全 文 ：·研究论文 ·
拟南芥低温诱导 。 r ol允基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达 *
朱 , 宋波涛 柳 俊 * * 谢从华
(国家蔬菜改良中心华中分中心 , 武汉 43 0 7 ;0 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 , 武汉 43 0 70 )
摘要 :利用 cP R 方法从拟南芥(月用七心叩 s括咖从功月 )品种 c ol uln ib a 的基因组中扩增出低温诱导基因 c or l允 的启动子片段
并插人克隆载体。 序列分析表明 ,克隆的启动子长 0 0如 ,与目前已经发表的启动子序列完全一致。 将此启动子插人 p lB l2 1
的那 基因及 N o s 终止子上游构成表达载体 p L B , 通过直接法导人根癌农杆菌“ 乡旧ba c细血mI han 汤`如习 L B A科04 ,并转化
马铃薯 (勘抽山um 翻加 , % um )获得转化再生植株 。 再生植株 CP R检测和 CP R一 os hut e m 鉴定结果证明 , cor l允基因启动子已经成
功地转入到马铃薯植株基因组中。 G U S 组织染色证明拟南芥 cor l允启动子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的能力 。
关钻词 : 拟南芥 ;低温诱导启动子沼出 基因 ;转基因马铃薯
C lo n i n g o f ht e P r o m o t e r F r a g 盯 e n t o f a C o ld一 in du c ib l e G e n e ( e or l允 )
for m A m b 1’d 叩s 1’s ht a 1I’a n a an d tI s E xP er s s i o n i n T r an s g e in e p o t at o
Z HU Q in g SO N G B o
一
T a o L IU JnU
* * X IE C o n g
一
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( C hina B ancr
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一
C e n etr o f V e罗abt le lm Por v e m en t , Whu an 4 3 007 0 , C hina ;
K ey L叭沁ar toyr o f H耐 cu lot ar l lP ant B io lo gy , M in i sytr o f E du c at io n , H u ` 山o n g Ahg e u 】tU几】U n iv e sr i yt , W hu an 4 30() 7 0 , C hi n a )
冉加比改 hT e Por m ot e r o f a e o ld - 加du c ib le ge n e c or l允 w as aj nr Pli if e d w iht P C R 加 m ht e ge n o m e D N A o f A用石欣拼括咖从切月
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C o lum b i
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.
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e e x Per s s io n ve e ot r PL B w as
e o n s lt 刀 c et d b y in s e rt in g ht e c or l如 P or m o et r in t o ht e uP s etr am o f g us g e n e fo ll o w e d by N O S et mr i n a ot r in PB l l Z I . hT e PBL w as
d此 e t ly in tr de u e e d in ot A g功ab e et ir um t u n 〕aef e ien s L B A 4 0 A w h ie h w as us e d t o m e d iat e ht e lt 妞n s fe amr tio n o f c olr 允 Por m o et r
afr g m
e n t i n to ht e po at to (勘扫因 um tIJ bC叨 s mU ). hT e er 罗n e ar te d P la n st w e er an a lyZ e d b y PC R an d CP R一 S o u ht em b lo t an d s h o w de
比歇 het co r l允 Por mo et r 加gln e n t w a s in t e脚 te d in ot het ge no m e o f po at ot . H is to c he m i e al ast i n in g o f G U S 旷 it v iyt o f het lt 妞n s罗n ie
P lan st Por
v e d ht at C or l兔 Por m o et r e o u ld c o n fe r e o l d- in du e ib le e x Pr e s io n o f 召” 5 g e n e in ht e oP at t o .
兀盯 , 回山: 月月白心叩 s括 叻日拍切日 ; e o ld一 in du e ib l e p or m ot e r ;别 5 g e n e ;如 n s罗 n i e 训aot
低温适应过程的实质是细胞内基因表达发生变
化的结果 ,低温条件特异性地诱导了细胞内一系列
与细胞抗冻有关的基因表达 1, 2] 。 利用分子生物学技
术 , 已从拟南芥中分离出许多在低温适应过程中特
异表达的基因 ls] , 其中以 cor l允基因最为典型 。 研究
表明 c or l允 基因的表达明显提高了植物细胞对低
温条件的抵抗能力冈 , 对该基因的深人研究发现它
的启动子具有低温诱导表达的特性 , 能够在低温条
件下特异性驱动 召“ s 基因在拟南芥中表达 。 目前该
启动子已有全序列发表 4l[ , 但它在其它植物中是否
仍具有低温启动的功能还未见报道 。 本研究根据已
发表的序列设计引物 , 用 P C R 方法从拟南芥品种
C ol u m b i a 基因组中扩增并克隆了 cor 了殆 基因启动
子片段 。 将克隆启动子与 召” s 基因融合构建成表达
载体后再转人马铃薯 , 进而鉴定该启动子在马铃薯
中的低温诱导表达功能 , 为其作为基因工程启动子
提供实验依据 。
1 材料和方法
,
.
, 植物材料
* 基金项目 : 国家自然科学基金伽。 3 0 2 7 0 8 4 2) , 国家高技术研究与发展计划 ( 8 63 )项目创。 Z o ZA六2 4 1 1 81 )和湖北省科技攻关项目资助 。
朱 青 :男 , 19 80 年生 ,硕士研究生 。
* 中联系作者 。 uA ht o r of : 。。 n℃ s op n d e n ce . E一m ial : < il uj un @ m ial 五azu . e d u
.
>cn
.
收稿日期 : 2 0 3一o 一 2 2 接受日期 : 2X() 4刁-3 01
拟南芥仍招吞心叩劝 hat 加 n a )品种 c ol u m b i a 由
中国科学院植物研究所生理实验室惠赠 ; 马铃薯
(肋几的 um ut b~ u7n )品种鄂马铃薯 3号 ( E 3 )的无菌试管薯由本实验室保存。
1
.
2 菌种和质粒
大肠杆菌任治动曰公功功 `公万 ) D H 5a , 克隆载体
pU C 18 和植物表达载体 p lB l ZI , 抗性标记为 K l l l r ,
遗 传 转 化 用 根 癌 农 杆 菌 ( A g 旧 ba ` 把万切的
勿功cfa ~
) L B A 4 404 均由本实验室保存 。
,
.
3 酶和试荆
限制性内切酶 、 T刀 N A连接酶 、 分子量 M a kr er
和高保真 D N A 聚合酶 p fu 购自 T a K a R a 生物公司 ,
P C R 引物由上海生工生物技术公司合成 , D N A 序
列测定由上海基康生物技术有限公司完成 。 其它主
要化学试剂均为 is gm a 公司产品和国产分析纯 。
1
.
4 常规 O NA 操作
拟南芥幼苗总 D N A 的提取 、质粒提取 、 限制性
内切酶酶解 、大肠杆菌 D H 5 a 感受态细胞的制备和
大肠杆菌转化等均按 《分子克隆 》介绍的方法操作 。
,
.
5
cor
1a5 基因启动子片段的克隆
根据 hT o am sh o w 等 [’ ]报道的拟南芥低温诱导基
因启动子 D N A序列 ,合成 1对引物 ,引物两端分别
为 月叭记 uI 和 石触功H l 的酶切位点 。 cor l允启动子
P C R 扩增引物 :
5’ 端引物 lL : CT c A A G C TT A G ACT T GT C c G TT GA A T T ;
3’ 端引物 2L 石C C C A cT C AG A T GT G AG A A T A A A A A G A AG 。
取 2 林L (约 50 n g) 拟南芥总 D N A 为模板 ,在
50 卜L 反应 体 系 中 (每种 dN TP 终浓 度 为 .0 2
~
。比 , 相 应 的启动子特 异性 引物浓度 各 .0 5
林m 。比 ) ,先于 95 ℃预变性 5 而 n, 后以 94 ℃变性 45
s
,
5 5 oC 退火 5 0 5 , 7 2 oC 延伸 1 m in , 进行 3 0 个反应
循环 ,最后 72 ℃延伸 2 m in 。 P C R 扩增产物的纯化 、
酶解及大肠杆菌克隆参照文献 5[ 】进行 。 对筛选到的
重组子 (含 c or l允基因启动子 )采用双脱氧核昔酸终
止法对全长启动子进行测序 ( 由上海基康生物技术
有限公司进行 ) 。
,
.
6 低温特异表达载体 p LB 的构建
用限制性内切酶 月叭记 uI 和 刀田效H l 双酶切质
粒 p lB l 2 1, 回收载体大片段 ,与 月公幻 nI 和 石场月盛1 1
双酶切上述重组质粒回收的 .0 g kb 的片段连接 。 取
连接产物 10 林L 转化大肠杆菌 D H 5 a 感受态细胞 。
待转化子长出菌落后 , 挑取单菌落小量制备质粒
D N A
, 用 月公记 uI 和 刀司奴H l 进行酶切鉴定 ,筛选重
组子 p L B (图 l) ,再用 nA l6[ 的方法将表达载体 p L B
转人根癌农杆菌 L B A 4 04 。 经利福平 (死 f) 和卡那
霉素 ( K n l )筛选 , P C R 检测 。
图 1 .质粒 p L B 结构示意图
F ig
.
1
.
S e h e m at ie r6P er
s e n at ti o n o f T
一
D N A o f ht e v e e ot r P L B
1
.
7 马铃薯的遗传转化及植株再生
参照 H or s hc 等门和司怀军阁的方法 ,略改进 。 将
含有质粒 pL B 的根癌农杆菌 BL A科04 接种于加 50
m叭 K ln 和 50 m叭 形 f 的 L B 培养基中 ,于 28 ℃ 、
2 4 0 r/ m in 摇床上培养至 口口如为 .0 5 左右 。 然后于
5 0 0 r/ m in 离心 6 m in , 其沉淀用适量的 M S 液体培
养基重新悬浮 。 将无菌苗诱导的试管薯切成 1~左右厚的薄片 ,置于上述根癌农杆菌菌液中浸泡 10
而n ,其间摇动数次 ,取出后用无菌滤纸吸干表面菌
液 ,移人芽分化培养基 ,于 28 ℃ 、 暗培养 。 芽分化培
养基为 M s 基本培养基附加 3 % 蔗糖 、 l m叭认A 、
o
.
Z m叭 。 ^ 3 、 o . s m叭 B A 和 0 . 5 % 的琼脂 , p H 5 . 8
(简称 S RM I 培养基 ) 。 暗培养 Z d 后的薄片转移至
芽分化培养基 S R M Z s( RM I 培养基附加 Z m叭 玉
米素核普 、 10 0 m g/ L K m 和 50 o m叭 梭苇青霉素
( C abr ) )
。 待抗性芽从薄片表面长出 1一 2 c m 时 ,切
下转入含 50 m叭 K m 和 4 0 m昨 Cabr 的 M s 培养基上生根 。
1
.
8 转化再生植株的 PC R 检测和 PC R 一S o u th e rn
鉴定
按 Edw ar d s 等 [,l 的方法从马铃薯叶片中提取植
物总 D N A 。 用转化植株的总 D N A 为模板 ,未转化
植株作为负对照 , 以 `盯 2允 启动子的扩增引物 :
L I
一
5
,一
T C CA A G C T T A G A T C T T G T C C G T T G A A I , 1
, 一
3
,
;
L Z
一
5
,一
G G G G A T C C A G A T G T G A G A A T A A A A A G A A G
一
3
, 。
进行 P C R 扩增 , PC R 扩增条件为 95℃ 5 m in ;
94 oC 4 5 5
,
55 oC 30 5
,
7 2 oC 4 5 5
,
30 个循环 ; 72 ,C
延伸 5 m i n 。 预期扩增片段大小为 0 . 9 kb。 PC R 产物
电泳后转至尼龙膜 ,质粒 p L B P c R 扩增产物电泳回
收的 .0 g kb 片段 , 经同位素标记后作为探针进行杂
交 。 so ut he m 杂交参照参照文献5[ ]。
1
.
9 转基因马铃 , 的低温处理和 G U S组织化学
染色
转基因马铃薯按照 Th o m as h o w 等 4[]的方法进行
低温诱导处理 。 生长在 M S培养基上的转 cor l允 启
动子的马铃薯试管苗和对照 (非转化试管苗 )先置
农 业 生 物 技 术 学 报 2 0( 抖 年
于 2 ℃ ,每天 16 h 光照 ( 120 林m o腼 sz/ ) 的培养室
中培养 2周 。待试管苗长到约 10 cm 高时 ,把培养盒
转到 2 ℃ ,每天 16 h 光照 ( 45一5 卜m o F mz/ s) 的培
养室中诱导培养 48 h 。 低温处理后切取的试管苗顶
端向下的 2一4 展开叶 , 参照 eJ fe sor ln 门的方法进行
G U S组织化学染色 , O L Y N IP U S B H一2 型显微镜观
察染色结果 。
显示 12 株抗性植株中均可扩增到 925 bP 的特异片
段 ,与所用引物界定的 ND A 片段 92 5 bP 相吻合 ,而
未转化的植株中没有该片段的产生 ,证明 “ 万才血启
动子已经转化进人到该植株基因组中 。 再生植株的
CP R 扩增结果见图 5 。
2 结果和分析
2
.
, cor l砧启动子的克隆以拟南芥品种 C。】切 m b i a 总 D N A 为模板 , 用
成万了允启动子的扩增引物 ,进行 CP R 扩增 。 结果显
示 , 在设计的扩增条件下成功扩增出 925 bP 的特异
片段 (图 2) ,与 ` 侧口允启动子大小相符 。
…1 叭 tC lt 昨翻叭灿户吐饮吐 t t t . 口呜 t t t t t t 飞t t . t目 P比 t t . 叭 t t t . .t t t. t“ . 目成 t . . 吐 t一 t 日ca t t t c t吐 t t .c 切 t t , . t切目脚 p t昨 t的 t砂加叭
12 1 ca p t t e t c t一 p ` t t t t t t t t t t . . . 日. ` t日 . t tC吐 p t .C p 一 t t“ ” t t t t t t t t
I台1 t t d t切 .目口 .吐 . 吐 ca p p 目 . . ” t t吐 t“ .创“ ` p t t c切 t t . c . .峨” t
24 1 p t t t .侧沈 t t t t t t t t t t . c .叭 t日. c . . t c t t c . c . . c .… t c c . c二 p二加 I c示 t .曰 . . t“ c . t“ 日 t t t一 t t t一” t t创成“ 示 . t一 t一 t t c . c c t t c t . t p职 .
肠 1 t t曰 . t t c t吐“ 。翻 t价 . -二 t t c t t一。 p p t二 p t t一 t t t t c . 即 . t叭…
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铭 1 t c目昨 t t一 t t t t
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图 2 . 拟南芥低温诱导基因 ` “ J知
启动子的 P C R扩增
Fi g
.
2
.
PC R aJ口 Pl i 6e a it o n o f het
c。 心为
gen e p or m o te r o f A
.功助助 .
M, 分子 t 标么 1, 侧丫少为启动子的 cPR 扩增
产物。
M六 一石万】, 14 1 di g es t D N A m四比 er (T心国肋) ;
1
,
CP R Pm du
c st of cor l知 orP m ot .er
, , 必 t , , t t t t t t t ct t t ct t o t t t 。 , ~ … t . t, t t .塑白汤 t .
~ , , 。 。 , .st 。 ~ .ct t, .ct .翅吐 , . .t
训翻川
t t 。 。 。 . t -一 t o . t o塑丝区。 , 一。 t . t t , . t t . , 一
龙4S
图 3 . c or l允 启动子核酸序列
iF g
.
3
.
Nu cl
e iot de “ 门 u e cn e of cor l如 orP om姗
+l
,表示转录起始点 ; 1一4 , 表示不同的重复功能城 ; 5 . 表示脱落酸应
答因子 : 6 , 表示 T A T A 盒。
+ l
, 廿山 l
scn p it
o n 而 it硕 on s iet : 1一 4 , van o us 代p 比 tde m o it 丘; 5
,
p u at it ve
A B A
.
n活 pe ns iv村 l恤即;st 6 , p u侧 ive T A T A . bO 瓦
通过粘性末端连接 (角讨 1 旧司五H l) 将 cor l允
启动子片段插人 UP cl s 多克隆位点中 ,转化大肠杆
菌后 ,挑选白色菌落 。 经酶切和 P C R 鉴定 ,证明均是
有 c olr 允启动子片段插人的阳性克隆 ,重组质粒命
名为 pU g o 。 利用 M 13 引物对 pU g o 中全长启动
子进行测序 ,所得结果与已发表的序列进行比较 , 克
隆启动子序列见图 3 。
.2 2 裹达载体的构建
构建的表达载体 pL B 经 月放川 uI 和 石触功H l 酶
切鉴定 ,得到 9 25 bP 的片段 ,证明 ` “ 2允 基因的启
动子已插人到 p lB l ZI 中 (图 4) 。 通过直接法导人根
癌农杆菌 BL A科 04 , 经 PC R检测证明 pBL 已转人
根癌农杆菌中 。
2
.
3 转签因植株的获得及 P C R 和 P C R一S o u th e r n
鉴定
表达载体 pBL 通过根癌农杆菌 L B A朝 04 介导
转化马铃薯 E 3 无菌试管薯 , 经过分化和诱导生根
两个阶段的筛选 , 共获得 K l n 抗性的再生植株 12
株 。 以 K m 抗性马铃薯植株叶片的总 D N A 为模板 ,
用 ` orI 允启动子的扩增引物进行 PC R 扩增 。 结果
图 4 . 表达载体 pBL 酶切鉴定
Fi g
.
4
.
deI int 6
e iat o n o f ht e e x Per s ion
ve c姗 P L B
M
,分子 t 标记 ; 1 , 表达载体角耐 皿和
月叙过 1 1双醉切 。
M六 一欣。 T 14 【id 沙 st DN A 功四内 er
( T心国灿 );
1
,
pBL /产翻目 m an d 丑叨 IH 1
.
为了进一步鉴定 CP R 产物是否为 925 bP 的
` “ 才允启动子片段 , 排除假阳性的存在 ,将 P C R 产
物电泳转膜进行 S o u ht em 杂交 , 以印 标记的质粒
正对照 PC R 扩增产物回收片段作为探针 ,结果表明
产物确实是 cor l允启动子片段 ,从而证明 cor l允启
动子已经成功地转人马铃薯基因组中 。 部分转基因
植株 P C -R S o u ht e m 结果见图 6 。
2 4 转基因马铃甚低温诱导表达 G U S 活性的检测
从 12 个转 `优夕允 启动子的株系中随机选取 7
个株系用于进一步低温处理鉴定启动子功能 。 C U S
I 1 1 1 n, 1飞 I J 图 5 . 转化植株的 CP R检测
iF g
.
5
.
CP R an
a ly s is o f het 七山” fo mr ed op at to
M
, 分子t 标记 ; 1 , 质粒正对照 ; 2 , 非转化植株负对照 ; 3一 14 ,转化
植株 。 ^ 七沁叮 141 d l脚 t DN A . 国山“ (T曰国肋) ;
l
,
CP R P
rod
u
CtS
o f P I包. 刀 id P LS : 2
,
CP R P耐u山 o f un tr . . fo mr ed
卯因。 ; 3一 14 , CP R P耐 u e st of tr . . 细mr 时加恤加 .
图 .6 部分转化植株的咒-R oS hut 的 检侧
iF g
.
6
.
eD
忱沁 tion of 加劝 s g e n ic lP an tS by PC R .翻 u ht e m
1
, 质粒正对照 ; 2 , 非转化植株负对照 ; 3~ 9 ,转化植株 。
l
,
Plas m ld as po ist
v e c o n tI O ;I 2
,
un 汀 . . fo n ” de P lan t as
n e ga t iv e co n t . l ; 3刁 , p u at it ve tr . . fo mr 目 Pla n tS .
图 .7 转基因植株的 G U S染色
F i g
.
7
.
D et
e it o n o f G U S a e it vi yt in tr a l l s g e n i e P lan st
1
. 低温处理的转化植株叶片汉 . 非低温处理的转化植株叶片口 . 非转化植株叶片 (负对照 ) 。
1
.
A Iae f o f c o ld
.切 , tde 加切 s fo mr 比 Pl an t ; 2 . A lae f o f n o t co ld一切比 tde 加切 s fo n力 de Plant ;
3
.
A lae f of un nt 叨 s fo n n de p腼 (t n ge a it ve co n如 1) .
染色结果表明 , 经过低温处理的转基因马铃薯的叶
片均表达了 G U S 产物 , 而没有经过低温处理的转基
因马铃薯及非转基因植株则检测不到 G U s 活性 (图
7)
。 这进一步证明 ` “ 了介基因启动子已经转化进人
到马铃薯植株基因组中 , 并能在低温诱导下驱动
召” ` 基因在马铃薯组织中表达 。
3 讨论
C盯了允启动子在十字花科的拟南芥中的表达调
控已经进行了详细的研究 t4] , 它在常温下活性很低
几乎检测不到 , 经过低温 (2 ℃ )处理后其活性迅速提
高 ,该启动子是一个低温诱导型的强启动子 。本实验
室利用 P C R 的方法克隆了拟南芥 C毋了允 完整的启
动子 ,导人马铃薯基因组后 , 它在栽培马铃薯中也
同样具有低温诱导表达的能力 。 同时也证明一定条
件诱导表达的启动子在不同植物间可能具有通用
性 , 类似的结果在一些种子特异表达启动子中也得
到证实 1 ’ J , 从而为特异诱导表达启动子的应用提供
了一定基础 。
早期的植物基因工程中 , 35 5 是最常用的启动
子 。尽管它在转基因植物中具有高效表达的优点 , 但
随着分子生物学研究的不断深人 , 越来越多的研究
表明 ,一些需要在特定条件下表达的基因转化后 , 如
果组成型表达将会干扰植物的正常代谢活动1 , 31 。 而
特定条件下的遗传改良又正是未来植物基因改良的
重点 , 因此寻找特定条件下表达的启动子是基因工
程研究领域的重要课题之一 。 植物低温反应是一个
普遍的生理现象 。 本研究显示 ,拟南芥 `盯了允 启动
5 04 农 业 生 物 技 术 学 报 20( 拼 年
子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的功能 , 暗
示植物低温反应可能具有相同或相似的遗传调控机
制 , hT o r n a s ho w 的研究也有相似结论 l’] 。同时 cor l允
启动子在马铃薯中的低温诱导表达功能的鉴定 , 为
马铃薯低温贮藏品质的提供基础 , 使通过加强目的
基因在低温诱导条件下的表达来改良贮藏品质的基
因改良策略成为可能性 。
参 考 文 献
1 W
e i s e r C J
.
C o ld 比 s i s st 叮 e e an d inj u yr in w以劝y Plan st .
cS i
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197 0
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〔口尺 I允 ge n e a佰比 st bo ht hc fo or Plast an d p or t 0 P last
加 e inz g ot le 件口 e e . NP A S , 19 6 , 93 : l 34( 抖 ` 13409
3 eS ki M
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N ar us ak a M
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A be H
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et al
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20() 1
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13 : 6 1~ 72
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o m a ` ho w M F
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hT
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月摺吞心叩`括 功月拍劝月 `份矛勃 h as e is 一 ac it n g el e m e n st ht at
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·生物技术研究成果 ·
中国啮目昆虫分类
首次系统 、全面地研究了中国啮目昆虫的物种多样性。 共发表论文 51 篇 , 2 0 2 年由科学出版社出版了 293 万余字
的专著 , 共发表新种 14 91 个 、新属 98 个 、 新族 7 个 、 新亚科 12 个 ,同时提出新组合 79 个 、新名 3 个 。 使中国啮虫达到 3
亚目 27 科 170 属 15 26 种 ,为我国该目 19 87 年已知种类的 1 .2 9 倍 ,其中大陆部分为 19 87 年已知种类的 89 3 倍 ;为世
界已知种类的 28 .6 % ;彻底改变了我国该目昆虫分类的落后局面 ,极大地丰富了我国及世界啮目昆虫的多样性。 为今后
深人研究该类群的分类 、保护和利用我国啮目多样性等奠定了坚实的基础 。 提出了啮目分类新系统在 Sm iht e sr ( 19 72 )
等学者啮目分类系统的基础上 ,结合自己的研究经验 ,提出了目下亚目 、 总科及科级分类新体系 ,避免了过去 目下设部
和科组 ,层次杂乱 、级序列成分不稳定的弊端 。 首次全面分析了中国啮目昆虫的地理分布 ,为探讨世界啮目的起源与进
化提供了良好材料 。 首次研制了中国啮虫信息管理与辅助鉴定系统 , 为基层科技工作者鉴定中国啮目昆虫提供了良好
的工具 。
20 3教育部提名国家自然科学奖一等奖
研制单位 : 中国农业大学 农学与生物技术学院 , 1 000 94 ; 联系人 :李法圣
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