全 文 ：中 阁 种 爹 ( c辑 )
第 2 3卷 第 5期 N S C I E CN E IH C IN A( S: r i e s C )2 2 0 0年 10月
拟南芥 A S K I与 C On形成蛋白复合体
并调控雄性不育*
戴良英①* ` 徐领会② 黄大防② 李 构① 罗 宽① 官春云①
(①湖南农业大学植物科技学院 , 长沙 4 10 ! 28 ②中国农业科学院生物技术研究所 , 北京 10 00 81 )
摘要 茉莉素 (茉莉酸及其衍生物)是一类新的植物激素 , 对植物的生长发育以及调
控植物抗性起重要作用 . C口 1 基因已被证 明介导茉莉素所调控的植物育性和抗性 . 用
生物化学和分子生物学手段 , 证 明了 A S K I 与 F 一b o x 蛋白 C o n 发生相互作用 , 并在植
物体内形成蛋 白复合体 . 利用反 义 R N A 策略进行功能`分析 , 表明A S K 了调控植物的雄性
不育 . 这为阐明茉莉素调控植物生长发育的分子机理提供了重要线索 .
关键词 A S K I C口u S C F 泛素连接酶复合体 拟南芥
植物激素对植物生长和发育的各方面都起调控作用 . 茉莉酸及其衍生物 (统称为茉莉素
(J )A ) 是一类新的植物生长调节剂 , 广泛存在于植物中 , 它是由亚麻酸经脂肪氧合酶途径合成
的 , 对植物生长发育的许多过程如根的生长 、 果实成熟 、 卜 块茎增大及花粉形成等有重要影响 .
茉莉素还作为伤信号来调控植物对逆境 、 伤害 、 病原物侵染和害虫侵袭的反应 [ ’ 一6] .
尽管茉莉素对植物的影响已有广泛的研究 , 但对其作用的分子机理研究极少 . 茉莉素信
号传导链已通过一些对茉莉素不敏感的突变体如 j “ : 了, 〔丫 , i] 一了, ij 。 ] 和 j in4 等 17 一 ’ 。 } , 以及 2 个对
茉莉素极度敏感的突变体 。 ex ] 和 。 。 、产“ , ` “ }的分析进行了研究 , 其 中 `、 io 了一 I 是通过筛选抗冠毒
素得到的突变体 , 它不仅对冠毒素不敏感 , 而且对茉莉酸 甲酷也不敏感 , 还表现为雄性不育 10] .
c ol 了基因是茉莉素传导链中分离的第 1 个调节基因 , 令人惊奇的是 , 它与植物的育性和抗性
两类完全不同的性状有关 [ ’ 3 } . 氨基酸序列分析表明 , c( )l 1含有两个重要的功能域 , 即 F 一 bo x 区
域和富含亮氨酸重复序列 . 大量研究表明 , 人和酵母 、 线虫等动物都含有 F 一 b ox 蛋白 , 它与
s K PI 和 c d c 5 3( c u il n )形成泛素连接酶复合体 , 称 S C F 复合体 , 其作用是选择性地结合降解蛋
白参与泛素蛋 白降解途径 , 而泛素蛋白降解系统可以调控许多重要过程 , 如细胞循环 、 信号传
导 、 基因转录 、 胞吞作用以及免疫反应 、 雄性不育和细胞程序化死亡等 [ ’ 4 , ” ] . 由于 c o l 含有
F
一
b o x 功能域 , 因此 , 推测 C口 jI 很有可能是 s c F 的组成成分 , 介导茉莉酸信号传导途径 .
本研究以 c 口刀 为诱饵采用酵母双杂交分析体系:筛选拟南芥 c D N A 文库 , 分离和鉴定
C o l 互作基因 , 得到 c 0 I 互作基因 4 个 , 其中 A S K I 与 s K P] 高度同源 , 并从遗传学 、 分子
生物学等方面证明 A S K I 和 C Ol l 形成蛋 白复合体 , 一起调控植物育性 .
2 0 0 1
一
10
一
0 8 收稿
, 教育部高等学校 国家重点实验室访问学者基金 、 湖南省生命科学联合研究 中心基金 、 湖南省自然科学基金康 t准号
9 9 Jz y 2 00 16 )和湖南省教委青年基金 (批准号 9 9 B 0 7 )资助项 目
* *
E
一
m a i l
:
fy t o P a t h@ Pu b l l e
.
e s
.
h n e n
中 国 科 学 (C辑 )第 2 3卷
1材料与方法
L l酵母双杂交分析体系
L e
x A
一
cl ol重组质粒 : 将 P R C扩增的 C ol构建于质粒 P l x eD N A A特异结合域 (BD )之后
而成 (l Cn ot eh c ).将茉莉酸处理过和未处理过的拟南芥组织中分离的 mR N A反转录的 cD N A构
建于质粒 p 4 B2D A转录激活域D A ) (之后 , 得靶蛋白 c D N A 文库 . 将 L e x A 一 c o n 首先导人到含
报告质粒的酵母 (s a e c h a or m夕e e s e e er v is ia e )菌株 E G Y 4 8 中 , 随后把 p B 4 2 A D e D N A 文库 D N A
转人含 L ex A 一 C o n 和报告基因的 E G Y 48 中 . 得到的 5 0 0 万个转化子涂布于选择培养基 (2 %
半乳糖八% 棉子糖 s D 人U ar 人iH s/ 一 rT P/ 一 L e u/ X 一 G al )中培养 , 得到的蓝色阳性克隆按照生产商的方
法 (C l o n te c h , e a t a l o g n o . K 1 6 0 9 一 l )进行检测 , 用 p B 4 2 A D 载体引物进行 p C R 扩增 , 对 p C R 产物
进行 R sa l 限制性 内切酶酶切和杂交后将 c D N A 归群 , 在每一群中选一代表菌落对其 c D N A 进
行测序 .
L Z A SKI 在酵母中的表达
将导人了 B a m H I 酶切位点的 A S K 了 P C R产物构建于酵母表达载体 p E S P 一 l (S t ar t ge c n e )G S T
之 后 , 得 重 组质 粒 p E s P 一 A S K I . 然 后 转化 酵 母 S e 人iz o s a c e h a or m夕e e 、 尹 o m 吞。 s P 一Q o l , 按
s tr at e g e n e 手册 ( 19 97 )的方法进行 G S -T A S K I 融合蛋白表达和纯化 .
L 3 C O l l 在大肠杆菌中的表达
将 C o l ] 克隆到 p E T l l a 载体中 , 得 p E -T c o z z 重组质粒 . 转化 万s c人e r i e八ia e o l i x L一 0 o o l d ,
加 IP T G 诱导蛋白表达 , 用 S D S 一PA G E 方法纯化 C O H 蛋 白 .
1
.
4 A SK I
,
C O l l 抗血清制备
分别取 A S K I , C O l l 表达蛋白 4 0 0 林L ( l 林g单L )加同体积的 F r e n u n l ’ s佐剂 , 用注射器充分混匀 ,
注射兔子 , 每 10 天 1 次 , 共 5 次 , 静脉采血 , 低速离心 , 吸取血清 , 分装试管 , 保存于一20 ℃冰箱 ,
用 E lL s A (IT T R E 板 )测定抗血清的专一性及效价 , 二抗为辣根过氧化物酶(H R )P 交联的羊抗兔 gI G
加底物反应显色后测量 4 16 n m 的光吸收值 .
1
.
5 S D S
一
P A G E 和 W e s t e r n 印迹
蛋 白质样品经 S D S 一队G E 后 , 电转至 H y b o n d E C L 膜上 ( A m e r s h a m ) , 用 P o n e e a u s 染色检
查转膜效果 , 并作记号 , 4 ℃将膜放人 w a tm an 纸 中干燥 , 用 M e 0 H 湿润后 , 转入 1 x T T B S脱脂
牛 奶液中 (5 0 m m o l /L T r i s , p H 8 . 0 , 0 . 5 m o lz L N a C I , 0 . 1%物 e e n Z o , 1% d r i e d Sk im e d M i l k
(M a r v e l ) )
, 在 4 ℃房间内过夜 , 倒掉处理液 , 用 1 x T T B s 洗 3 次 , 加人适量的抗血清 ( 1 : 10 0 0 )
后 , 室温下 1趁 h , 用 1 x T T B s 牛奶液洗膜 5 次 , 再加交联辣根过氧化物酶的羊抗兔 gI (G 厂
2 0 0 0 )室温下 l砚 h , 用 1 x T B s 牛奶洗膜 3 次后 , 再加 T B s 牛奶液 (同 T T B s , 不含 孙 e e n Zo )
和辣根过氧化物酶底物 ( 10 m L 中含 30 . 7 m L o . l m ol 几 柠檬酸醋酸缓冲液 , 1 9 . 3 m L 0 . 2 m ol 几
N a H Z p O 4
,
4 0 m g D A B
,
10 林L 3 0 % H Z O Z , 5 0 m L 去离子 H Z O )显色后 , 用水漂洗 , 转人磷酸缓冲液
中 , 用加强化学光吸收系统 (PI E R C )E 免疫检测 .
1
.
6 C O l l
,
A S K I 共免疫沉淀
取拟南芥花适量 , 加预冷提取液 (5 0 m m o l几 N a 3PO 、 p H 7 . 0 , 2 0 0 m m o l几 N a e l , 10 m m o l几
M g e lZ
,
10% 甘油 )以及蛋白酶抑制剂 C o e k t a i l (R o e h e )适量 , 在冰浴中研磨成匀浆 , 4℃离心 5 m i n ,
上清液为蛋白提取液 . 取 5 0 林L a 一 e o l l 抗血清加人到 2 0 0 林L A 蛋白 s e p h a r o s e 4 速流珠 (p r o t e i n
第 5期 戴良英等 :拟南芥 A S K I与 C Ol形成蛋白复合体并调控雄性不育
A
一
s ep h ar o s e4F a s tF l o wb e ad s
,
A m e r s h a m )结合 , 4 ℃轻轻振动 l h , 然后加人到 2 m L 含 4 m g 蛋白的
植物蛋 白提取液中 , 4℃反应 12 h , 轻轻摇动 , 1 3 0 0 x 9 4 ℃离心 30 5 弃上清 . 加人洗涤缓冲液 (蛋
白提取液 )复悬 s e p h a r o s e , 4℃ , 2 0 m i n , 13 0 0 0 x 9 4 ℃离心 3 0 5 弃上清 , 重复洗涤 2 次 . 加人
s D S
一蛋白样品液 5 0 林L 煮沸 5 m i n . 室温离心 1 3 0 0 0 x g , 3 0 5 , 沉淀 A 蛋白一 S e p h a r o s e , 上清液
移至另一干净管中 , 取适量进行 s D s 一队 G E , 然后用 a 一 c ol l 和 a 一 A s K I 抗血清进行 We st er n 印
迹分析 .
L 7 A SKI 反义基因构建及拟南芥的转化
将 A S K ] 克隆进 p R o K Z 质粒并在反义方向上受 c a M V 35 S 启动子的调控 (图 l) , 构建了反
义 A s K I 重组载体 , 然后电击转化 A g or b ac t o ir u m tu m aef o ien : M 90 , 最后用农杆菌介导 的真空
渗透方法转化拟南芥植株 l ’ “ 1 . 转 A N IT 一A s K I 基因植株种子在含 50 m g/ m L 卡那霉素的选择培
养基上筛选 . 对含有反义 A KS 了的 20 株转基因植株通过 P C R 和 oS ut h er n 杂交分析等作进一步
鉴定 .
B a m H I B a m H I
图 l 反义 A s K ] 基因载体构建
2 结果与讨论
.2 1 酵母双杂交筛选
以 C O l 为诱饵 , 采用酵母双杂交体系筛选拟南芥
c D N A 文库 , 得到了 3 0 多个阳性克隆 , 分属于几个不
同的群 (图 2) . 对每一群中的代表 c D N A 进行测序分析
表明 , 其中有 56 个阳性克隆都是 A S K I 基因 , A S K 了基因
是 拟 南芥 中 与 S K p l 的 同 源 基 因 , 以 前命 名 为
A r s仰 z 〔’ 7一 2 0 J . 图 2 看 出 A s尤 z 与 e o 了z 强烈互作 .
因 C O n 中存在 F 一 b ox 功能域 , 故推测 C O l 可能与
A S K Iv/ e e otr PL碑协
A S K I /C O l l
P B 4 2 A D /C O l l
图 2 C O x l 与 A S K I 互作图
S K PI 类似蛋 白组成 s C F 泛素连接酶复合体 . 实际上 , 得到的 A S K I 与酵母和人类的 s K p l 相
似 12 ’ 一23J . 因此 , 我们运用现代生物技术和分子生物学方法着重研究 A s K I 基因 .
4 6 k D 一
图 3 G S不 A S K I 融合蛋白 S D S 一PA G E 图
1码 分别示诱导表达产物经 G S T 柱处理后第 1礴 次洗
脱液 ; 每泳道点样 10 林L , l 次性洗脱量为 2 m L ; 5
示诱导蛋白表达提取物未纯化样 品 ; 6 示抑制蛋白表
达提取物未纯化样品
.2 2 G S -T A S K I 融合蛋 白的表达和纯化
为 了进行共免疫沉淀试验 , 我们 完成 了
A S K] 在酵母中的表达与纯化 , 并制备了抗血清 .
G S-T A SK I 融 合 蛋 白 的 表 达 及 纯 化 产 物
S D S
一
PA G E 结果见图 3 , G S -T A s K I 融合蛋白能
够被诱导表达 (图 3 中的 5) , 而抑制处理的则没
有 G S -T A S K I 融合蛋 白表达 (图 3 中的 6) , 融合
蛋白经 G s T 柱纯化后 , 只剩下融合蛋 白一条带 ,
洗脱 4 次基本能洗干净 (图 3 中的 1碎 ) . 融合蛋
白分子量大约为 4 6 k u , 因 G S T 为 27 ku , 表明
A S K I 蛋白约为 19 ku , 这和其克隆片段大小相
中 国 科 学 ( C辑 ) 第 3 2卷
吻合 .这些结果表明 I K A S确能在酵母中正确表达 , 并与 G S T 形成融合蛋白 .
2 .3 抗血清专一性检测
以酵母 (5 . p o m b e )中表达的 G S -T A S K I 融合蛋白 (图 3 )和在 E . 。 0 21中表达的 C O l l 蛋白 (结
果未显示 )为抗原制备了相应的多克隆抗体 a 一A S K I 和 a 一 C O n , 对其专一性用 W己s t er n 印迹分析
进行了检测 (图 4) . a 一 C Ol l 抗血清可以从野生型植株蛋 白质中检测到一条分子量为 65 ku 的
C Ol l 专一带 , 而 co ij 一 I 突变体不能得到这一条带 . a 一 A S K I 抗血清可以从野生型植株中检测到
lZ ku 的带 , 而预先用 A S K I 蛋 白结合 的则检测不到相应的带 . 这些结果表明 , a 一C Ol l 和
a
一
A s KI 抗血清具有很强的专一性 .
.2 4 C o n 与 A S K I 在植株体内的相互作用
先用 a 一 C O l 抗血清分别免疫沉淀野生型和 co il 一了突变体植株的蛋 白质提取物 , S D S 一队 G E
分离后 , 再用 a 一 A S K I 的抗血清免疫杂交并进行检测 (图 5) , 用 a 一 A S K I 抗血清从野生型植株蛋
白质 a 一C O n 复合体中能检测 出 A S K I , 表明在 a 一C o n 免疫复合体中除含有 C O l 蛋白外 , 还
含有 A S K I 蛋白 , 由于 co i了一 1 突变体中没有 C O l 蛋 白 , 因此 , 尽管 co i l 一 l 突变体中有 A S K I
蛋白 , 用 a 一 A S K I 抗血清从 co i l 一 1突变体蛋白质 a 一 COl l 沉淀复合物 中也检测不到 A S K I . 这些
结果表明 , C o n 和 A s K I 在植物体内形成复合体 .
l 2
WT 认厂T默纂弩艺: 二
4
c o i l
一
l
提取物 以一C O l l I P
W T
c o 护l一 1 W T e o i l一 l
C O l l辛 a
一
C O l l
A S K I ~
蘸黝黔粗剔蘸瓤夔刻以 一A S K IA l l t i一A SK I A S K I预免疫 A n t i一C O I ]
图 4 a 一 C O n , a 一 A s K I 抗血清专一性分析
野生型植株蛋白 ( l 一3) 和 co i l 一 ! 突变体植株蛋白 (4) 分别与
a
一
A s KI 抗血清 (l ) 、 a 一 c ol l 抗血清 (3 和 4) 反应结果 , 2 示
A S K I 结合的价 A S K 】抗血清反应结果
图 5 c o l , A S K I 共免疫沉淀试验
左框示拟南芥野生型植株蛋白和 co i l 一 1 突变体植
株蛋白电泳结果 ; 右框示用 a 一 C O l 抗血清免疫沉
淀上述 蛋 白经 s D s 一 P A o E 分离 后的 W e s t e r n
印迹结果
.2 5 A S K I 反义转化导致拟南芥雄性不育
C口1 调控植物的育性 , 。 io 了一 I 突变体表现出雄性不育 , 抗性丧失 . 如果 C O n 与 A S K I 在
植物体内形成复合体 , 那么 A S K 了突变体应该与 。 io 了一了的表现型完全或部分相同 . 为研究 A S K I
的功能 , 我们采用反义 R N A 技术将 A S K 了反义转化拟南芥 , 分析了 20 株转反义 A S K I 基因植
株 , 其中 巧 株表现为雄性不育 , 用野生型植株的花粉与其杂交即可恢复结籽 . A S K I 基因的表
达降低到一个非 常低的水平 (图 6 ( b) ) . 因此 , 我们认为 A SK I 可能与植物雄性育性有关 , 同时 ,
这些不育植株在其他方面 , 如对茉莉酸的敏感性反应及抗性方面 , 与野生型植株相同 〔” } .
拟南芥基因组 中有数个 sKP I 同源基因 , 这些基因高度同源 , A s K 了基因是其中之一 l ’ 7 1 ’ 8 ] .
为排除 A N IT 一A S K I 转基因植株导致雄性不育是 由于对其他 S K p l 同源基因影响的结果 , 我们将
与 A S K I 高度同源的 A SKZ 基因反义导人野生型植株 【’ 7 , ’ “」, 检测 了 53 株 A N IT 一A SKZ 转基因植
株 , 发现所有的植株均 表现可育 . 图 6( a) 是 A N IT 一A s K I 转基因植 株的雄性不育表现型与
第 5期 戴良英等: 拟南芥 A S K I与 cn o形成蛋白复合体并调控雄性不育 40 3
A NT I
一
A SZ K可育表现型的花序 比较 .
AT I N
一
A S犬 I AT NI一 AZ S K
一园 S代 l匕
哪嘟郡田顶酬
瓢象蘸
图 6转反义 A S K了和反义 A SZ K基因对拟南芥的影响
An ti叭 S兀 1表现雄性不育 ; An t一 A S兀 2表现育性正常 ( ( a ) ), (b ) 和 ( e )示转基 因植株 W e s t e r n 检测
转 AN IT 一A S K 了雄性不育植株在生长末期可结少量的籽 , 检测其 F Z 和 3F 代植株也表现雄
性不育 . 这些结果表明 , A S K 了的负 向调控可引起雄性不育 , 正与 co i l 一 1突变体的雄性不育相同 .
与我们的结果相一致的是 , aY ng 等人【’ ”〕用 D : 转座子诱变 A s K 了得到的 as k一 1 突变体也表现雄
性不育 , 这就更进一步证明 A S K I 与植物 的育性有关 .
致谢 感谢新加坡分子农业生物研究所谢道 听教授 、 英国 E as t A ng l ia 大学 M . iN et o -
R os tr o 博士和 J . T盯n e : 教授 、 国家医学遗传学重点实验室夏家辉院士对本工作提供的帮助 .
参 考 文 献
2
3
4
5
6
7
8
9
l 0
S t a s w iC k P E
.
J a s m o n a t e
,
g e n e a n d fr a g r a n t s ig n a l s
.
P l a n t P h y s i o l
,
1 9 9 2
,
9 9 : 8 04 一 80 7
S e m b d n e r 以 P a r th i e r B . T h e b i o e h e m i s t r y a n d t h e Ph y s i o l o g i e a l a n d m o l e e u l a r a e t i o n s o f j a s m o n a t e s . A n n u R e V P l a n t
P h y s i o l P l a n t M
o l B i o l
,
1 99 3
,
4 4 : 5 69 ~5 89
B l e e he rt s
,
B r o d s e h e lm W, H
o ld e r S
,
e t a l T h e o e t a d e e a n o i e P a th w a y
一
s ig n a l m o l e e u l e s fo r th e r e g u l a t i o n o f s e e o n d a r y
P a t h w a y s
.
P r o e N a t l A c a d S e i U S A
,
19 9 5
,
9 2 ( 10 )
: 4 0 9 9码 10 5
C r e e lm a n R A
,
M
u l l e t J E
.
B i o s y n t h e s i s a n d a e t i o n o f j a s m o n a t e s i n P l a n t s
.
A n n u R e v P l a n t P h y s i o l P l a n t M o l B i o l
,
19 9 7
,
4 8 :
3 5 5~ 3 8 1
Z h a o D
,
M
a H
.
M a l e fe r t i l i t y : A e a s e o f e n z ym e id e n t i t y
.
C u r B i o l
,
2 00 0
,
1 0 : R 9 0 4~R 9 0 7
R e y m o n d P
,
F ar m e r E E
.
Ja s m o n a t e a n d s a l i c y l a t e a s g l o b a l s ig n a l s fo
r d e fe n s e g e n e e x P r e s s 一o n
.
C u r r O Pi n P l a n t B i o l
,
1 99 8
,
l : 40 4喇 41 1
S t a s w i e k P E
,
S u W, H
o w e l l 5 H
.
M
e J A in h ib i ti o n o f r o o t g r o w th a n d in d u e t i o n o f a l e a f P r o t e i n a r e d e e r e a s e d i n a n
A ar b id
O P s i s t h a l亡a 月 a m u ta n t . P r o c N a t l A e a d S c i U S A, 19 9 2 , 8 9 : 6 8 3 7~6 8 4 0
S t a s w i e k P E
,
uY
e n G Y, L e h m a n C C
.
Ja s m o n a t e s i g n a l i n g m u t a n t s o f A r a b i d op
s i s a r e s u s c e Pt i b l e t o t h e 5 0 11 fu n g u s P y th i u m
i r e g u l a r e
.
P l a n t J
,
19 9 8
,
15 : 7 4 7 ~ 7 5 4
F e y s B J F, B e n e d e t r C E
,
p e n fo ld C N
,
e t a l A ra b id叩 5 15 m u t a n t s s e l e c t e d fo r r e s i s t a n c e t o t h e P hy t o t o x i n c o r o n a t i n e a r e
m a le s t e r i l e
,
i n s e n s i t i v e t o m e t h y l J a s m o n a t e
,
a n d r e s i s t a n t t o b a e t e r i a l Pa t h o g e n
.
T h e P l a n t C e l l
,
1 99 4
,
6 : 7 5 1、 7 5 9
B e r g e r S
,
B e l l E
,
M u l l e t J
`
E
.
WT
o m e t h y l j a s m o n a t e
一
i n s e n s i t i v e m u t a n t s s h o w a l t e r e d e x P r e s s i o n o f A t v sP i n r e s Po n s e to
m e th y l j a sm o n a t e a n d w o u n d in g
.
P l a n t P h y s i o l
,
19 9 6
,
1 ] l : 5 2 5~5 3 1
40 4中 国 科 学 ( c辑 )第 犯 卷
l l
l2
l3
E li ls C
,
T u r n e r J G T he A r a b zd op
s i s m u t a n t e e v l h a s e o n s t i t u t i v e ly a e t i v e J a s m o n a t e a n d e t h y l e n e s i g n a l Pa t h w a y s a n d
e n h a n e e d r e s i s t a n e e t o P a t h o g e n s
.
P l a n t C e l l
,
2 0 0 1
,
13 (5 ) 1 ( )2 5司 0 33
X u L H
,
L i u F Q
,
W a n g Z L
,
e t a l
.
A n A ar b id op
s i s m u t a n t e e x l e x h ib i t s c o n s t a n t a C e u m u l a t i o n o f j a sm o n a t e
一
r e g u l a t e d A rV S P,
T h 12
.
1 a n d P D F I
.
2
.
F E B S L E T T ER S
,
20 0 1
,
4 9 4 ( 3 ) : 1 6 1 ~ 16 4
X i e D X
,
F e y s B F, Ja m e s S
,
e t a l
.
C O l l : A n A ra b i d o P s i s g e n e r e q u i r e d fo r j a s m o n a t e
一
r e g u l a t e d de fe n s e a n d fe r t i l i t y
.
S e i e n e e
,
] 9 9 8
,
2 8 0 : 10 9 1一 109 4
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P l a n t s
.
C R A e a d S e i P a i r s
,
L i fe S e i e 幻e e s , 19 9 3 , 3 16 : ] 19 4 一 1 19 9
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,
19 9 9
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2 0 : 4 3 3~4 4 5
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19 9 9
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s e P a r a t i o n
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19 9 9
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9 6 ( 20 ) : 1 14 16 一 1{ 4 2 1
P r o a t R o n
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m e r i s t e m a t i e e e l l s
.
P l a n t a
,
199 8
,
2 0 4 : 34 5 一 35 1
B a i C
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,
e t a l
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C e l l
,
19 9 6
,
8 6 : 2 6 3~2 7 4
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P r o g r e s s i o n
.
C e l l
,
19 9 6
,
8 6 : 2 7 5一 2 8 5
z h a n g H
,
K o b a y a sh i R
,
o a l a k t i o n o v K
,
e t a l p 一g s k p l a n d p4 5 s k p Z a r e e s s e n t i a l e l e m e n t s o f t h e e y e xi n : A 一 e D K s 一 p ha s e k一n a s e
C e l l
,
19 9 5
,
82 : 9 15 ~ 9 2 5
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