-5 中有一个 A1665到 T1665的颠换(核甘酸
位置的注释参考 [13]), 由此引起了 Arg555(AGA)到







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图 2 fld-5的开花时间
(a) 野生型(WS)和 fld-5 植株在不同光周期下开花时的莲座叶数目;
(b) 野生型(WS)和 fld-5植株在不同光周期下的抽苔时间. 节线表示标
准差

Ser555(AGT)的突变. 另外, 在 fld-5 中缺失了一个核
甘酸 G1670, 从而导致了一个移码突变并使 Leu563 被
终止密码子(TAG)替换. 此外该突变还造成了 FLD的
表达量显著降低(图 5(c)). 因此第 2 个突变导致 fld-5
仅能编码一个剪切的蛋白. 目前还不清楚 fld-5 分子
水平的缺失是否是由于 T-DNA 插入造成. 为了进一
步确定这些 fld突变体的等位性, 我们把 fld-5与 fld-3
和 fld-4 分别杂交 [13]. 在所有实验条件下(不同光周
期), 所有的 F1都呈现晚花表型, 至此可以确定 fld-5
和其他 fld突变体是等位突变体.
FLD 基因包含一个 2527 个核甘酸的可读框, 中
间仅有一个内含子(图 5(b)). 之前发现的 fld突变体都


图 3 野生型和 fld-5对赤霉素的反应
(a) 野生型和 fld-5在水和赤霉素处理后的抽苔时间; (b) 野生型和
fld-5在水和赤霉素处理后开花时的莲座叶数目. 节线表示标准差



图 4 fld-5的分子表型
提取生长 20 d的野生型和 fld-5的总 RNA用于做 RT-PCR 分析. 上边
的条带是 Actin3, 下边的条带是相应的基因. 实验以不同批次的材料
重复了 3次, 该图为一次代表性的结果

是在第 1 个外显子发生突变, 而 fld-5 却在第 2 个外
显子发生突变. FLD的可读框编码一个 789个氨基酸
的蛋白质. 与 fld-3 和 fld-4 相比, fld-5 的晚花表型相
对较弱. 我们推测 fld-5 中缩短的 FLD 蛋白可能还具
有部分地活性 , 因此是此遗传位点的一个弱的等位
突变. 对于 FLD 的详细的分子生物学和生化的分析
研究已有报道[13], 本文不再做更多的研究.







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图 5 fld-5的分子鉴定
(a) fld-5的遗传作图. 突变被定位于第 3条染色体前端的 2个 SLLP标
记之间. FLD两侧的遗传距离(cM)如图所示. (b) fld等位基因的基因组
结构图. fld-1, fld-3 和 fld-4被 He等人[13]鉴定, fld-2[19]还没有在分子
水平得以鉴定. 本文研究 fld-5 的突变和定位如图所示. (c) fld-5 突变
体中 FLD 的表达. 提取生长 3 周的野生型和 fld-5 的总 RNA 用于
RT-PCR 分析 . 两对位置不同的引物 (每一对都横跨内含子)分别用
于 PCR, 其产物分别是 1614 (上面, 引物对为 FLDF3 和 rtFLDB1)和
889 bp(中间, 引物对为 FLDF3和 FLDB3). 实验以不同批次材料重复
了 3次

3 讨论
开花在高等植物中是一个非常重要的生理过程.
生理学和遗传学研究表明, 开花受到内外两方面因
素调控[23,24]. 本文鉴定分析了一个晚花突变体 fld-5.
fld-5 在长日照和短日照的情况下均呈晚花表型, 而
长日照下则尤为明显, 这一点是自主途径突变体的
特点[1,24]. 外源施加赤霉素和春化处理能够部分地补
救 fld-5的晚花表型也支持了其位于自主途径的观点.
此外, 在 fld-5 中 FLC 的表达显著增加, 这表明 FLD
是一个 FLC的抑制因子. 与预料一致, 2个受 FLC负
调控的基因 FT和 SOC1在 fld-5中的表达水平显著下
降. 综合上述结果说明, FLD是自主途径上的一个重
要组分, 可能直接参与了 FLC的调节.
FLD 与人类的 KIAA0601 蛋白具有较高的同源
性[13], 后者是人类组蛋白去乙酰化酶 1,2(HDAC1/2)
共抑制子复合物的一个成分 . 这一复合物通过使组
蛋白氨基酸残基去乙酰化来抑制基因表达 [25]. 与野
生型相比, 在 fld突变体中 FLC的组蛋白 H4 是高度
乙酰化的[13], 这也可能是突变体中 FLC 表达增强的
原因. 与此类似的机制也出现在春化途径上: 染色质
重排复合物 HDAC通过对 FLC染色质上组蛋白的去
乙酰化和H3上 Lys9和 Lys27位点的甲基化维持 FLC
基因的关闭状态, 从而抑制了 FLC的表达[26~28].
与 fld-3和 fld-4相比, fld-5的晚花表型相对较弱.
之前发现的所有 fld突变体都是在第 1个外显子有突
变, 而 fld-5却在第 2个外显子存在突变(图 5(b)). fld-5
的突变性质表明其可能不是完全的功能缺失性突变,
这可能是其表型较弱的原因. 此外, 之前鉴定的所有
fld 突变体都是 Col-0 背景, 而 fld-5 是惟一的 WS 背
景突变体. 因此, fld-5的鉴定将有助于今后对自主途
径的遗传学和功能研究, 如对 fld 突变体进行抑制子
和增强子的遗传学研究.
致谢 感谢 Richard Amasino 博士提供了 fld-3 和 fld-4 种
子, 以及本实验室成员给予的有价值的讨论和帮助. 本工
作受中国科学院知识创新工程重要方向性项目 (批准号 :
KSCXZ-SW-308)、国家自然科学基金项目 (批准号 :
30125025, 30221002)和国家高技术研究发展计划项目(批
准号: 2001AA225021, 2003AA225010)资助.
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