全 文 ：收稿日期:2003-10-25
基金项目:国家“十五”科技攻关项目(2001BA302B-03)
作者简介:王　燕(1977-),女 ,河南濮阳人 ,硕士 ,主要从事离子注入拟南芥生物效应研究工作。
氮离子注入对拟南芥的生理影响初步研究
王　燕 ,王卫东 ,秦广雍 ,霍裕平
(郑州大学离子束生物工程省重点实验室 ,河南 郑州　450052)
　　摘要:以拟南芥菜为研究对象 , 对低能氮离子注入对拟南芥干种子的萌发力 、苗体生长形态性状的影响及过氧化
物同工酶酶活性和酶谱变异情况进行了研究和探讨。结果表明 , 发芽率-剂量曲线呈“马鞍型”特性;离子注入对拟
南芥菜生长有抑制作用 ,营养器官的损伤率-剂量关系为先降后升的趋势 , 并且剂量间各性状差异极显著;离子注入
后过氧化物同工酶酶活性在一定剂量范围内增强 , 酶谱的变异体现在谱带强弱的变化而不是谱带增减上 , 初步探讨
了各性状表现与 POD 酶活变化的关系。
关键词:离子注入;拟南芥;过氧化物酶同工酶
中图分类号:S63.01　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2004)01-0082-04
The Elementary Study on the Physiological Effect Variation of the Arabidopsis
thaliana Implanted by the Low Energy Ion Beam
WANG Yan ,WANG Wei-dong ,QIN Guang-yong ,HUO Yu-ping
(Ion Beam Bioengineering Lab of Zhengzhou University ,Zhengzhou　450052 ,China)
Abstract:In this paper , the Arabidopsis thal iana seeds , which w ere implanted the low energy N+ ions ,
were studied.The capaci ty of the germination rate , the shapes the plants , the peroxidase(POD)activity and the
enzyme spect rums w ere changed.The results revealed that the germination rate-dose curve falls at first , then
rise and fall at last.The characteristics of the injury rates of the nutrient organs were down at f irst and then up ,
in addition , the differences of the dif ferent dose were evident.In a good range , the POD activity w as intensi-
f ied;the deep o r low color of the enzyme spectrums represents the changes of the enzyme spect rums.
Key words:Ion beam implant;Arabidopsis thal iana ;POD
　　离子束作为一种新的诱变源已经被我国成功的
应用于水稻 、棉花等作物的诱变育种 ,它表现为损伤
轻 ,突变率高 , 突变谱较宽[ 1] 。离子注入生物体内
后 ,注入离子的电 、能 、质的联合作用[ 2 , 3] 首先表现
为对物种苗期性状的影响 ,进而影响生物细胞的生
理 、生化功能。笔者研究离子注入拟南芥干种子对
种子萌发 、低能离子对拟南芥苗体性状及过氧化物
同工酶活性和酶谱变化的影响及关系。
1　材料和方法
1.1　材料
拟南芥菜(Arabidopsis thaliana), Columbia 生
态型 ,来自英国诺丁汉大学拟南芥菜储藏中心。
1.2　离子注入
为减小热效应对拟南芥种子的损伤 ,将拟南芥
干种子用双面胶带粘贴在导热性良好的厚金属片
上 ,面积为 3 cm2 ,种子均匀分布。
用本实验室进口的俄罗斯产 TITAN 离子注入
机进行注入 。注入的离子为氮离子 ,能量 30 KeV 、
剂量分别为 0.5×1017 N+/cm2 , 1×1017 N+/cm2 ,
2×1017 N+/cm2 ,3×1017N+/cm2 ,4×1017N+/cm2 。
注入机的工作条件均为:真空度 5×10-2Pa、采用脉
冲注入(频率 25 Hz)、束流 200 mA 。以未注入处理
的干种子作对照。
华北农学报·2004 , 19(1):82-85
1.3　试验方法
1.3.1　材料栽培　经离子注入后的拟南芥干种子
从双面胶带上用水洗脱 ,然后和对照一起 4 ℃春化
3 d后 ,播种于营养土中 ,单粒播种 , 3个重复 ,每个
重复 100株。室内温度 23 ℃,光照强度 4 000 lx 。
光照每天 16 h 。
1.3.2　生长观测与记录　出苗后 4 d 计算发芽势
(%),10 d对幼苗的发芽率进行观测统计。待供试
材料开花 10 d左右 ,分别测量莲座叶最大叶的叶片
长度 、宽度及株高。叶片长度从茎上着生的叶的基
部量至叶片顶部;叶片宽度为叶的中部宽度;株高为
植株基部至植株的顶部。按公式[ 4] 计算各性状的
损伤度。
损伤度(%)=(对照值-处理值)×100对照值
1.3.3　POD取样与方法　取样:考虑到拟南芥的
生长体形较小 ,在整个生长期间共取样 2次 ,每个重
复及处理取一个样 。生长 20 d左右 、长出 5 ～ 6 片
叶子 、未进入生殖生长时期取样 ,取同一位置的第二
真叶叶片;进入生殖生长期后 ,待花薹抽出后 7 d左
右 ,取苞叶的第 1片叶子。2次都准确称样 0.1 g 鲜
重。
酶液制备:鲜重 0.1 g 的材料 ,加 300 μL 提取
缓冲液 ,液氮充分研磨。4 ℃,12 000 r/min离心 15
min , 取上清液分装于 Eppendof f 管中 , 保存于
-20 ℃冰箱中备用 。
酶活测定及电泳:POD酶活性的测定用愈创木
酚方法[ 5 ,6] ,在 470 nm下测定吸光度。每隔 30 s读
数 1次 ,共读 7次 ,取线性部分计算样品 POD活性 ,
以每分钟 OD470nm增加 0.001所需酶量定为 1 个活
力单位 ,以 ΔOD/(g·min)表示 。
酶活性=OD6-OD1
2.5×0.001(活力单位)
POD同工酶电泳采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,分
离胶浓度 10%,浓缩胶浓度 5%。电泳加样时酶粗
提液与样品缓冲液按体积比为 2∶1均匀混合 ,每次
点样 30 μL。做 PAGE 时 ,每个注入样和对照样 3
次重复 。电泳在冰箱中进行 ,收集胶中电压为 50
V ,分离胶中电压为 100 V ,用醋酸-联苯胺方法进行
染色 。
2　结果与分析
2.1　离子注入对发芽势和发芽率的影响
表 1给出了离子注入后拟南芥各剂量的发芽势
和发芽率。从表中可以看出 ,离子注入后各剂量只
有在 2×1017 N+/cm2 剂量点时发芽势能达到对照
的水平外 ,其余的剂量下的发芽势和发芽率均低于
对照 。t 测验表明 ,剂量 3 ×1017 N+/cm2 , 4×1017
N+/cm2 与对照相比 ,差异达到了显著水平 。从图 1
可以看出 ,离子注入拟南芥的发芽势 、发芽率曲线趋
势是基本一致的 ,都呈先降后升再降的“马鞍型”特
性 。两者均在 2×1017 N+/cm2剂量点达到最大值。
除发芽势在 2×1017 N+/cm2 剂量点能达到对照值
外 ,其余均小于对照值 ,在剂量 3×1017 N+/cm2 与
4×1017 N+/cm2 间可达到半致死剂量 。这说明经
离子处理后的种子萌发力受到一定程度的损伤 ,造
成萌发力的降低。
　　表 1　低能离子(30KeV)注入对拟南芥发芽势
与发芽率的影响(平均值)
项　目 剂量(×1017N+/cm2)
0(ck) 0.5 1 2 3 4
发芽势(%) 61 52 56 61 41＊ 34＊
发芽率(%) 83 67 62 73 54＊ 41＊
　注:＊表示在 0.05水平上差异显著
图 1　低能离子(30 KeV)注入拟南芥后剂量关系曲线
图 2　株高 、叶长 、叶宽的损伤率—剂量曲线
2.2　离子注入对营养器官的影响
从表 2和图 2可以看出 ,经低能离子注入后 M 1
植株的不同营养器官表现为株高降低 ,叶片长度变
短 ,叶片宽度变窄。对株高 、叶长 、叶宽的方差分析
(表 3)可知各剂量间差异都达极显著水平 。各营养
器官中损伤度最大的是株高 ,可达到 43%,叶长的
损伤度和叶宽的损伤度也很明显 。对于不同剂量间
1期 王　燕等:氮离子注入对拟南芥的生理影响初步研究 83　
对植株生长形态的影响的比较可见 ,随剂量的增加 ,
各形态性状的数量指标并不随剂量的增高而下降 ,
而是有一定的波动。但 3种损伤率曲线基本是同步
的 ,即不同剂量对每种器官的损伤率—剂量曲线的
趋势相同 ,并且损伤率都是在 1×1017N+/cm2的剂
量点处达到最小 。
表 2　离子注入对拟南芥 M 1 代营养器官的影响 cm　
性状 剂量(×10
17
N
+/cm2)
ck(0) 0.5 1 2 3 4
株高 10.13 5.63 8.99 7.17 5.92 5.74
叶长 2.18 1.62 1.90 1.80 1.60 1.55
叶宽 0.94 0.72 0.86 0.81 0.67 0.63
表 3　营养器官各性状的方差分析
性　状 差异源 SS df MS F
株　高 剂量间 615.08 5 123.02 29.44＊＊
误差 794.01 190 4.18
总计 1409.09 195
叶片长度 剂量间 8.63 5 1.73 26.56＊＊
误差 11.31 174 0.06
总计 19.94 179
叶片宽度 剂量间 2.16 5 0.43 12.85＊＊
误差 5.84 174 0.03
总计 8.00 179
　注:＊＊表示在 0.01水平上差异显著
从以上可以看出 ,低能离子注入生物体不仅对
其发芽势 、发芽率有影响 ,而且能引起生物体多种性
状的改变。殷凤生等[ 7 ,8]在研究离子注入对烟草生
长发育的影响时认为 ,离子注入对烟草的苗期生长
有一定的影响作用 ,叶片长 、宽 、茎高 、茎粗与对照相
比都达到显著水平或极显著水平;对烟草出苗速度 、
根长 、根幅 、侧根数也有一定的影响 。
2.3　离子注入对 POD酶活性的影响
　　从表 4可以看出 ,生殖生长期酶活比营养生长
期强。两个生长期各剂量处理酶活变化趋势一致 ,
即低剂量处理时酶活增加 ,高剂量处理时酶活下降 。
从图 3可以看出 ,酶活性除了 4×1017 N+/cm2 剂量
点的酶活稍比对照弱外 ,其余的均比对照强。酶活
—剂量曲线的曲线趋势呈先升后降的特征 ,前后 2
次取样样品的 POD酶活均在 1×1017 N+/cm2 剂量
点达到最大值 ,之后随着剂量的增加 POD的酶活均
呈下降的趋势 。这说明了离子注入拟南芥干种子
时 ,低能离子对植株 POD酶活性是有一定影响的。
表 4　离子注入后不同发育时期 POD活性变化
剂量
(×1017 N+/cm2)
过氧化物酶酶活
第 1 次取样(营养生长期) 第 2 次取样(生殖生长期)
0 6.0 20.0
0.5 6.2 25.6
1 15.3 36.5
2 11.3 24.9
4 4.3 22.0
图 3　离子注入后不同发育时期 POD活性变化曲线
图 4　聚丙烯凝胶 POD电泳图谱
2.4　POD电泳
从图 4聚丙烯凝胶 POD电泳图谱可看出 , 2次
样品的酶带均为 4条 ,图谱没有酶谱的增减 ,只有谱
带强弱的不同。营养生长时期的 Ref 0.14处的酶
带非常弱 ,几乎看不到 。酶带的宽窄 、颜色深浅表明
过氧化物酶活性强弱 ,从酶谱的变化可见 ,在剂量
1×1017 N+/cm2下的酶谱的宽度最大 、颜色最深 ,
之后随着剂量的增大 ,酶谱的宽度和颜色深度减弱。
剂量越大 ,酶谱谱带的减弱程度越大 。
POD电泳图谱表现出的酶活力大小和所测定
的酶活性是一致的 ,低剂量处理使酶活增加 ,高剂量
处理酶活性降低 。即都在剂量 1×1017 N+/cm2 有
一上凸的峰 ,之后随剂量的增大酶活性呈下降的趋
势 ,与损伤率 —剂量的关系相反 。
84　 华　北　农　学　报 19卷
3　讨论
离子注入拟南芥干种子 ,在生长形态上有一定
的影响 。尽管有报道[ 9] 指出离子注入能显著的促
进植株的生长发育 ,但是 ,对于拟南芥种子来说 ,离
子注入表现为一定的抑制作用 。
POD酶是一种应激酶 ,可清除胞内 H2O2 ,它通
过催化 H2O2 分解其他底物以消耗 H2O2 ,在阻断自
由基链式反应中起关键作用。离子注入对生物体的
作用像其他辐射(如γ射线)一样 ,可在其经过的径
迹周围产生大量的包括 H2O2 在内的活性氧自由
基 ,在离子注入下损伤使应激酶启动修复系统 ,刺激
过氧化物同工酶合成 。由于低剂量的离子注入对生
物体的损伤小 ,不足以使应激酶修复系统遭到损伤
或破坏 ,在一定范围内 ,剂量增大时 , POD 合成增
多;在较高剂量下(对于拟南芥>2×1017 N+/cm2),
离子注入造成细胞严重伤害 ,致使代谢紊乱 ,酶的合
成受阻 ,对离子造成的损伤不能修复。表现出酶活
性下降 ,在外形上表现出较大的变异。
酶是基因产物 ,是基因表达的结果。因此同工
酶在结构上的差异体现出基因表达异同 ,是认识基
因活动即基因表达的生化指标 。氮离子注入引起同
工酶的变化 , 反映了酶蛋白结构上的差异 ,同时也
反映的基因的变化 ,最后都表现为外部形态性状的
不同。无疑 ,这对于研究离子注入诱发变异的性质
和机理有着重要的意义。
离子注入生物体后酶的变化有可能是离子注入
引起的 DNA变化的结果 ,但是 ,是何种情况的变化
还不清楚 ,另外 ,离子注入生物体所引起的这种酶活
性随剂量不同变化的趋势也是值得进一步研究和探
讨的。
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