全 文 ：第 33卷　增刊 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 33 Suppl.
2005年 8月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Ag ri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) Aug. 2005
拟南芥抗病基因克隆的策略及利用
瓮巧云 ,邢继红 ,董金皋
(河北农业大学 真菌毒素实验室 ,河北保定 071001)
　　 [摘　要 ]　生物技术的快速发展为植物抗病基因的克隆奠定了坚实的基础。克隆抗病基因不但有利于深入研
究植物与病原物的分子互作机理 ,而且为植物重要病害的防治提供了有效措施。迄今为止 ,在拟南芥中已经克隆了
十几个抗病基因。对拟南芥抗病基因的种类和特性、克隆策略以及克隆抗病基因的应用前景进行了综述。详细介绍
了定位克隆技术和转座子标签技术的原理及其在拟南芥抗病基因克隆中的应用。
[关键词 ]　拟南芥 ;抗病基因 ;定位克隆技术 ;转座子标签技术
[中图分类号 ]　 Q949. 748. 3; Q785　　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]　 1671-9387( 2005) S0-0220-05
　　拟南芥 ( Arabidopsis thaliana)为十字花科芸薹
属植物 ,具有个体矮小、种子产量大、生活周期较短、
基因组小 ( 125 Mb)且基因组的全序列测定工作已
经完成等优点 ,被誉为植物中的“果蝇”。在拟南芥中
存在广谱的抗病基因 ,克隆这些抗病基因并研究其
抗病机制 ,不但有利于深入研究植物与病原物的分
子互作机理 ,而且克隆的抗病基因也可以为植物抗
病育种和重要病害的有效控制提供丰富的抗性资
源。
1　拟南芥抗病基因的种类及特性
1992年两个不同的研究小组分别从拟南芥中
成功地克隆了 AB I3　 [1 ]和 FAD3　 [2 ]基因。 迄今为
止 ,人们从拟南芥中已经克隆到了十几种抗病基因。
从 1994年到 1996年人们已从拟南芥中克隆到
了抗细菌性斑点病基因 RPS2 , RPS5和 RPM1 ,上
述 3个基因均属于抗病基因中的 LZ-N BS-LRR类
型。 1997年到 2000年又克隆了霜霉病抗性基因
RPP1 , RPP5 , RPP8 ,RPP13和系统获得性抗性基
因 N PR1 ,及抗多种真菌和细菌的基因 Pad4。
RPP13基因也属于抗病基因中的 LZ-NBS-LRR类
型。RPP13基因 LRR域的氨基酸具有多态性 ,而且
在寄主与病原物长期的互惠作用中氨基酸多态性一
直保持 [3 ]。2000年还克隆到了 HRT基因 ,该基因属
于抗病基因中的 LZ-NB-LRR类型。HRT过度表达
的植株接种 TCV后产生很小的坏死斑或不产生过
敏性坏死反应 ,表现抗病反应。最近几年内克隆到的
抗病基因有 RAC1 , RPP2 , RTM1 , RTM2 , DND1
和 DND2等。
RAC1 [4 ]是从拟南芥 Ksk-1生态型中克隆到抗
白锈病病菌 ( Albugo candida )菌株 Acem1的抗病
基因 ,该基因属于 TIR-N B-LRR类型的抗病基因 ;
NDR1编码 660 bp的开放阅读框架 ,是拟南芥抗病
原真菌和细菌所必需的基因 ,该基因是由病原菌侵
染后诱导表达的 ,在对各种病原菌识别信号的相互
作用中具有一定的功能 [ 5] ; RPS4 ,定位于拟南芥第
5条染色体上 ,该基因属于 TIR-NBS-LRR类型的
抗病基因 ,含有 RPS4基因的拟南芥植株对含有
av rRPS4的 Pseudomonas syringae具有抗病性 [6 ];
RPP2 ,定位于拟南芥第 4条染色体上 200 kb左右 ,
它含有 4个相邻的 TIR-NB-LRR基因 ,含有 RPP2
的拟南芥对 Peronospora parasitica pv cala 2具有
抗病性 [7 ] ; SON1编码一个新的含有 F-box基元的
蛋白 ,该蛋白是 E3泛激素连接酶合成物中具有特
异决定性的一个成分 , SON1通过泛激素蛋白体途
径引发了一种不依赖于 SAR的保卫反应 [8 ]。
RTM1和 RTM2基因能够限制烟草蚀纹病毒
( TEV )的远距离传播 [9, 10 ] ,通过对野生型植株和等
位基因突变体进行转基因互补和序列分析鉴定了
RTM2基因的产物。 RTM2基因的产物是一个多域
蛋白 ,该蛋白含有与植物小热激蛋白 ( heat shock
proteins, HSPs)相似的 N-末端域 ,而且 C-末端域含
有多个重复序列。系统分析表明 , RTM2小 HSP的
类似域与已知的 5种植物小 HSPs的进化完全不
[收稿日期 ]　 2005-07-08
[作者简介 ]　瓮巧云 ( 1979- ) ,女 ,河北定州人 ,硕士 ,主要从事分子植物病理学研究。
[通讯作者 ]　董金皋 ( 1963- ) ,男 ,河北邢台人 ,教授 ,主要从事真菌毒素与植物病生理研究。 E-mail: d ongjg@ 21cn. com
同。 RTM2基因的表达并不是高温诱导 ,而且与种
子的耐热性无关 ; RPW8 (抗白粉病基因 )是一种特
殊类型的抗病基因 ,它含有两个显性基因 RPW8 .1
和 RPW8.2。含有 RPW8基因的拟南芥对白粉病菌
具有广谱抗性 [11, 12 ]。
拟南芥基因组中含有一个类似 NDR1 /HIN1
的 N HL基因族 ,该基因族与 NDR1和烟草 HIN1
基因具有同源性。 N HL3编码质膜蛋白 ,是 N HL
基因家族中的一员 ,且与寄主的保卫反应有关。转基
因植株中 N HL3 的过度表达提高了对 Pseu-
domonas syringae pv. tomato DC3000的抗性 [13 ]。
活性氧 ( ROS)是过敏性坏死反应的一个重要成
分。 ROS的过度积累会造成细胞死亡 ,从而影响植
物对病原菌侵染的限制作用。光呼吸作用能够减少
叶绿体中活性氧的产生 ,还能够减轻氧化作用造成
的损失。SHMT1已经被克隆 ,编码光呼吸作用中的
丝氨酸羟甲基化转移酶。该酶在控制由生物压力和
非生物压力 (如高光照、高盐条件等 )引起的细胞死
亡中起重要作用 [14 ]。
拟南芥 dnd突变体受到病原菌侵染后不表现
过敏性坏死反应 ( HR)症状 ,但是仍然保持抗病性。
dnd1和 dnd2突变体分别由 AtCNGC2 (编码 cyclic
nucleotide-ga ted ( CN G) ion channel )和 AtCNGC4
( second cyclic nucleo tide-ga ted ( CNG ) ion
channel )突变得来。目前 ,采用图位克隆技术已经分
离到 DND1和 DND2基因 , DND1 与 AtCNGC2
编码的蛋白一样。 dnd突变体为分析保卫信号的作
用机理提供了独特的遗传背景 [ 15, 16 ]。
在拟南芥抗逆性方面也取得了一定的研究进
展。 拟南芥 ZAT ( Zn transporter of Arabidopsis
thaliana)基因编码的蛋白含有 398个氨基酸和 6个
跨膜域。含有 Z AT的植株提高了耐锌性 ,且在高锌
浓度下根部锌的浓度也提高了。ZAT的有效性能够
帮助了解植株体内锌的动态平衡保持机理和植株的
抗病机理。植株的耐寒性与 COR ( co le-regula ted)基
因有关 , COR基因是由 C-repeat /drought-respon-
siv e element ( CRT /DRE) DN A调控元素调节的。拟
南芥 CBF1 (结合在 CRT /DRE序列上的转录激发
子 )表达增强能够使非耐寒性拟南芥植株提高耐寒
性。CBF1可能是耐寒反应的调控子 ,能够控制 COR
基因的表达 ,从而提高植株的耐寒性 [ 17]。 AtGRP9
编码富含甘氨酸的蛋白 ,在拟南芥中 AtGRP9可能
与植株的耐盐性有关 [18 ]。
2　从拟南芥中克隆抗病基因的方法
抗病基因的克隆一般采用产物导向法、鸟枪射
击法、扣除杂交法、酵母双杂交系统、外显子捕获法、
RNA指纹法、转座子标签法和定位克隆法等技术。
在拟南芥中主要利用定位克隆技术 ( po sitional
cloning )和转座子标记技术 ( transposon tagging )进
行抗病基因的克隆。
2. 1　定位克隆技术
定位克隆 ( posi tional cloning ) ,又称图位克隆
( map- based cloning ) ,是 1986年首先由剑桥大学
的 AlanCoul-son提出的。定位克隆技术的基本原理
是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因
座 ,在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位
的基础上 ,使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛
选 DNA文库 (包括 YAC, BAC, TAC, PAC或 Cos-
mid文库 ) ,从而构建目的基因区域的物理图谱 ,再
利用此物理图谱通过染色体行走 ( chromosome
w alking )逐步逼近目的基因 ,或通过染色体登陆
( chromosome landing )的方法最终找到包含该目的
基因的克隆 ,并通过遗传转化试验证实目的基因的
功能。
定位克隆技术的环节: ①目的基因定位 ( map-
ping the target g ene)。利用分子标记技术在一个目
标性状的分离群体中把目的基因定位于染色体的一
定区域内。分子标记是一个特异的 DNA片段或能
够检出的等位基因 ,对它的有效利用即可达到图位
克隆基因的目的。迄今为止 ,已有几十种技术可用于
分子标记的筛选 ,常用的有 RFLP标记 ( rest riction
f ragment leng th polymo rphism )、 RAPD标记 ( ran-
dom amplified polymo rphic DN A )、微卫星标记
( micro satelli te DN A)、 AFLP标记 ( Amplified frag-
ment leng th polymorphism)、 SSLP标记 ( Simple se-
quence leng th po lymo rphism )等。 分子标记技术与
近等基因系或集团分离分析相结合 ,可以快速地把
目的基因定位于基因组中某染色体的一定区段上。
在初步定位的基础上 ,利用高密度的分子标记连锁
图对目的基因区域进行区域高密度分子标记连锁分
析 ,以精细定位 ( fine mapping或 high resolution
mapping )目的基因。②在精细定位目的基因的基础
上 ,构建目的基因区域的物理图 ( physical map)来
确定目的基因区域的近似物理距离和遗传距离的比
值 ( kb /cM )。③目的基因的筛选和鉴定。目的基因的
筛选和鉴定是定位克隆技术的最后环节 ,找到与目
221增刊 瓮巧云等: 拟南芥抗病基因克隆的策略及利用
的基因紧密连锁的分子标记并鉴定出分子标记所在
的大片段克隆后 ,以该克隆为起点进行染色体步行 ,
逐渐靠近目的基因。当遗传连锁图谱指出基因所在
的特定区域时 ,即可取回需要的克隆 ,获得目的基
因。
定位克隆技术的优点在于不需要知道基因产物
的功能 ,也不需要知道产生某表型的生化、生理和病
理过程。 但是定位克隆技术也存在以下局限性:首
先 ,目的基因的定位依赖于分子标记。要精确定位目
的基因 ,就要不断开发新的多态性高的分子标记。其
次 ,染色体步行构建跨叠克隆群时 ,当必须经过 1个
无法克隆的片段时 ,步行的过程会被打断 ;当克隆的
一端是重复序列时 ,步行的方向就会步入歧途。最
后 ,定位克隆只能将与某一表型相关的基因克隆 ,而
对基因功能的认识只能依赖于与已知功能基因产物
的序列进行同源性比较才能获得。对基因功能进一
步的研究还需要借助于其他手段 ,如用酵母双杂交
系统分析产物与胞内其他蛋白质的相互关系 ,用突
变体分析 ( mutant analysis)和基因剔除 ( g ene
knockout )来研究产物在代谢途径中的可能位置等。
2. 2　转座子标记技术
转座子是 McClintock [19 ]首先在玉米中发现的 ,
以后在金鱼草、飞燕草、甜豌豆、细菌、酵母、拟南芥
和一些多细胞绿藻等植物中也发现了转座子的存
在。转座子是基因组中一段可移位的 DNA序列 ,可
通过切离、重新插入等步骤从基因组的一个位置转
移到另一个位置。转座子分为以 DNA-DNA方式转
录的转座子和反转录转座子 ( ret ro-transposon)两
大类。 目前 ,在植物中利用的转座子有 Ac /Ds, En /
Spm和 Mutator,其中应用最多的是 Ac /Ds双因子
系统。 Johal等 [20 ]利用转座子克隆了玉米抗圆斑病
基因 HM1 ,这是第一个克隆的功能产物未知的植
物抗病基因 ; Arats等 [21 ]利用 En /Spm克隆到拟南
芥菜的一个雄性不育基因 ;利用转座子标记技术克
隆到的拟南芥抗病基因有 Eds1。
转座子标记技术的主要步骤: ①采取农杆菌介
导等方法把转座子导入目标生物体 ;②转座子在目
标生物体内的初步定位 ;③转座子插入突变的鉴定
和分离 ;④利用一些带转座子及报告基因的重组质
粒来检测转座子在目标生物体内的活动性 ;⑤对转
座子插入引起的突变体 ,利用转座子序列作探针 ,分
离克隆目的基因。
转座子标记技术的优点: 可以分离预先不清楚
表达产物的基因 ;转座子插入引起的突变会由于转
座子的切离而回复 ;由于转座子总是沿其邻近的位
点转座 ,因此只要转座子在染色体上定位后 ,就很容
易确定与其连锁的突变基因的相对位置 ;如果把转
座子导入目标植物 ,通过自交、杂交、回交等方法便
可得到一个较大的含不同插入位点的转座子群体 ;
把转座子导入异缘植物不受转化条件的限制。但是
该技术也存在一定的缺陷。首先 ,就转座子而言 ,因
转座子在植物中以多拷贝状态存在 ,给突变基因的
检出造成一定困难。其次 ,转座子跳跃而改变在染色
体的位点 ,造成突变的表型不稳定 ,转座子因向异染
色体区转座减少了突变的随机性。 第三 ,筛选、鉴定
转座元件引起的表型突变体是在个体水平上进行
的 ,工作量非常大 ,而且定向标签还要求有隐性纯合
体进行杂交。由于一些植物很难获得转座子突变体 ,
因而不能运用该方法。最后 ,对于基因组庞大 ,重复
序列多的植物 ,该技术的应用也受到了限制。
2. 3　克隆抗病基因的其他方法
目前 ,抗病基因的克隆主要是通过遗传表型分
析 ,如转座子标记技术和以遗传图谱为基础的定位
克隆技术获得的 ,其中以定位克隆技术克隆的抗病
基因占大多数。随着分子生物学的快速发展 ,抗病基
因克隆技术又有所创新。
通过对已克隆的植物抗病基因进行蛋白质一级
结构分析发现 ,大多数抗病基因编码的蛋白质间存
在一些共同的保守结构域 ,如富亮氨酸重复序列
( LRR)、核苷酸结合位点 ( N BS)和丝氨酸-苏氨酸激
酶 ( S TK)功能域等。这些结果表明同源序列可能存
在于大多数植物抗病基因家族中。 由此产生了同源
序列候选基因克隆抗病基因的方法。该方法根据抗
病基因的保守结构域 ,设计合成寡核苷酸引物 ,利用
PCR扩增 ,从植物中分离结构上与抗病基因类似的
序列 ( disease-resistance gene analog , RGA) ;以该
PCR产物为探针进行限制性片段长度多态性
( RFLP)分析 ;将该 PCR产物定位后 ,通过在抗病
近等基因系文库中筛选 ,最终获得抗病基因候选克
隆。 Yu等根据烟草 N和拟南芥 PRS2基因的 N BS
区同源序列设计简并性引物 ,从大豆中扩增出 11类
含 NBS序列的片段 ,其中有 5个被定位于已知大豆
抗病基因附近。一系列的研究表明 ,利用同源序列分
离克隆抗病基因或寻找新的抗病基因可能是一条最
经济、快捷的途径。
另外 ,随着人类基因组计划的进展 ,定位候选克
隆技术正成为基因克隆的一种快捷高效的策略。 该
方法是在目的基因初步定位后 ,从有关区域的一系
222 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 33卷
列候选基因中确立目标基因 ,从而免去了克隆重叠
群和精细物理图谱的构建 ,以及外显子鉴定和 cD-
N A分离工作。由于这一技术充分联系已克隆的“无
名”基因或功能鉴定尚不透彻的基因资料 ,大大减少
了分离、鉴定目标基因的工作量。
3　从拟南芥中克隆抗病基因的应用前
景
对抗病基因的分离和克隆在很大程度上深化了
人们对植物抗病分子机理的认识 ,使病理分子生物
学上升到一个新水平。 利用已克隆的植物抗病基因
及病原菌的无毒基因进行遗传转化能够提高植物对
病原菌的抗性。同时 ,对抗病基因进行克隆也有助于
促进植物抗病分子育种的发展 ,从而最终达到控制
病害发生、保障农业安全生产的目的。
拟南芥 RPW8基因是一种特殊类型的抗病基
因 ,含有 RPW8基因的拟南芥对白粉病菌具有广谱
抗性。 含有 RPW8. 1和 RPW8. 2的转基因 Nico-
t iana tabacum提高了对 Erysiphe orontii和 Oidium
lycopersici的抗性 ;转基因 N icotiana benthamiana
植株提高了对 Erysiphe cichoracearum的抗性 ;而转
基因 Lycopersicon esculentum植株对这些病原菌仍
保持感病 [22 ]。
拟南芥中 N PR1 ( non expresser of pathogene-
sis-related genes)基因是 SAR( Systemic acquired
resistance )的重要调控因子。 在水稻中 ,拟南芥
N PR1基因的过度表达提高了水稻对细菌 Xan-
thomonas oryzae pv . ory zae的抗性。 水稻中 N PR1
过度表达使水稻产生 LMD ( lesion-mimic /cell
death )表型。 LMD表型受环境调控并且能够遗传。
坏死斑的形成与发展与水稻保卫基因表达及 H2O2
的积累有关。 N PR1可能接受和调控水杨酸的积
累。水稻中 N PR1基因表达和 LMD表型的产生表
明了 N PR1在植物压力胁迫反应中的多重角色 ,而
且作为转基因工具又可能影响水稻广谱抗性的获
得 [23 ]。同时 ,含有 N PR1基因的转基因水稻提高了
对细菌性枯萎病菌的抗性。 RNA杂交表明 ,转基因
水稻抗病性的提高需要 N PR1 mRNA的表达水平
至少提高 3倍以上 [24 ]。
番茄是重要的农作物之一 ,番茄受到病原菌侵
染后对产量影响很大。采用传统育种方法获得的广
谱抗性需要花费巨大的人力和物力。从花费和有效
性方面来说 ,采用基因工程方法提高抗病性已经成
为一种流行和有效的方法。含有拟南芥 N PR1基因
的番茄植株对番茄花叶病毒 ( ToMV )具有抗性 ,提
高了对细菌性萎蔫病和镰刀菌萎蔫病的抗性水平 ,
对灰霉病和细菌性斑点病也具有中等水平的抗性 ,
并且其抗病性能够稳定遗传 [25 ]。
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Application and s trategy of disease resis tance gene in Arabidopsis
WENG Qiao-yun, XING Ji-hong, DONG Jin-gao
(Mycotox in Laboratory , Agricultural University of Hebei ,Baoding , Hebei 071001,China)
Abstract: Wi th the development of molecula r bio logy and i ts widely application in plant pa tholog y,
more than 10 Arabidopsis disease-resistance genes w ere cloned subsequent ly. Resea rch o f the plant R gene
cloned w ould benefi t the understanding of the plant-pa thogen interaction and formulated effectiv e measures
to control the plant disease. This paper summarized the prog ress o f ca tego ry and st ra tegy o f R gene cloning
and the application of R gene cloned in Arabidopsis. The technique o f posi tional cloning and transposon tag-
ging w ere depicted in detai l.
Key words: Arabidopsis thal iana; resistance gene; posi tional cloning; t ransposon tagging
224 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 33卷