全 文 ：２０１４年５月 四川大学学报（自然科学版） Ｍａｙ．２０１４
第５１卷　第３期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５１　Ｎｏ．３
收稿日期：２０１３－０３－２１
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１５８６）；转基因重大专项（２０１１ＺＸ０８００９－００３－００２）；中央高校基本科研业务费（２０１１ＳＣＵ１１１０７）
作者简介：赵成（１９８６－）男，四川成都人，硕士，研究方向为植物遗传与分子生物学．Ｅ－ｍａｉｌ：４９８６１２９０６＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１４．０３．３７
拟南芥中一个参与盐胁迫应答基因的Ｔ－ＤＮＡ
插入纯合突变体的鉴定及表型分析
赵　成，杨　昊，刘志斌，杨　毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：本研究以拟南芥为试验材料，探索基因ａｔ５ｇ６６０７０在受到非生物胁迫的表达情况，
并研究其抗逆特性．结果表明，在ＮａＣｌ处理下，该基因的表达量明显升高，表明该基因受到
盐的诱导．通过ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ在ＤＮＡ和ＲＮＡ水平上筛选鉴定ａｔ５ｇ６６０７０基因Ｔ－ＤＮＡ
插入纯合突变体．分析了野生型拟南芥与突变体在不同浓度ＮａＣｌ处理下，其萌发率，根长以
及苗期的生长差异．结果发现，相对于野生型来说，突变体对盐更敏感．具体来说，在含有
１５０ｍＭＮａＣｌ的 ＭＳ培养基中，突变体的萌发率比野生型要低，根长比野生型要短，同时突变
体幼苗更容易出现枯萎，萎黄症状．
关键词：拟南芥；盐胁迫；幼苗生长；ａｔ５ｇ６６０７０；萌发率
中图分类号：Ｑ３７　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１４）０３－０６１５－０６
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌｍｕｔａｎｔ
ｗｈｉｃｈ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＺＨＡＯ　Ｃｈｅｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｈａｏ，ＬＩＵ　Ｚｈｉ－Ｂｉｎ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ａｔ５ｇ６６０７０ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ＮａＣｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，
ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｈａｎｄ．Ｏｎｅ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　Ｔ－ＤＮＡ　ｍｕｔａｎｔ
ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｔ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｌｅｖｅｌｓ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ，ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ
ａｎｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＮａＣｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｉｓ　ｍｏｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｗｉｄｅ－ｔｙｐｅ．
Ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ＇ｓ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｉｓ　ｌｏｗｅｒ，ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈｓ　ｗｅｒｅ　ｓｈｏｒｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｗｔ　Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，
ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　ｐｒｏｎｅ　ｔｏ　ｂｅ　ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅｙ　ａｒｅ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ
１５０ｍＭ　ＮａＣｌ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ；Ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ；Ｓｅｅｄｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ；ａｔ５ｇ６６０７０；Ｇｅｒｍｉｎｇｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５１卷
１　引　言
土地盐渍化是指由于自然因素和人为不合理
的措施而引起的土壤盐渍化．比如说由于蓄水工
程使得蓄水区域变成了水面，拦截了径流，减少
了下游水量，增加了水面蒸发，并且使库区周围
地下水位上升，导致了土壤盐渍化．土壤盐渍化
是一个世界性问题，严重影响着农业生产和经济
发展，选育和培育耐盐植物品种适应盐渍环境，
是缓解土壤盐渍化对农业生产影响的最经济有效
的方法［１０，１１］．据统计，我国现有耕地中，至少有
８００万ｈｍ２的土地由于不当的灌溉和施肥，导致土
壤中盐分积累，严重影响了农作物的产量．
大量研究表明，植物对盐胁迫环境的应答反
应涉及了多种基因和复杂的途径，盐分对植物最
普遍和最显著的效应就是植物抑制生长［１，２］．因此
通过分子生物学的手段研究耐盐基因显得非常的
重要［５］．根据前人的大量研究表明，发现含有
ＲＩＮＧ结构的基因与植物抗逆性关系密切［４］．比
如，含有 ＲＩＮＧ结构的 ＲＧＬＧ２基因对拟南芥的
干旱胁迫具有负调控作用［６］，ＤＲＥＢ２Ａ 是含有
ＲＩＮＧ结构的一个基因，它编码的蛋白与其它蛋
白相互作用，对拟南芥的干旱胁迫具有负调控作
用［７］，ＲＨＡ２ａ是含有ＲＩＮＧ结构的一个基因，在
种子萌发于以及幼苗的生长阶段起作用，在盐胁
迫与干旱胁迫下以及对 ＡＢＡ的响应起到正调控
的作 用［８］．本 课 题 研 究 拟 南 芥 中 未 知 基 因
ａｔ５ｇ６６０７０在其 Ｃ端有一个保守的 ＲＩＮＧ结构，
分析了该基因在受到各种非生物胁迫后，基因的
表达情况，发现该基因在盐胁迫下，表达量明显
升高．然后以 ＮａＣｌ作为盐胁迫因子［５，９］，探讨其
对野生型及突变体拟南芥生长的影响．研究结果
发现，在盐胁迫条件下，突变体种子萌发率明显
低于野生型，并且根长也比野生型要短一些，同
时，在幼苗的生长过程中，突变体幼苗更容易出
现萎黄，枯萎的症状．这些结果说明该基因可能
参与拟南芥中盐胁迫信号通路．
２　材料和方法
２．１　实验材料
拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态
型种子为本实验室保存．突变体种子为从拟南芥
生物资源中心（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ
Ｃｅｎｔｒｅ，ＡＢＲＣ）购买的编号为ＳＡＬＫ－１４８１８２Ｃ拟
南芥种子．
ＤＮＡ聚合酶购于Ｔａｋａｒａ公司．植物ＲＮＡ提
取试剂盒和反转录试剂盒购自天根生化科技有限
公司．引物合成与测序由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物技术有
限公司完成．
２．２　试验方法
２．２．１　培养拟南芥　将营养土和蛭石按照１：１混
合后加入１／２ＭＳ大量元素、微量元素、铁盐拌匀至
适当的湿润程度后高压湿热灭菌２５分钟，冷却，
同时将所有花钵洗净，高压湿热灭菌２５分钟，冷
却．将灭好的营养土分装到花钵中备用．将在 ＭＳ
平板上生长了一周左右的野生型及突变体拟南芥
幼苗分别移栽至花钵中，培养于２２℃，光照１６ｈ，
黑暗８ｈ的培养箱中．
２．２．２　突变体纯合子鉴定　ＤＮＡ水平检测：突
变体幼苗在培养箱中生长１个月后，提取叶片总
ＤＮＡ，以所提取的总ＤＮＡ为模板，采用三引物
ＰＣＲ法，进行ＰＣＲ扩增．Ａｔ５ｇ６６０７０基因特异的
引物 ＬＰ（５＇－ＣＡＴＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＴＣ－３
＇），ＲＰ（５＇－ＣＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＣＣＡＧＡＧＴＣＡＧ－３）＇与
Ｔ－ＤＮＡ 的 引 物 ＬＢ （５ ＇－ＴＣＡＡＡＣＡＧ－
ＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＴ－３＇）一起进行ＰＣＲ扩增．
ＲＮＡ水平检测：使用天根提取ＲＮＡ试剂盒
提取突变体幼苗ＲＮＡ，将其反转录为ｃＤＮＡ，用
ＲＴ－ＰＣＲ分析其转录水平，得到的ｃＤＮＡ用突变
基因ａｔ５ｇ６６０７０的特异引物ＬＰ与ＲＰ进行扩增，
同时以ａｃｔｉｎ基因表达为对照，ａｃｔｉｎ基因引物为
（５＇－ＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＡ－３＇）和（５＇－
ＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＡ－３＇）．扩增产
物用１．０％的琼脂糖凝胶电泳分析．
２．２．３　半定量分析野生型拟南芥在非生物胁迫下
的表达情况　将若干饱满的拟南芥种子在４℃春
化４ｄ，然后用升汞（０．１％）消毒１０ｍｉｎ，７５％乙醇
灭菌３０ｓ，然后用无菌水将种子洗涤５次，将种子
播种于 ＭＳ培养基平板上，在 ＭＳ平板上生长七
天后，将拟南芥幼苗分别移至经 ＭＳ，ＭＳ＋１０％
Ｓｕｃｒｏｓｅ，Ｍｓ＋３００ｍＭ　Ｍａｎｎｉｔｏｌ，Ｍｓ＋１０μＭ
ＡＢＡ，及 ＭＳ＋２５０ｍＭＮａＣｌ的平板上处理８ｈ，
用天根ＲＮＡ提取试剂盒分别提取ＲＮＡ，用ＲＴ－
ＰＣＲ分析目的基因在几种处理下的表达情况．半
定量所用引物为ｕｐ（５＇－ＴＣＴＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＡＧＴ－
ＧＧ－３＇）与ｄｎ（５＇－ＴＣＴＧＴＧＡＴＴＣＧＧＡＣＣＴＴＡ－３＇），
其产物长度为４６２ｂｐ．
２．２．４　ＮａＣｌ处理条件下野生型与突变体种子的
６１６
第３期 　　赵成等，拟南芥中一个参与盐胁迫应答的基因的Ｔ－ＤＮＡ插入纯合突变体的鉴定及表型分析　
萌发分析　选取若干同一时期播种，同一时期收
集的饱满，圆润，大小一致的野生型拟南芥种子
与突变体种子在４℃春化４ｄ，然后用升汞（０．１％）
消毒１０ｍｉｎ，７５％乙醇灭菌３０ｓ，然后用无菌水
将种子洗５次，将种子播种于 ＭＳ，ＭＳ＋１００
ｍＭＮａＣｌ，ＭＳ＋１５０ｍＭＮａＣｌ培养基平板上，观
察野生型与突变体株系的萌发情况，实验重复３
次，每个株系的播种数目均为１００颗．
２．２．５　ＮａＣｌ处理条件下野生型与突变体的根长
分析　用同样的方法春化野生型与突变体种子，
并消毒．将种子播种于 ＭＳ平板上，在 ＭＳ平板生
长两天后，分别将野生型与突变体幼苗移苗至 ＭＳ
＋１００ｍＭＮａＣｌ，ＭＳ＋１５０ｍＭＮａＣｌ培养基平板
上，倒立放置培养，每天观察根长生长情况，并记
录，７ｄ后拍照，实验重复３次．
２．２．６　ＮａＣｌ处理条件下野生型与突变体的苗期
生长状况分析
用同样的方法春化野生型与突变体种子，并消
毒．将种子播种于ＭＳ平板，在ＭＳ平板生长七天后，
分别将野生型与突变体幼苗移苗至ＭＳ＋１５０ｍＭＮａＣｌ
培养基平板上，在组织培养室中培养两周，观察苗期
生长情况，两周后拍照，实验重复３次．
３　结果与分析
３．１　Ｔ－ＤＮＡ插入位置与Ａｔ５ｇ６６０７０基因缺失纯
合突变体的鉴定
经 ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／分 析，ＳＡＬＫ－
１４８１８２ＣＴ－ＤＮＡ插入在Ａｔ５ｇ６６０７０基因的第４个
外显子处（图１，ａ）．在ＤＮＡ水平上，用基因的两
端引物ＬＰ与ＲＰ扩增后，野生型中有一条带，与
此对应的突变体中没有条带，当用ＲＰ与ＬＢ一起
扩增时突变体中有一条特异条带．而野生型中没
有出现条带，其中ｃｏｌ表示野生型，ｍｕｔ表示突变
体（图１，ｂ）．而在转录水平上，用基因特异的引
物，野生型中能够扩增出预期大小的条带，但在
突变体中没有（图１，ｃ），表明Ｔ－ＤＮＡ的插入使得
突变体中Ａｔ５ｇ６６０７０基因完全被敲除，这一株材
料是Ａｔ５ｇ６６０７０基因缺失的纯合突变体，供后续
实验使用．
３．２　目的基因Ａｔ５ｇ６６０７０受非生物胁迫后表达量
的变化
用ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因在受到 Ｈ２Ｏ、蔗糖、
甘露醇、ＡＢＡ、ＮａＣｌ处理下的表达情况．从图中可
以看出，等量Ａｃｔｉｎ的条件下，Ｈ２Ｏ、蔗糖、甘露醇、
ＡＢＡ处理后的条带与野生型中的差异不大，而在
ＮａＣｌ处理下，扩增的条带亮度远大于野生型．
图１　纯合突变体的鉴定
Ｆｉｇ．１　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔａｎｔ
Ａ，Ｔ－ＤＮＡ的插入位点，位于基因的第四个外
显子上；Ｂ，ＤＮＡ水平上的鉴定；Ｃ，ＲＮＡ水平上
的鉴定
Ａ．Ｔｈｅ　ａｔ５ｇ６６０７０ｇｅｎｅ　ｉｓ　ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｉｎ－
ｓｅｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｕｒ　ｅｘｏｎ；Ｂ．Ａｎａｌｙｓｉｓ
ｗｉｔｈ　ａｇａｒ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；Ｃ．ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ；
Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｉｃｔｕｒｅ　ａｔ５ｇ６６０７０ｍｅａｎｓ　ｃｏｌ（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）ａｎｄ
Ｍｕｔａｎｔ＇ｓ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ　ｉｎｔｏ　ｃＤＮＡ　ｂｙ
ＯｌｉｇｏｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ，ｔｈｅｎ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｔ５ｇ６６０７０
ｇｅｎｅ　ｓｐｅｃｉａｌ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒ，Ａｃｔｉｎ　ｍｅａｎｓ　ＲＮＡ　ａｍｐｌｉ－
ｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａｃｔｉｎ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒ．
图２　ＲＴ＿ＰＣＲ分析该基因受到非生物胁迫后的表
达情况
Ｆｉｇ．２　ＲＴ－ＰＣＲ　ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｌｅｖ－
ｅｌ　ｏｆ　ａｔ５ｇ６６０７０ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｕｎｄｅｒ　ａ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ
ｓｔｒｅｓｓ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．
ＣＫ （ｎｏ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ），Ｈ２Ｏ，Ｓｕｃ（１０％）；Ｍａｎ
（３００ｍＭ）；ＡＢＡ（１０μＭ）；ＮａＣｌ（２５０ｍＭ）．
３．３　野生型与突变体在ＮａＣｌ胁迫下的萌发情况
在正常 ＭＳ培养基下，春化４ｄ后的野生型与
突变体的萌发率基本一致，在第３ｄ即可看到有
９０％以上的种子萌发，第６ｄ时，均完全萌发．而
在含有１００ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ平板上，突变体相比
于野生型萌发率要低，第六天时野生型的终萌发
率为９０％，突变体仅为７８％．在１５０ｍＭ　ＮａＣｌ的
ＭＳ平板上，这种影响更大，野生型的终萌发率为
５１％，突变体仅为２３％，见图３．
７１６
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５１卷
图３　ＮａＣｌ处理下野生型与突变体的萌发率
Ｆｉｇ．３　Ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ
Ａ．野生型与突变体在含有不同浓度的ＮａＣｌ的 ＭＳ平板上萌发；Ｂ．野生型与突变体种子最终萌发率统计，野生
型与突变体种子萌发率在盐胁迫下差异显著Ｐ＜０．０５
Ａ．Ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ＭＳ　ｐｌａｔｅｓ　ｆｏｒ　６ｄａｙｓ；Ｂ．
Ｔｈｅ　ｆｉｎａｌ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　Ｍｕｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ，ｔｈｅ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ａｌ　ｍｅａｎ　ｖａｌｕｅｓ　ａｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉ－
ｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ（Ｐ＜０．０５）．
图４　盐胁迫对野生型与突变体根长的影响
Ｆｉｇ．４　Ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ
Ａ．野生型与突变体幼苗在不同浓度的ＮａＣｌ的 ＭＳ平板上生长六天后的根长情况；Ｂ．野生型与突变体的根长统计，
野生型与突变体根长在盐胁迫下差异显著Ｐ＜０．０５．
Ａ．Ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ＭＳ　ｐｌａｔｅｓ　ｆｏｒ　６ｄａｙｓ；Ｂ．Ｔｈｅ　ｆｉｎａｌ
ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ，ｔｈｅ　ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ａｌ　ｍｅａｎ　ｖａｌｕｅｓ　ａｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ
ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ（Ｐ＜０．０５）．
３．４　野生型与突变体在ＮａＣｌ胁迫下的根长情况
在正常的 ＭＳ培养基条件下生长９ｄ，野生型
与突变体的根长基本一致，均为７０ｍｍ左右．１００
ｍＭ，１５０ｍＭ 的 ＮａＣｌ的平板上，二者根长均变
短，在同一浓度的盐平板上，突变体根长比野生
型的更短．在 ＭＳ上生长两天将其移到含有１００
８１６
第３期 　　赵成等，拟南芥中一个参与盐胁迫应答的基因的Ｔ－ＤＮＡ插入纯合突变体的鉴定及表型分析　
ｍＭ，１５０ｍＭ 的 ＮａＣｌ的 ＭＳ平板上，在１００
ｍＭＮａＣｌ的 ＭＳ平板上，野生型的根长为４８ｍｍ，
突变体根长为２６ｍｍ．在１５０ｍＭＮａＣｌ的 ＭＳ平
板上，野生型的根长为２１ｍｍ，突变体根长为１１
ｍｍ．
３．５　野生型与突变体在ＮａＣｌ胁迫下的苗期的生
长情况
在 ＭＳ上生长了７ｄ的野生型与突变体拟南
芥幼苗移至１５０ｍＭＮａＣｌ的 ＭＳ平板上生长两周
后，发现有７５％的突变体幼苗表现出萎黄，枯萎
的症状，而大部分野生型幼苗仍能长势良好，见
图５．
图５　盐胁迫对野生型与突变体幼苗生长的影响
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ＷＴ　ａｎｄ　Ｍｕｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ
Ａ．野生型与突变体幼苗分别在含有不同浓度的ＮａＣｌ的 ＭＳ平板上生长２１天，在含有１５０ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ
平板上，与野生型相比，突变体更容易出现萎黄、枯萎的症状；Ｂ．野生型与突变体的存活率统计，野生型与突变
体的存活率，野生型与突变体根长在盐胁迫下差异显著Ｐ＜０．０５．
Ａ．Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ＭＳ　ｐｌａｔｅｓ
ｆｏｒ　２１ｄａｙｓ，Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ，ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ａｒｅ　ｍｏｒｅ　ｐｒｏｎｅ　ｔｏ　ｂｅ　ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅｙ　ａｒｅ
ｇｒｏｗｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　１５０ｍＭＮａＣｌ．Ｂ．Ｔｈｅ　ｆｉｎａｌ　Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｐｌａｎｔｓ，ｔｈｅ　ｓｕｒ－
ｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ａｌ　ｍｅａｎ　ｖａｌｕｅｓ　ａｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ（Ｐ＜
０．０５）．
４　讨论
在突变体鉴定实验中，首先从ＤＮＡ水平上鉴
定，在ＬＰ，ＲＰ作为引物时，突变体没有检测到条
带，野生型看到有明显的条带，表明Ｔ－ＤＮＡ有插
入到突变体中，同时在ＬＢ，ＲＰ作为引物时候，突
变体检测到条带，野生型中没有看到条带，这表明
在ＤＮＡ水平上这一株突变株是纯合的．然后用
ＰＴ－ＰＣＲ分析了野生型与突变体的转录水平，结
果显示突变体中没有检测到条带，这表明在ＲＮＡ
水平上，目的基因没有转录．然后通过 ＲＴ－ＰＣＲ
分析了目的基因的表达谱，在水，蔗糖，甘露醇，
以及ＡＢＡ处理下，该基因的表达跟野生型的表达
量基本一致，然而在ＮａＣｌ处理下，该基因的表达
量明显升高，表明该基因受到盐的诱导［１３，１５］．该
基因可能参与拟南芥中盐信号通路［１２］．
在正常的 ＭＳ培养条件下，野生型与突变体
的萌发率，根长以及幼苗的生长状况基本一致．表
明该基因的突变体与野生型正常条件下生长没有
差异，说明该基因不影响正常的生长过程．在ＮａＣｌ
胁迫下，二者的萌发率均受到抑制，但是突变体的
萌发率比野生型低，同时，突变体的根长在盐胁迫
下比野生型要短，并且在幼苗的生长过程中，想对
于野生型，突变体对盐胁迫更加敏感，更容易表现
出萎黄，枯萎的症状．由这些结果表明，该基因在
拟南芥中ＮａＣｌ的胁迫应答中［９，１４］，是参与该途径
的一个调控因子．当然，该基因更加明确的作用机
制还有待于进一步研究［１６］．
近年来，越来越多的研究表明，ＲＩＮＧ结构是
植物体内广泛存在的一种保守结构域，ＲＩＮＧ结构
在植物非生物胁迫应答中发挥着重要作用．先前
的研究表明，含有ＲＩＮＧ结构的基因很多具有Ｅ３
连接酶的活性，参与泛素降解途径．本研究的研究
对象也含有ＲＩＮＧ结构，同时该基因参与盐胁迫
途径的应答过程，因此推测该基因参与盐胁迫过
程可能是通过泛素途径而发挥作用的［６－８］，具体是
９１６
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５１卷
如何发挥其功能的，当然还需要更多的研究进行
验证补充．
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