全 文 ：第３７卷第５期
２０１４年９月
河 北 农 业 大 学 学 报
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＨＥＢＥＩ
Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２０１４
文章编号：１０００－１５７３（２０１４）０５－００６－０６　 ＤＯＩ：１０．１３３２０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊａｕｈ．２０１４．０１０５
拟南芥ＡｔＡＴＧ８ｃ基因缺失突变体的
鉴定及其对非生物胁迫的响应
田丽娟，魏凤菊，高　翔，赵甜甜，刘　刚，侯春燕，王冬梅
（河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 ０７１００１）
摘要：本研究利用反向遗传学方法研究ＡｔＡＴＧ８ｃ基因在拟南芥抵抗非生物逆境胁迫中的功能。首先在ＤＮＡ
水平鉴定获得了ａｔａｔｇ８ｃ突变体的Ｔ－ＤＮＡ插入纯合植株，接着在转录水平进一步检测ＡｔＡＴＧ８ｃ基因的敲除
情况，ＲＴ－ＰＣＲ结果显示ａｔａｔｇ８ｃ为Ｔ－ＤＮＡ插入敲除突变体。对野生型和突变体拟南芥在幼苗期与成苗期进
行盐、干旱、营养胁迫试验。结果表明：无论是在幼苗期还是在成苗阶段，ａｔｇ８ｃ突变体较野生型对不同逆境胁
迫更为敏感，主要表现出在幼苗期根的生长受到了明显抑制，在成苗期叶片表现出萎蔫、枯黄、衰老快的特征。
说明ＡｔＡＴＧ８ｃ基因在拟南芥抵抗各种非生物胁迫中发挥了重要作用。
关　键　词：拟南芥；ＡｔＡＴＧ８ｃ；非生物胁迫
中图分类号：Ｑ９４５．７８ 文献标志码：Ａ
　　收稿日期：２０１４－０６－２０
　　基金项目：国家自然科学基金项目（３１１７１４７２）；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（优先发展领域）
（２０１１３０２１３０００１）．
　　作者简介：田丽娟（１９８５－），女，河北省灵寿县人，硕士，主要从事植物逆境生物学研究。
　　通讯作者：王冬梅（１９６３－），女，河北省景县人，博士，教授，主要从事植物逆境分子细胞生物学研究．
Ｔｅｌ：０３１２－７５２８２７６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｍｅｉｗａｎｇ６３＠１２６．ｃｏｍ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔ　ＡｔＡＴＧ８ｃｇｅｎｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ
ＴＩＡＮ　Ｌｉ－ｊｕａｎ，ＷＥＩ　Ｆｅｎｇ－ｊｕ，ＧＡＯ　Ｘｉａｎｇ，ＺＨＡＯ　Ｔｉａｎ－ｔｉａｎ，ＬＩＵ　Ｇａｎｇ，
ＨＯＵ　Ｃｈｕｎ－ｙａｎ，ＷＡＮＧ　Ｄｏｎｇ－ｍｅｉ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ　０７１００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｔＡＴＧ８ｃｇｅｎｅ　ｉｎ　ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ　ａｇａｉｎｓｔ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｗａｓ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｔｈｅ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ａｔａｔｇ８ｃｍｕｔａｎｔ　ｗａｓ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ａｔ　ＤＮＡ　ｌｅｖｅｌ　ｂｙ　ＰＣＲ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｔＡＴＧ８ｃ
ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ，ｔｈｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ａｔａｔｇ８ｃｗａｓ
ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｕｔａｎｔ．Ｄｒｏｕｇｈｔ，ｓａｌｔ，ａｎｄ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｏｎ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ
ｍｕｔａｎｔ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ａｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｔｏｃｋｉｎｇ　ｓｔａｇｅ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ，ａｔｇ８ｃｍｕｔａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｈａｎ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ａｔ　ｔｈｅ
ｂｏｔｈ　ｓｔａｇｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｗａｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｉｎ
ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｓｔａｇｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｅａｖｅｓ　ａｔ　ｓｔｏｃｋｉｎｇ　ｓｔａｇｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｗｉｌｔｉｎｇ，ｗｉｔｈｅｒｅｄ
ａｎｄ　ｙｅｌｏｗ，ａｎｄ　ａｇｉｎｇ　ｆａｓｔ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＡｔＡＴＧ８ｃｇｅｎｅ　ｐｌａｙｅｄ　ａ　ｃｒｕｃｉａｌ　ｒｏｌｅ　ｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ　ａｇａｉｎｓｔ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；ＡｔＡＴＧ８ｃ；ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ
　第５期 田丽娟等：拟南芥ＡｔＡＴＧ８ｃ基因缺失突变体的鉴定及其对非生物胁迫的响应
　　自噬（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ）是广泛存在于真核生物细胞
内的一种生命现象，是细胞在营养缺乏或应激条件
下，通过降解细胞内衰老的长寿命蛋白质、受损伤的
细胞结构和细胞器，为细胞的重建、再生和修复提供
必需原料，实现细胞内物质的再循环和再利用，是生
物体中一种重要的防御和保护机制［１］。已有研究表
明，在营养缺乏、植物免疫反应、叶片衰老以及环境
胁迫应答中均有自噬的参与［２－３］。
自噬相关基因（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ，ＡＴＧ）编
码的蛋白是参与自噬过程许多阶段的核心因素［４］。
到目前为止在酵母中已经发现了３１种ＡＴＧ 蛋白，其
中１８个被证明参与了自噬体的形成（ＡＴＧ　１－１０，
ＡＴＧ　１２－１４，ＡＴＧ　１６－１８，ＡＴＧ　２９，ＡＴＧ　３１）［５］。这些基
因的编码产物参与到自噬小泡形成的各个过程，包括
自噬的诱导、小泡的成核、延伸、成熟及与液泡的融合
等［６］。其中ＡＴＧ　８与磷脂酰乙醇胺结合后进入自噬
小泡的膜层，对自噬小泡的延伸与成熟是必需的，在
自噬体的形成过程中发挥重要作用［７］，通常ＡＴＧ　８被
用作自噬体的标记蛋白［８］。已有研究表明，拟南芥无
论在正常生长条件下，还是在饥饿胁迫条件下，都有
ＡＴＧ８基因的表达，并且在根中的表达量高于茎和
叶，主要在根的成熟区和与土壤接触的根冠中表
达［９］。Ｏｓｈｉｍｏｔｏ等人［１０］发现，在拟南芥缺氮的条件
下，ＡＴＧ８ａ－ＡＴＧ　８ｆ 在 转 录 水 平 均 呈 上 调 表 达。
Ｃｈｕｎｇ等［１１］观察到，在黑暗处理与缺氮条件下，玉米
的ＡＴＧ８均上调表达。目前关于ＡＴＧ８ 的研究多
以酵母为研究材料，来自拟南芥的报道也多集中于
ＡＴＧ８在转录水平上响应个别逆境胁迫的表达模式
研究。本研究以一份拟南芥 Ｔ－ＤＮＡ 插入突变体
（Ａｔａｔｇ８ｃ）为材料，通过对突变体的筛选鉴定，以期
获得该基因缺失表达的纯合突变体；通过对该突变
体与野生型拟南芥在不同非生物逆境胁迫下的生长
表型观察，对ＡｔＡＴＧ８ｃ在植物抵抗非生物逆境胁
迫中的作用进行探讨，为全面阐释ＡｔＡＴＧ８ｃ的功
能和作用机理奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料
野生型拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ，Ｃｏｌｕｍ－
ｂｉａ　ｅｃｏｔｙｐｅ）为河北农业大学生命科学学院植物逆
境生理实验室保存。ＡｔＡＴＧ８ｃ基因（ＡＴ１Ｇ６２０４０）
Ｔ－ＤＮＡ插入突变体购自 ＡＢＲＣ（Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ），编 号 为 ＳＡＬＫ
１５０６３１Ｃ。
１．２　试剂和工具酶
ＲＮＡｉｓｏＴＭｐｌｕｓ植物总 ＲＮＡ提取试剂、ＲＮａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ、ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ均购自 ＴＡＫＡＲＡ 公
司。ｄＮＴＰ、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶购自Ｔｉａｇｅｎ公司；其
他生化试剂均为进口分装或国产分析纯试剂。
１．３　拟南芥的培养
种子经消毒液［０．５％（ｖ／ｖ）ＮａＣｌＯ ＋ ０．０１％
（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００］消毒１５ｍｉｎ，无菌水洗５～６次，４
℃黑暗处理２ｄ。然后点种于 ＭＳ培养基上，生长７ｄ
左右，将幼苗移栽到土壤（蛭石∶营养土＝１∶１）中，用
透明塑料膜覆在花盆上保持湿度，４～５ｄ后，揭去塑
料膜。生长条件为：光／暗周期为１６ｈ／８ｈ，温度２２
℃，湿度６０％，光照强度８０～１００μｍｏｌ／ｍ
２ｓ。
１．４　拟南芥ＡｔＡＴＧ８ｃ突变纯合体的鉴定
按照 ＳＤＳ 方 法 提 取 拟 南 芥 叶 片 基 因 组
ＤＮＡ［１２］，以基因组ＤＮＡ为模板，根据ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇ－
ｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／网站上提供的 Ｔ－ＤＮＡ 插入位点信
息，设计引物，利用ＰＣＲ技术检测该突变体是否为
纯合体。引物分别为：ＬＢ：ＴＧＧＴＴＣＡＣＧＴＡＧＴ－
ＧＧＧＣＣＡＴＣＧ，ＬＰ：ＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＣＧ－
ＧＡＣ，ＲＰ：ＣＣＴＡＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＣＡＡＣＴＴＧ，由生
工生物工程（上海）股份有限公司合成。
１．５　ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡｔＡＴＧ８ｃ基因的表达量
按照Ｔａｋａｒａ　ＲＮＡｉｓｏＴＭＰｌｕｓ植物总ＲＮＡ提取
试剂盒的方法提取ＲＮＡ，将提取的ＲＮＡ反转录为
ｃＤＮＡ，以此为模板，内参基因 ＥＦ１ａ 作为对照，
ＥＦ１ａ 引物序列为 ＥＦ１－Ｆ：５’－ＡＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡ－
ＣＡＴＣＧＴＧＡＴＴＴＣＡＴ－３’，ＥＦ１－Ｒ：５’－ＴＴＧＧＣＧ－
ＧＣＡＣＣＣＴＴＡＣＧＴＧＧＡＴＣＡ－３’。反 应 条 件 为：
９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃５０ｓ，１８～
２５个循环；７２℃１０ｍｉｎ。按照调整内参基因的模板
量，进行目的基因扩增。目的基因引物序列为
ＡｔＡＴＧ８ｃ－Ｆ：５’－ＴＧＧＣＴＡＡＴＡＧＣＴＣＴＴＴＣＡＡＧ－
３’，ＡｔＡＴＧ８ｃ－Ｒ：５’－ＣＴ　ＣＣＡＣＴＧＡ　ＡＡＧＴＣＡＴＧ－
ＴＡＧ－３’。反应条件为：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５
℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，２５个循环；７２℃１０ｍｉｎ。琼脂
糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物。
１．６　非生物逆境胁迫应答表型分析
１．６．１　幼苗阶段逆境处理　野生型和ａｔｇ８ｃ突变
７
河 北 农 业 大 学 学 报 第３７卷　
体种子点种于 ＭＳ培养基上，在温室正常条件下竖
直培养４ｄ。每种基因型的拟南芥选取６棵长势相
同的幼苗移栽到 ＭＳ及不同处理（４％ ＰＥＧ、１７０
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、缺蔗糖、缺氮、缺磷）的 ＭＳ培养基上
进行处理。１４ｄ后，观察幼苗生长状态。
１．６．２　成苗阶段逆境处理　将 ＭＳ培养基上生长
７ｄ的幼苗移栽到装有同样重量营养土的小盆中，正
常生长４周后，分别进行盐处理和干旱处理。盐处理
时，将长势相同的不同基因型幼苗浇足水，直到再次
需要浇水时处理组浇含１７０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ盐溶液，对
照组定期浇水；干旱处理时，将长势相同的不同基因
型幼苗浇足水，直到再次需要浇水时处理组一直不浇
水，而对照组定期补充水。缺磷处理时，先将 ＭＳ培养
基上生长７ｄ的幼苗移栽到装有同样重量蛭石的小盆
中，待正常生长４周后，选取长势相同的幼苗浇足水，
直到再次需要浇水时处理组浇缺磷的Ｈｏａｇｌａｎｄ营养
液，而对照组一直补加全成分Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液。对以
上各种处理的幼苗进行植株生长状态观察并拍照。
１．６．３　成苗阶段黑暗处理　取生长４周的第一或
第二片真叶作为试验材料，将叶片按顺序放置在用
３ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ（ｐＨ　５．７）浸湿的滤纸上，之后放置
在黑暗环境下。每隔一天观察叶片变化，并照相。
２　结果与分析
２．１　ＡｔＡＴＧ８ｃ基因Ｔ－ＤＮＡ插入突变体的鉴定与基
因表达情况
ＡＢＲＣ提供的信息显示，ａｔａｔｇ８ｃ突变体的 Ｔ－
ＤＮＡ插入位点为距起始密码子 ＡＴＧ上游第１３４
核苷酸处，位于第２个内含子上（图１）。为了检查
ａｔａｔｇ８ｃ突变体（ＳＡＬＫ＿１５０６３１Ｃ）是否为纯合体，利
用ＰＣＲ方法在 ＤＮＡ水平检测 Ｔ－ＤＮＡ插入的情
况。结果如图２所示，用ＬＢ＋ＲＰ引物搭配，１、２、３
号植株可以扩增出约７００ｂｐ的条带，野生型不能扩
出条带；利用ＬＰ＋ＲＰ进行搭配，１、２、３号植株未见
条带，而野生型样品的泳道可见约９００ｂｐ的条带。
以上结果表明１、２、３号植株均为ＡｔＡＴＧ８ｃ基因的
Ｔ－ＤＮＡ插入纯合体。
为进一步检测ＡｔＡＴＧ８ｃ基因在转录水平的表
达情况，通过ＲＴ－ＰＣＲ技术比较突变体与野生型植
株中ＡｔＡＴＧ８ｃ的表达水平，结果如图３，野生型材
料中可以观察到很亮的ＡｔＡＴＧ８ｃ条带，而突变体
中几乎没有ＡｔＡＴＧ８ｃ的表达，这一结果表明，被检
测的突变体株系为ＡｔＡＴＧ８ｃ基因敲除突变体。
图１　拟南芥ａｔｇ８ｃ突变体Ｔ－ＤＮＡ插入位点
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　ｏｆ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ａｔｇ８ｃｍｕｔａｎｔ
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１、２、３，分别代表３个不同的突变体株系；
ＷＴ：野生型拟南芥
图２　突变纯合体的ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ．２　ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎ
图３　野生型和突变体中ＡｔＡＴＧ８ｃ的表达量分析
Ｆｉｇ．３　Ｅｘｐｒｅｓｓｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＡｔＡＴＧ８ｃｉｎ
ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
２．２　幼苗阶段非生物胁迫下的生理表型观察
在正常 ＭＳ培养基上，野生型与ａｔｇ８ｃ突变体的
幼苗生长状态正常且无明显差异（图４Ａ）。当野生型
和突变体幼苗处于４％ＰＥＧ（图４Ｂ）和缺氮培养基（图
４Ｅ）上时，幼苗根部和冠部的生长较在 ＭＳ上均受抑，
突变体的根较野生型稍短；在１７０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ培养
基（图４Ｃ）上，突变体和野生型的生长均受到严重抑
制，且突变体受抑制程度更重，根部明显比野生型短，
冠部也表现出较野生型生长更弱的表型；在缺碳（缺
蔗糖，图４Ｄ）和缺磷（图４Ｆ）的培养基上，拟南芥根部
和冠部的生长相较在 ＭＳ上均受到抑制，尤其在缺磷
的培养基上受抑更为明显，且突变体的根长较野生型
受抑程度更重。以上结果表明，在不同逆境条件下拟
８
　第５期 田丽娟等：拟南芥ＡｔＡＴＧ８ｃ基因缺失突变体的鉴定及其对非生物胁迫的响应
南芥生长均受到了抑制，但突变体较野生型对不同逆
境胁迫更为敏感，尤其根的生长受抑明显。从中可以
看出，ａｔｇ８ｃ突变体对上述逆境胁迫的耐受程度不如
野生型，表明ＡｔＡＴＧ８ｃ基因可能与拟南芥幼苗期抵
抗各种非生物胁迫有关。
Ａ：ＭＳ培养基上拟南芥生长表型；
Ｂ：含４％ＰＥＧ培养基上拟南芥生长表型；
Ｃ：含１７０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ培养基上拟南芥生长表型；
Ｄ：缺碳培养基上拟南芥生长表型；
Ｅ：缺氮培养基上拟南芥生长表型；
Ｆ：缺磷培养基上拟南芥生长表型
图４　野生型与ａｔｇ８ｃ突变体苗期
在非生物逆境下的表型差异
Ｆｉｇ．４　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ
ａｔｇ８ｃｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｏｎ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｍｅｄｉｕｍ．
２．３　成苗阶段黑暗处理生理表型观察
为了解ＡｔＡＴＧ８ｃ基因在叶片衰老过程中的作
用，本研究观察了拟南芥野生型与突变体离体叶片
在黑暗处理下的变化。结果表明，ａｔｇ８ｃ突变体在
黑暗处理的第４天，叶片的近叶柄部出现褪绿，第６
天叶片整体变白，此后随着黑暗天数增加叶片枯黄
趋于严重；而野生型材料在第６天时叶片开始褪绿，
第８天叶片仍呈浅绿色，第１０天才开始整片叶变
白。黑暗处理试验显示，ａｔｇ８ｃ突变体表现出较野
生型加速衰老的表型，说明ＡｔＡＴＧ８ｃ基因可能与
拟南芥叶片衰老过程中叶绿体的降解有关。
图５　野生型与ａｔｇ８ｃ突变体的离体
叶片在黑暗处理下的变化
Ｆｉｇ．５　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ａｔｇ８ｃ
ｍｕｔａｎｔｓ　ｄｅｔａｃｈｅｄ　ｌｅａｖｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄａｒｋ
２．４　成苗阶段缺磷处理生理表型观察
成苗阶段进行缺磷处理时，发现在生长后期，
ａｔｇ８ｃ突变体莲座叶较早出现枯黄、萎蔫的衰老现
象（图６Ａ），突变体的主茎纤细，株高明显低于野生
型植株（图６Ｂ，６Ｃ，Ｐ＜０．０５）。这说明ＡＴＧ８ｃ基因
对植物的营养生长至关重要，可能与植物对磷素的
吸收、利用有关。
Ａ：缺磷处理后莲座叶表型；Ｂ：缺磷处理后株高表型差异；
图６　野生型与ａｔｇ８ｃ突变体在缺磷胁迫下表型差异
Ｆｉｇ．６　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ａｔｇ８ｃｍｕｔａｎｔ　ｕｎｄｅｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｔｒｅｓｓ
９
河 北 农 业 大 学 学 报 第３７卷　
２．５　成苗阶段干旱处理生理表型观察
成苗阶段进行干旱处理时，处理组经过一段时
间的干旱胁迫，ａｔｇ８ｃ突变体植株均表现萎蔫干枯，
而野生型植株与对照组植株长势相近，只是处理组
的叶片略显萎蔫（图７）。说明ＡＴＧ８ｃ基因在成苗
期拟南芥响应干旱胁迫过程中可能发挥重要作用。
图７　野生型与ａｔｇ８ｃ突变体
在干旱胁迫下表型差异
Ｆｉｇ．７　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ
ａｎｄ　ａｔｇ８ｃｍｕｔａｎｔ　ｕｎｄｅｒ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ．
２．６　成苗阶段盐处理生理表型
与对照相比，在盐胁迫下（１７０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处
理１个月），拟南芥ａｔｇ８ｃ突变体和野生型的叶片均
较对照稍有褪绿现象，两者在植株长势上的差异不
明显。表明ＡＴＧ８ｃ基因在成苗阶段可能对拟南芥
响应盐胁迫的作用不明显。
３　讨论
在植物生长发育过程中，常会受到盐、干旱等各
种非生物胁迫。通常情况下，高盐往往造成离子胁
迫，而干旱则导致渗透胁迫［１３］。这２种胁迫会产生
活性氧（ＲＯＳ），导致 ＲＯＳ和氧化相关蛋白的积
累［１４－１５］，进而造成对植物细胞的伤害。有研究表明，
自噬在植物抵抗非生物胁迫中有重要作用，自噬通
过分解氧化相关蛋白和调节ＲＯＳ水平参与到盐胁
迫和氧化胁迫中［１６］。一些自噬相关基因（ＡＴＧ）在
响应盐胁迫和渗透胁迫时呈上调表达，如拟南芥中
的ＡｔＡＴＧ８［１９］。本研究通过对拟南芥幼苗期与成
苗期ａｔｇ８ｃ突变体与野生型的表型比较分析，在胁
迫条件下，突变体的生长情况远不如野生型，尤其观
察到幼苗期干旱与盐胁迫下突变体的根长不如野生
型，可见野生型更有利于吸收水分与矿质元素以确
保在 干 旱 与 逆 境 胁 迫 下 的 生 存，更 加 证 实 了
ＡｔＡＴＧ８ｃ在拟南芥抵抗盐与干旱胁迫中的重要作
用。至于为何在逆境胁迫下突变体的根长不如野生
型的问题，作者拟在以后的研究中通过观察逆境下
突变体根部细胞结构与数量变化以分析原因。
营养胁迫主要是指元素匮乏，比如碳匮乏、氮匮
乏、糖饥饿、黑暗胁迫等。有报道指出，在饥饿和黑
暗胁迫中自噬相关基因在转录水平明显地上调表
达，如 ＡｔＡＴＧ４ａ、ＡｔＡＴＧ４ｂ、ＡｔＡＴＧ８ａ－ＡｔＡＴＧ８ｉ、
ＡｔＡＴＧ３和ＡｔＡＴＧ７，自噬提供了细胞不仅适应氮
缺乏而且适应氮过多的机制［１７－１８］。本研究发现，
ａｔａｔｇ８ｃ突变体无论在幼苗还是成苗阶段的营养胁
迫下均表现出较野生型弱的生长状况，尤其在幼苗
期缺碳和缺磷的培养基上野生型的根长明显长于突
变体，说明ＡＴＧ基因不受损的野生型更有利于从
环境中吸收矿质营养，在营养匮乏条件下较突变体
更利于生长生存。Ｗａｄａ等人［１９］的研究发现，黑暗
处理时，野生型拟南芥叶肉细胞的液泡内观察到大
量降解Ｒｕｂｉｓｃｏ的自噬体和３～４μｍ含部分叶绿体
的结构，而突变体（ａｔｇ４ａ、ａｔｇ４ｂ－１）液泡中则没有观
察到这两种结构，推测在饥饿条件下，植物细胞可以
利用自噬降解叶绿体维持生命活动。本研究也发
现，在黑暗处理条件下ａｔｇ８ｃ突变体表现出较野生
型加速衰老的表型，说明ＡｔＡＴＧ８ｃ基因可能与拟
南芥叶片衰老过程中叶绿体的降解有关。
本研究中，拟南芥野生型植株在各种非生物逆
境下均表现出了较ａｔｇ８ｃ突变体好的生长表型，说
明ＡｔＡＴＧ８ｃ基因在植物响应各种非生物胁迫中均
表现出了一定的功能，表明ＡｔＡＴＧ８ｃ基因在植物
抵抗盐、干旱和营养匮乏胁迫中可能发挥重要作用。
这为进一步阐释ＡｔＡＴＧ８ｃ的功能和作用机理奠定
了基础，对深入研究自噬在植物响应各种非生物逆
境胁迫中的作用具有促进作用。
参考文献：
［１］　Ｙｏｒｉｍｉｔｓｕ　Ｔ，Ｋｌｉｏｎｓｋｙ　Ｄ　Ｊ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍａｃｈｉｎｅｒｙ　ｆｏｒ　ｓｅｌｆ－ｅａｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｅｌ　Ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒ－
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００５，１２：１５４２－１５５２．
［２］ Ｓｅａｙ　Ｍ，Ｐａｔｅｌ　Ｓ，Ｄｉｎｅｓｈ－Ｋｕｍａｒ　Ｓ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ａｕｔｏｐｈ－
ａｇｙ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ　ｉｎｎａｔｅ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｃｅｌｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉ－
ｏｌｏｇｙ，２００６，８（６）：８９９－９０６．
［３］ Ｂａｒｔｏｌｏｍｅｏ　Ｓ　Ｄ，Ｎａｚｉｏ　Ｆ，Ｃｅｃｃｏｎｉ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ
ｏｆ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｄｕｒｉｎｇ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　ｈｉｇｈｅｒ　ｅｕ－
ｋａｒｙｏｔｅｓ［Ｊ］．Ｔｒａｆｆｉｃ，２０１０，１１：１２８０－１２８９．
［４］ Ｋｕｎｉｎｏｒｉ　Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍａｎａｍｉ　Ａｋｉｏｋａ，Ｙｏｓｈｉｎｏｒｉ　Ｏｈｓｕ－
ｍｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｉｎｅ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
０１
　第５期 田丽娟等：拟南芥ＡｔＡＴＧ８ｃ基因缺失突变体的鉴定及其对非生物胁迫的响应
ｄｕｒｉｎｇ　ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，１２６：
２５３４－２５４４．
［５］ Ｓｕｚｕｋｉ　Ｋ，Ｋｕｂｏｔａ　Ｙ，Ｏｈｓｕｍｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｉｅｒａｒｃｈｙ　ｏｆ
Ａｔｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐｒｅ－ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｒｇａｎｉ－
ｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｓ，２００７，１２：２０９－２１８．
［６］ Ｘｉｅ　Ｚ，Ｎａｉｒ　Ｕ，Ｋｌｉｏｎｓｋｙ　Ｄ　Ｊ．Ａｔｇ８　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｐｈａｇｏ－
ｐｈｏｒｅ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌ，２００８，１９：
３２９０－３２９８．
［７］ Ｎａｋａｔｏｇａｗａ　Ｈ，Ｉｃｈｉｍｕｒａ　Ｙ，Ｏｈｓｕｍｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．
Ａｔｇ８，ａ　Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ａｕｔｏｐｈａ－
ｇｏｓｏｍｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ
ａｎｄ　ｈｅｍｉｆｕｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｅｌ，２００７，１３０：１６５－１７８
［８］ Ｌｏｎｇａｔｔｉ　Ａ，Ｔｏｏｚｅ　Ｓ　Ａ．Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ　ａｎｄ　ａｕ－
ｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｅｌ　Ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎ－
ｔｉａｔｉｏｎ，２００９，１６：９５６－９６５．
［９］ Ｓｌａｖｉｋｏｖａ　Ｓ，Ｕｆａｚ　Ｓ，Ａｖｉｎ－Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎ
ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ａｔｇ８ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｔｏ　ｈｏｒｍｏｎａｌ　ｃｏｎ－
ｔｒｏｌｓ　ａｎｄ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｏｔ，２００８，５９：
４０２９－４０４３．
［１０］ Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ　Ｋ，Ｈａｎａｏｋａ　Ｈ，Ｓａｔｏ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
ｏｆ　ＡＴＧ８ｓ，ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｄｅｃｏｎｊｕ－
ｇａｔｉｏｎ　ｂｙ　ＡＴＧ４ｓａｒｅ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００４，１６：２９６７－２９８３．
［１１］ Ｃｈｕｎｇ　Ｔ，Ｓｕｔｔａｎｇｋａｋｕｌ　Ａ，Ｖｉｅｒｓｔｒａ　Ｒ　Ｄ．Ｔｈｅ　ＡＴＧ
ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ：ＡＴＧｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｐｔｓ　ａｎｄ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＡＴＧ８－ｌｉｐｉｄ　ａｄｄｕｃｔ　ａｒｅ
ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９，１４９：２２０－２３４．
［１２］ 魏凤菊．拟南芥钙依赖型蛋白激酶ＣＰＫ１０参与干旱
胁迫下气孔调节的功能分析［Ｄ］．北京：中国农业大
学，２０１０．
［１３］ Ｚｈｕ　Ｊ．Ｃｅｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ，ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　ｃｏｌｄ
ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ，２００１，４：４０１－４０６．
［１４］ Ｔｓｕｇａｎｅ　Ｋ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｋ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｒｅ－
ｃｅｓｓｉｖｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｍｕｔａｎｔ　ｔｈａｔ　ｇｒｏｗｓ　ｐｈｏｔｏａｕ－
ｔｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｙ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｓｈｏｗｓ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ａｃｔｉｖｅ
ｏｘｙｇｅｎ　ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，１９９９，１１：
１１９５－１２０６．
［１５］ Ｈｏｎｇ　Ｚ，Ｌａｋｋｉｎｅｎｉ　Ｋ，Ｚｈａｎｇ　Ｚ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｍｏｖａｌ　ｏｆ
ｆｅｅｄｂａｃｋ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄ１－ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ
ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｐｒｏｌｉｎｅ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｏｓｍｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０００，１２２：１１２９－１１３６．
［１６］ Ｈａｎ　Ｓ，Ｙｕ　Ｂ，Ｌｉｕ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ
ｉｎ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｃｅｌ，２０１１（２）：７８４－
７９１．
［１７］ Ｒｏｓｅ　Ｔ　Ｌ，Ｂｏｎｎｅａｕ　Ｌ，Ｄｅｒ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
［Ｊ］．Ｂｉｏｌ　Ｃｅｌ，２００６，９８：５３－６７．
［１８］ Ｇｕｉｂｏｉｌｅａｕ　Ａ，Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ　Ｋ，Ｓｏｕｌａｙ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ａｕｔｏｐｈ－
ａｇｙ　ｍａｃｈｉｎｅｒｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ
ｗｈｏｌｅ－ｐｌａｎｔ　ｌｅｖｅｌ　ｕｎｄｅｒ　ｂｏｔｈ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ａｎｄ　ａｍｐｌｅ　ｎｉ－
ｔｒａｔｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｎｅｗ　Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，
２０１２，１９４：７３２－７４０．
［１９］ Ｗａｄａ　Ｓ，Ｉｓｈｉｄａ　Ｈ，Ｉｚｕｍｉ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｐｌａｙ
ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ
ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｙ　ｄａｒｋｅｎｅｄ　ｌｅａｖｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，
２００９，１４９：８８５－８９３
（编辑：梁　虹）
１１