全 文 ：第 33 卷第 2 期 中南民族大学学报(自然科学版) Vol． 33 No． 2
2014 年 6 月 Journal of South-Central University for Nationalities(Nat． Sci． Edition) Jun． 2014
收稿日期 2014-03-14
作者简介 王朝元(1964-)，男，博士，教授，研究方向:生物医学工程，E-mail:wangchaoyuan@ mail． scuec． edu． cn
基金项目 中南民族大学基本科研业务费专项资金项目(ZZY10008)
玉柏石松中甾体化合物对体外
培养成骨细胞活性的影响
王朝元，胡 蝶
(中南民族大学 生命科学学院，武汉 430074)
摘 要 为研究玉柏石松中甾体化合物豆甾烷-3-酮-21-羧酸(SA)对体外培养小鼠成骨细胞系 MC3T3-E1 活性的
影响，用 Alamar Blue法检测了成骨细胞增殖率，碱性磷酸酶试剂盒检测了细胞中碱性磷酸酶活性，茜素红染色检
测了成骨细胞矿化水平，荧光定量 PCＲ检测了成骨细胞骨分化相关基因的表达．结果显示:8 μmol /L和 16 μmol /L
的 SA处理细胞 8 d能抑制成骨细胞碱性磷酸活性;处理细胞 16 d能提高骨细胞矿化水平． SA 抑制成骨早期分化
相关基因(Ｒunx-2 和 Osterix)的表达，促进骨基质蛋白 OPN 和骨重建相关转录因子(Jun-D，Fra-1 和 Fra-2)的表
达．故 SA具有促进骨折愈合的成骨活性，可能通过促进相关转录因子表达，骨折断面旧骨的吸收和骨基质钙化等
方式完成．
关键词 豆甾烷-3-酮-21-羧酸(SA);成骨活性;骨分化相关基因表达;骨矿化
中图分类号 Q 28;Q 291 文献标识码 A 文章编号 1672-4321(2014)02-0022-06
Effect of a Steroid from Lycopodium obscurum L．
on Osteogenic Activity of Osteoblasts in vitro
Wang Chaoyuan，Hu Die
(College of Life Science，South Central University for Nationality，Wuhan 430074，China)
Abstract To study the effect of a steroid stigmastan-3-one-21-oic acid (SA)from Lycopodium obscurum L． on the
osteogenic activity of osteoblasts． Alamar Blue assay was applied to test the proliferation of osteoblasts and pNPP assay was
used to detect the alkaline phosphatase activity． Osteoblast mineralization in vitro was determined with Alizarin red S
staining and the bone differentiation-related genes expressions in osteoblasts were tested with real-time PCＲ． The results
showed that SA (8 μmol /L and 16 μmol /L) had an inhibitory effect on alkaline phosphatase activity after 8-day
incubation，and 16-day SA treatment enhanced the mineralization of cells． SA also inhibited the expression of early
osteogenic differentiation-related genes (Ｒunx-2 and Osterix)，but enhanced the expression of bone matrix protein OPN and
bone remodeling-related transcription factors (Jun-D，Fra-1 and Fra-2)． These findings revealed that SA possessed
osteogenic activity in bone fracture healing by stimulating the expression of related transcription factors，bone resorption in
the bone fracture interface and bone matrix mineralization．
Keywords stigmastan-3-one-21-oic acid; osteogenic activity; bone differentiation-related gene expression;
bone mineralization
玉柏石松，又名伸筋草，广泛分布于湖北、四川、
贵州和西藏．在我国传统的中医药和土家族医学中，
玉柏石松被用于治疗关节炎疼痛、四肢瘫痪、痛经和
挫伤［1］．临床用于治疗骨折，治疗效果良好［2，3］，但其
治疗骨折的药理学机制尚不清楚．石松属植物家族富
含生物碱，具有很强的生物学活性［4］．目前已有超过
200种生物碱和 140种石杉型三萜从石松属植物中分
离出来，具有抗炎、止痛、抗菌等疗效［5，6］．但这些玉柏
石松中化合物促进成骨的研究尚不多见．
课题组前期从玉柏石松中分离来两个新型四环
三萜类化合物［7］和甾体化合物 stigmastan-3-one-21-
oic acid (SA)［8］． 为研究玉柏石松甾体化合物 SA
(结构式见图 1)诱导骨形成的潜能，本文通过研究
SA对成骨细胞毒性、ALP活性、骨基质矿化和对骨分
化相关基因(早期成骨分化和矿化相关基因)的表达
的影响，来阐明 SA的成骨活性，为进一步开发利用玉
柏石松提供依据．
图 1 豆甾烷-3-酮-21-羧酸的结构式
Fig． 1 The structure of stigmastan-3-one-21-oic acid
1 材料与方法
1． 1 材料和仪器
本实验所用 SA 为本实验室从采自中国湖北省
建始县的玉柏石松中分离纯化得到． α-MEM培养基
(Thermo赛默飞世尔生化制品有限公司)，小牛血清、
胰蛋白酶、二甲基亚砜、Alamar Blue、PCＲ 引物
(Invitrogen)，Alizarin red S (Sigma-Aldrich) ，Trizol、荧
光标记试剂盒、cDNA 第一条链合成试剂盒(Life
Technology，Australia)，矿物油(Sigma Aldrich)．
96-孔板(Nunc)，加样机器人(5075 Eppendorf
epMotion)，荧光定量 PCＲ 仪(7900HT Fast Ｒeal-time
system，Applied Biosystems)，酶 联 免 疫 检 测 仪
(Optima BMG PolarStar)．
1． 2 SA提取与纯化
本实验所用的玉柏石松采自中国湖北省建始县．
分离纯化过程详见参考文献［8］．简言之，将玉柏石松
风干磨成粉．用MeOH抽提3次，提取物溶解于3%的
酒石酸 / H2O(pH =3)中，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙
酯萃取物溶于 90% 的 H2O/MeOH中，依次用石油醚
(PE)，EtOAc 和 nBuOH 萃取，将 EtOAc 的提取物进
行柱层析法(CC)分离，获 9 个组分(Fr． 1 ～ Fr． 9)．将
Fr． 5进行柱层析(硅胶，氯仿 /丙酮的体积分数是 1∶ 0
→1∶ 1)后得到化合物 SA．利用核磁共振谱技术分析
化合物 A的结构，得到其结构式如图 1所示．
1． 3 SA储存液的配制
1． 6 ×10 －3 mol /L的 SA储存液配制:将 SA溶于
二甲基亚砜(DMSO)并涡旋震荡，60℃加热 30 min溶
解，过滤除菌，置于 －20℃长期保存．
1． 4 细胞培养基
基础培养基:用于 MC3T3-E1 细胞生长，在 α-
MEM中加入 10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100
mg /mL链霉素．
诱导培养基:用于分析 SA对成骨细胞碱性磷酸
酶(ALP)活性，细胞外基质矿化，成骨分化相关基因
的表达，在基础培养基中加入终浓度为 50 μg /mL 抗
坏血酸、10 mmol /L β-甘油磷酸钠、10 －8 mol /L地塞米
松．
1． 5 SA对成骨细胞存活率的影响
用 Alamar Blue 实验检测 SA 对细胞的毒性． 将
MC3T3-E1细胞按 1 × 103 /孔接种于 96 孔板中，每孔
150 μL基础培养基，置于 37℃、5% CO2 培养箱中培
养 1 d后，弃去培养基，分别加入含有 5 种不同浓度
的 SA(1，2，4，8，16 μmol /L)的诱导培养基，以 1%
DMSO为阴性对照，每组设 3 个复孔．将培养板放置
于 37℃中培养 0，24，72 h 后，每孔加入 18 μL 的
Alamar Blue试剂使其最终体积分数为 10% ．用荧光
酶标仪于 540 nm检测光吸收值(激发光 544 nm，发
射光 590 nm)．
1． 6 SA对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响
将 MC3T3-E1细胞按 3 × 104 /孔接种于 6 孔板，
置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 2 h，待细胞贴壁后，
弃去培养基，分别加入含有 2 种不同浓度的 SA(8
μmol /L和16 μmol /L)的诱导培养基，以1%的DMSO
为阴性对照，每组设 3个重复，每 3 d换一次培养基．
分别培养 8 d和 16 d后，弃去培养基，用 PBS 将
细胞洗 2 次．加入 0． 1% Triton-X100 裂解过夜．用细
胞刮刀刮下细胞，转移至 1． 5 mL微量离心管中，4℃、
10000 r /min离心 10 min．将上清液以每孔 100 μL转
移 到 96 孔 板 中，每 孔 加 入 200 μL para-
Nitrophenylphosphate (pNPP)显色剂，在室温黑暗条
件下，轻摇 96孔板反应 30 min，用酶标仪检测 405 nm
处的吸光值．每个样品设 3个重复．
1． 7 SA对成骨细胞体外矿化的影响
用茜素红染色来检测细胞的矿化．将 MC3T3-E1
细胞按 7． 5 ×103 /孔接种于 48孔板中，分别加入含有
2种不同浓度的 SA(8 μmol /L 和 16 μmol /L)的诱导
培养基，以 1%的 DMSO 为阴性对照，每组设 3 个重
复．分别培养 8 d和 16 d后，用 PBS将样品洗2次．室
32第 2 期 王朝元，等:玉柏石松中甾体化合物对体外培养成骨细胞活性的影响
温条件下，将样品固定在 －20℃冰凉的甲醛上 10 min
之后，用 dH2O洗两次，加入 1%茜素红孵化，在吸出
未结合的染料后，样品用 dH2O 洗若干次后风干，用
倒置显微镜观察并拍照．
为了定量矿化，每孔中加入 800 μL、体积分数为
10%的乙酸．室温下，摇晃细胞培养板孵化 30 min，用
细胞刮刀刮下细胞，加入 10%的醋酸．涡旋震荡 30 s
后，加入 200 ～ 300 μL 矿物油．加热到 85℃，10 min，
转移至冰上 5 min，20000 r /min 离心 15 min．取每管
上清液 300 ～ 400 μL 转移至新的 1． 5 mL 的离心管
中，加入体积分数为 10%的氢氧化铵 200 μL中和酸，
取上清液 150 μL转移至 96孔板中于 405 nm检测吸
光值．每个样品设 3个重复．
1． 8 SA对成骨细胞骨分化相关基因 mＲNA 表达的
影响
将 MC3T3-E1细胞按 7． 5 × 103 /孔接种于 48 孔
板中，加入含有 SA 的诱导培养基，SA 的浓度为 8
μmol /L和 16 μmol /L，分别培养 8 d和 16 d，以 1%的
DMSO为阴性对照，每组设 3个复孔．用 Trizol裂解细
胞，按照试剂盒说明书提取总 ＲNA 并合成 cDNA 第
一条链． 荧光定量 PCＲ 的引物如表 1 所示［9］，
GAPDH为内参基因．实验用 384 孔板，液体转移后进
行热循环． PCＲ 循环参数如下:95℃，10 min;变性:
95℃，15 s;退火和延伸:60℃，60 s;循环数:45 次，每
个样品进行 3 次．用软件 SDS2． 2． 2 收集数据，通过
2 － ΔΔCT计算药物对相关基因表达影响［10］．
表 1 荧光定量 PCＲ引物序列
Tab． 1 Primer sequences used in Ｒeal-time PCＲ
目的基因 上游 (5-3) 下游 (5-3)
ALP GCTGATCATTCCCACGTTTT CTGGGCCTGGTAGTTGTTGT
OPN CGATGATGATGACGATGGAG TGGCATCAGGATACTGTTCATC
OCN AAGCAGGAGGGCAATAAGGT TTTGTAGGCGGTCTTCAAGC
Col I ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT
BSP CAGAGGAGGCAAGCGTCACT CTGTCTGGGTGCCAACACTG
Ｒunx-2 TCACTACCAGCCACCGAGAC ACGCCATAGTCCCTCCTTTT
Osterix ATGGCGTCCTCTCTGCTTGAG AGGACTGCCTGCAGGAGAGAG
c-fos CCAGTCAAGAGCATCAGCAA AAGTAGTGCAGCCCGGAGTA
Jun-D CGACCAGTACGCAGTTCCTC AACTGCTCAGGTTGGCGTAG
Fra-1 AGAGCTGCAGAAGCAGAAGG CAAGTACGGGTCCTGGAGAA
Fra-2 ATCCACGCTCACATCCCTAC GTTTCTCTCCCTCCGGATTC
GAPDH AACTTTGGCATTGTGGAAGG ACACATTGGGGGTAGGAACA
ALP:alkaline phosphatase;OPN:osteopontin;OCN:osteocalcin;Col I:collagen I;BSP:bone sialoprotein
1． 9 统计分析
用方差分析法对结果进行显著性差异分析，p ＜
0． 05被认为有显著性差异，p ＜ 0． 01 被认为有极显著
性差异．
2 结果与分析
2． 1 SA对成骨细胞增殖的影响
SA对成骨细胞增殖的影响见图 2． Alamar blue
试验显示:到第 3 d，5 个浓度的 SA 对 MC3T3-E1 细
胞的增殖无明显影响．故选择 2个最高的药物浓度(8
μmol /L和 16 μmol /L)用于进一步实验．
2． 2 对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响
SA对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响结果见图
3．与对照组相比，8 μmol /L和 16 μmol /L的 SA处理
细胞 8 d后，均能抑制细胞碱性磷酸酶活性．第 16 d，
SA 对 成 骨 细 胞 碱 性 磷 酸 酶 活 性 无 显 著 影
响(p ＞0． 05)．
1)对照组(0 d);2)1 d;3)3 d
与对照组比较，* p ＜0． 05，＊＊p ＜0． 01，n =3
图 2 SA对体外培养成骨细胞增殖的影响
Fig． 2 The effect of SA on cell viability in vitro
2． 3 SA对体外成骨细胞基质矿化的影响
SA对体外成骨细胞基质矿化的影响结果见图
4．第 8 d，对照组和 SA 处理组细胞都出现钙化，随
着培养时间的延长，至第 16 d，3 组细胞均呈现较显
著的体外钙化．
42 中南民族大学学报(自然科学版) 第 33 卷
1)control;2)8 μmol /L SA;3)16 μmol /L SA
与对照组比较，* p ＜0． 05，＊＊p ＜0． 01，n =3
图 3 SA对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响
Fig． 3 The effect of SA on alkaline phosphatase activity in osteoblasts
a)0 μmol /L;b)8 μmol /L;c)16 μmol /L
图 4 SA对体外成骨细胞骨基质矿化的影响
Fig． 4 The effect of SA on osteoblast mineralization in vitro
不同浓度的 SA对成骨细胞矿化影响如图 5 所
示．图 5 中 SA 处理细胞 16 d 后，与对照组相比，8
μmol /L和 16 μmol /L SA显著促进了骨基质矿化(p
＜ 0． 05)．
1)control;2)8 μmol /L SA;3)16 μmol /L SA
与对照组比较，* p ＜ 0． 05，＊＊p ＜ 0． 01，n = 3
图 5 不同浓度的 SA对成骨细胞矿化影响的定量研究
Fig． 5 Quantification of mineralization of osteoblasts
treated with SA in vitro
2． 4 SA对成骨分化相关基因表达的影响
2． 4． 1 SA对成骨基质蛋白基因 mＲNA表达的
影响
荧光定量 PCＲ 分析成骨细胞关键基因的表达
结果见图 6．图 6a为 SA对成骨细胞 ALP mＲNA表
1)control;2)8 μmol /L SA;3)16 μmol /L SA
与对照组比较，* p ＜ 0． 05，＊＊p ＜ 0． 01，n = 3
a)ALP;b)Col I;c)OPN;d)BSP;e)OCN
图 6 SA对成骨细胞骨基质形成相关基因 mＲNA表达的影响
Fig． 6 The effect of SA on the mＲNA expression of bone matrix formation-related genes in osteoblasts
达的影响． SA对细胞短时间(8 d)处理抑制了 ALP
表达;经过 16 d的培养，8 μmol /L的 SA明显促进了
ALP 表达，而 16 μmol /L的 SA对 ALP表达有明显抑
制作用(p ＜ 0． 05)． 图 6b 为 SA 对成骨细胞 Col I
mＲNA表达的影响． 处理细胞 8 d，8，16 μmol /L 的
SA均抑制 Col I基因表达(p ＜ 0． 05);16 d SA 对该
基因的表达无明显影响(p ＞ 0． 05)． 图 6c 为 SA 对
成骨细胞 OPN mＲNA 表达的影响． 处理细胞 8 d，
52第 2 期 王朝元，等:玉柏石松中甾体化合物对体外培养成骨细胞活性的影响
8，16 μmol /L SA对 OPN表达有明显促进作用;16 d
后，高浓度 SA(16 μmol /L)促进 OPN 的表达(p ＜
0． 05)．图 6d 为 SA 对成骨细胞 BSP mＲNA 表达的
影响． 8，16 μmol /L SA 在处理细胞 8，16 d，均抑制
BSP表达(p ＜ 0． 05)． 图 6e 为 SA 对成骨细胞 OCN
mＲNA 表达的影响(p ＜ 0． 05)． 8 μmol /L 和 16
μmol /L的 SA分别处理细胞 8 d 后，促进了 OCN 基
因表达;但 8 μmol /L 和 16 μmol /L 的 SA 分别处理
细胞 16 d，OCN表达不受影响(p ＞ 0． 05)．
2． 4． 2 SA 对成骨早期分化相关基因 mＲNA 表达
的影响
Ｒunx-2 和 Osterix 是骨祖母细胞分化成成骨细
胞过程中两个关键基因． 图 7 显示 SA 对成骨早期
分化相关基因 mＲNA表达的影响．如图 7a 所示，SA
处理 8 d 抑制 Ｒunx-2 的表达;处理 16 d，8 μmol /L
的 SA对 Ｒunx-2 的表达有一定促进作用，16 μmol /L
的 SA则表现出抑制作用．如图 7b 所示，SA 处理显
著抑制 Osterix的表达(p ＜ 0． 05)．
1)control;2)8 μmol /L SA;3)16 μmol /L SA
与对照组比较，* p ＜ 0． 05，＊＊p ＜ 0． 01，n = 3
a)Ｒunx-2;b)Osterix
图7 SA对成骨细胞期成骨细胞分化基因的mＲNA表达的影响
Fig． 7 The effect of SA on the mＲNA expression of early
osteogenic differentiation genes in osteoblasts
2． 4． 3 SA 对成骨细胞部分转录因子 mＲNA 表达
的影响
图 8 为 SA对成骨细胞部分转录因子 mＲNA 表
达的影响．如图 8a所示，SA处理对 c-fos mＲNA的表
达无任何影响． 如图 8b 和图 8c 所示，SA 处理对
Jun-D和 Fra-2 的表达的影响相同:SA处理细胞 8 d
对 Jun-D和 Fra-2 表达影响甚微;16 d 却显著促进
它们的表达(p ＜ 0． 05)．故 SA 对 Jun-D 和 Fra-2 的
mＲNA表达影响呈时间依赖性． 如图 8d 所示，16
μmol /L 的 SA 分别处理显著提高细胞中 Fra-1
mＲNA表达量明显增加;8 μmol /L的 SA处理细胞 8
d后，Fra-1 表达量有所增加，但 16 d 后，Fra-1 的表
达量与对照组差不多(p ＞ 0． 05)，故 SA 对 Fra-1
mＲNA的表达呈浓度依赖性．
1)control;2)8 μmol /L SA;3)16 μmol /L SA
与对照组比较，* p ＜ 0． 05，＊＊p ＜ 0． 01，n = 3
a)c-fos;b)Jun-D;c)Fra-2;d)Fra-1
图 8 SA对成骨细胞部分转录因子 mＲNA表达的影响
Fig． 8 The effect of SA on the mＲNA expression of
transcription factors in osteoblasts
3 讨论
在生物体发育的过程中，骨生成是一个复杂的
过程．首先涉及到 MSC 细胞分化成为前成骨细胞
系．这个过程部分由 Ｒunx-2 和 Osterix这两个关键基
因控制． Ｒunx-2 以一个锌指结构域结合在启动子上
促进相关基因表达［11］． Osterix 是 MSC 向成骨细胞
分化的特异因子，仅在正在生长的骨组织中表
达［12，13］．从干细胞分化到成骨细胞系的形成，Osterix
基因表达贯穿了整个过程［12，13］．这两个基因在骨祖
母细胞分化成为成骨细胞过程中表达． 本研究的结
果表明:SA 不利于 MSC 细胞分化成为前成骨细胞
系．紧接着是成骨细胞基质形成及矿化阶段．成骨细
胞形成后，骨基质的形成过程包括了骨相关基因的
表达，这些基因包 ALP，Col I，OPN，OCN 和 BSP，骨
相关基因在骨基质的形成和骨基质钙化过程中起了
重要的作用［14，15］．
ALP是早期骨基质形成的标志物［16，17］． OPN 在
骨基质的矿化和吸收过程中有重要作用． OPN 分子
富含天冬氨酸的区域与组织中的羟基磷灰石结合．
OPN在骨折修复早期的骨重建中具有重要功能，它
通过增强骨折断面旧骨的吸收加快骨折修复的进
程．本研究发现:SA 剂量短期处理可显著降低成骨
细胞中成骨活性的代表性蛋白 ALP 的活性，显示其
具有抑制骨生成的效果;但茜素红染色却显示出 SA
62 中南民族大学学报(自然科学版) 第 33 卷
促进骨基质的矿化，显示出其具有促进骨生成的能
力．同时，SA可显著促进 OPN的表达．说明 SA不利
于骨折早期骨基质的形成，但可通过促进骨折界面
的重吸收和后期骨基质的钙化来加速骨折的愈合．
Jun(c-Jun，Jun-B，Jun-D)和 fos (c-fos，Fra-1，
Fra-2 等)蛋白是转录因子 AP1 家族成员，在骨矿化
阶段起着重要作用． AP1 在调节骨生成和骨重建过
程中起重要作用［18］．本研究结果证明:SA 在适当的
浓度可显著地促进 Jun-D、Fra-1 和 Fra-2 的表达，具
有促进骨折愈合过程中骨重建的能力．
4 结论
SA具有促进骨折愈合的活性，它通过促进转录
因子 Jun-D、Fra-1 和 Fra-2 的表达，促进骨折断面旧
骨的吸收和骨基质钙化等，使骨折愈合．
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