全 文 ：2012 年 月
第 卷 第 期
四川大学学报 自然科学版
一
参与拟南芥盐胁迫信号应答过程
文国琴 ,` , 刘志斌 `, 李旭锋 , , 王健美 ,` 杨 毅 `
四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 , 成都
西华师范大学生命科学院 , 南充 。。
摘 要 为了探索 在盐胁迫信号传递途径中可能的传递关系 ,以 转基因拟
南芥过量表达和抑制表达株系为材料 ,初步探索盐胁迫过程中该基因参与信号传递的方式 实
验分析了 处理对种子萌发的影响 、 对 胁迫下种子萌发的影响 ,以及 对气
孔运动的影响和盐胁迫相关基因的表达水平 实验结果指出 , 基因表达水平变化影
响了拟南芥对 的敏感性 高表达的 使得拟南芥种子对 敏感性提高 ,种
子萌发率降低 ,气孔关闭较快 而低表达的 使得拟南芥对 敏感性降低 ,种子萌
发率高 ,气孔不易关闭 在 胁迫下添加 ,提高了敏感株系种子的萌发率 ,因而推测
“ 帮助 转基因拟南芥过量表达株系平衡下游的胁迫应答 用实时荧光定量
检测盐胁迫应答相关基因 , 的表达水平 ,发现 的高表达引起了下游应
答基因 , 表达水平的相应提高 相反 的抑制表达则导致 , 表
达水平下降 由此说明 , 参与了拟南芥盐胁迫应答过程
关键词 拟 南芥 电压依赖型阴离子通道 信号传递
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一 一
万 一 ,` , 一 `, 一 , 八 一材亡 ` , 恤
一 ,
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一
一
, 一
收稿 日期 一 一
基金项目 高等学校重点实验室访问学者基金 、国家自然科学基金项目 ,
作者简介 文国琴 一 ,女 ,宜宾人 ,博士 ,研究方向为植物遗传与分子生物学 一
通讯作者 杨毅 。
四川大学学报 自然科学版 第 卷
,
, , ,
·
, 一 , ,
引 言
线粒体是细胞中重要的细胞器 ,控制细胞的呼
吸 、凋亡等多种生命活动进程 线粒体蛋白质主要
分布在线粒体内膜上 ,影响线粒体的生命活动 而
线粒体外膜上蛋白质相对较少 ,其中最重要的蛋白
质就是电压依赖型阴离子通道蛋白 一
, ·, 〕在线粒体物
质进出方面有着重要的作用 ,例如在细胞凋亡过程
中 ,细胞色素 的释放阁
生物体内的 功能具有较强的保守性
已经 有 研 究 指 出 ,植 物 程 序 性 细 胞 死 亡 。
, 和哺乳动物细胞 凋亡
具有相似性 , 参与了植物体内的 进
程 一`口
在环境发生变化时 ,如病原侵染 、非生物胁迫
等 ,或在生长发育的某个阶段 ,植物会出现程序性
细胞死亡 这个过程 中是否有 参与 有
学者对水稻进行研究发现 ,盐渍使得各个
均上调叫 在珍珠粟中的研究也有同样的结果 ,
是盐诱导基因 〔`。〕
拟南芥是生物学中研究基因功能重要的模式
植物 ,其 家族 有 个基 因 ,
, ,
, ,
拟南 芥 是否 同样受 到盐诱
导 ,在其中的功能如何 ,还没有研究对此进行说明
为此 , 以 为 目标基 因 ,构 建了
的过量表达和抑制表达转基因拟南芥 ,探索
直接参与盐胁迫应答过程的证据 ,并初
步探讨 参与调控盐胁迫信号转导的可
能途径 ,为进一步解释盐胁迫应答机制奠定基础
材料和方法
实验材料
野生型拟南 芥 占 、 为
生态型
转 基因拟南芥过 量表达株 系
, , 转基因拟南芥抑制表达株系
一 , 一 〕
实时荧光定量采用 公 司
实 时荧 光定量
引物 ,如表 引物合成由上海英骏生物技术
有限公司完成
提取等常规分子生物学试剂盒购自成都
博瑞克生物技术公司 ,普通化学药品均为国产分析
纯
实验方法
培养拟南莽 将营养土和蛙石按照 ,
混合后加人 大量元素 、微量元素 、铁盐拌匀
至适 当的湿润程度后高压湿热灭菌 ,冷却
将所需花钵洗净 ,高压湿热灭菌 ,冷却 将
灭好菌的营养土分装至花钵中备用 将拟南芥幼苗
移栽到花钵 中 ,培养于 士 ℃ ,光照 ,黑 暗
的培养箱中 ,约 后可用
转基 因拟南芥鉴定
① 水平检测及阳性纯合植株培养
收集种子 ,置于 十 培养基上
培养 , 后观察幼苗生长情况 选择在平板上不
发生性状分离的株系 ,挑取幼苗转移至土壤 中培
养 ,生长一个月后提取叶片总 ,用
引物以及 基 因特异性引物搭 配对转基
因植株进行鉴定 得纯合子种子
② 水平检测
分别 提 取 野 生 型 纯 合 苗 叶 片 总 , 用
除去 ,反转录后用 基因特
异引物 〕 一 和拟南芥的内参分 引
物 一 ,如表 对各独立株系进行实时荧光
定量 ,检测基因 水平变化
处理条件下 转基 因拟 南
芥种子的萌发
将 转 基 因拟 南 芥 种 子 和 野生 型
种子 春化 ,用升汞 消毒
, 乙醇灭菌 ,在播种于 、
、 十
培养基平板上 观察野生型和转基 因株系
的萌发状况 实验重复 次 ,播种数大于
处理下 转基 因拟南芥叶
第 期 文国琴等 参与拟南芥盆胁迫信号应答过程
片气孑乙运动
一 周龄拟南芥完全展开的叶片 ,用蒸馏水
洗净 ,培养在 缓冲液 `〕
, , ,
中 ,在 ℃光照 · 下培养
,使气孔完全张开
从缓 冲液 中取 出叶片 ,置于含有
的新鲜缓冲液中 , 取出叶片 ,用透
明胶固定样品于载玻片 ,显微镜下观察记录气孔开
度 气孔开度大小均在 倍的光学显微镜下
成像 ,用 软件测定 每个处理取 个
叶片 ,每叶片随机取 个视野 ,测定记录
个气孔长轴和短轴 ,并得到短轴和长轴的比值 ,
作为气孔开度的值 以不同处理下的 拟南芥
气孔开度作为对照 ,计算各转基因株 系相对于
的气孔开度大小 ,用百分比表示 每个处理重
复 次
盐胁迫相关基 因的 实时荧光定童 分
析 方 法同 , 用 目的基 因特异 性 引物
一 , 一 和拟南芥的内参户 引物
一 ,如表 对各独立株系进行实时荧光定
量 分析 平行实验 次 ,用 一 软件
分析表达量差异
表 已 转基因拟南芥 鉴定和实时荧光定 检测引物
基因 引物序列 , ` 产物长度
, 一
一
一
一
和 、 表 达 量 均 采 用
乙 值 法分析 , 基 因 与 户 差为
乙 ,再由乙 计算出基因相对表达量
结果与分析
转基因植株的检测
水平检测
提取转 基因植株叶片 ,以 引
物 和 基 因 特 异 性 上 下 游 引 物
对转基因植株进行 水平鉴定 如
图 结果显示 , 砚 基因片段成功保留在转
基因拟南芥的过量表达株系和抑制表达株系中
水平检测
提取拟南芥 叶片 ,反转 录后 以
基因特异性引物 一 进行实时荧
光定量 ,检测 表达水平变化 实验
结果显示 ,在 转基因拟南芥过量表达株
系中 , 水 平显 著上调 ,达到对照 的
倍以上 ,而在抑制表达株 系中 , 表达水
平下降 ,约为对照的 如图
以上结果显示 ,在 转基因拟南芥的
过量表达株系和抑制表达株系中 ,已经成功地稳定
转人了目的基因 ,同时该基因在过量表
四川大学学报 自然科学版 第 卷
五 “一` 一 弓 、 一 弓 、刀 一
、一 】 , 一
图 转基因拟南芥 检测
器姗 夏念并州擂十 一 一
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粥籍咽友泪已八丈﹄侧
一 一
图 荧光定量 检测 的相对表达
一
图 处理下 转基因拟南芥种子的
萌发率
对照组 ,种子在 平板上萌发
处理组 , 平板上添加
达株系和抑制表达株系达到了预期的表达水平 ,可
用于后续实验
口 影响拟南芥种子在 胁迫下的
萌发情况
在 平板上 ,经过 春化的拟南芥种子萌
发快且整齐 在第三天即可看到 以上种子萌
发 ,第 时 ,完全萌发 各个种子之间没有差异
在含有 平板上 ,种子萌发延
迟 ,萌发率下降 如 图 首先 , 转基因
拟南芥过量表达株系种子萌发率低 , 到
之间 ,且 萌发晚 ,表现对 敏感 抑制表达株系
种子萌发率高 ,在 到 之间 ,萌发较早 ,表
现对 迟钝 、不敏感 而作 为对照 的 在
处理下 ,萌发率处于二者之间
“十在多种信号传导过程 中都有重要的作
用 ,是细胞内重要的第二信使 在盐胁迫下 ,外源
十可以减缓盐胁迫造成的伤害 ,提高细胞对盐
胁迫的耐受能力 ,`一`〕 在 处 理 中补充
可以提高玉米 、大豆等植物萌发率 ·”〕
为了探索 在 转基因植株盐胁
迫应答 中是否有联系 ,对 处理进行了 “ 的
补充 ,实验发现 对于
的处理中 ,各个株系的萌发率几乎没
有区别 ,都大致等于 。 ,和未处理相当 修
正 了这种 失调引起的 胁迫应答的
失控 ,使得本该受到 胁迫而降低的种子萌发
率恢复到未受胁迫的水平 由此认为 ,在 认
参与的 胁迫应答过程 中可能有
的作用
第 期 丈国琴等 参与拟南芥盐胁迫信号应答过程
口 影响拟南芥气孔对盐胁迫的应答
过程
在表皮缓冲液中添加了 处理叶片 ,经过
后 ,显微镜下观察气孔的变化 如图 ,发
现 溶液对野生型和 转基因拟南
芥各株系的气孔运动均有影响 ,引起气孔关闭的效
果 而过量表达株系表现出对 敏感 ,气孔关
闭明显 ,其大小约为 的 ,而抑制表达株
系则对 不敏感 ,开度几乎没有明显变化 ,约
为 的 左右
︵侧溜并念十享
干 一 一
图 处理下 转基因拟南芥气孔关闭
气孔运动受到环境中水分含量的影响 ,本质是
水分流动方向从水势高的地方流向水势低的地方
以 溶液处理叶片 ,溶液水势较低 ,气孔感受
到水分亏缺的变化 ,也是气孔对水分敏感性的反
应 ,于是气孔关闭 由此认为 参与了拟
南芥叶片气孔对 信号的应答过程
口 影响拟南芥植株 中盐胁迫相关基
因的表达
植物在盐胁迫应答过程中 , 途径的基因
产生应答反应 转基因拟南芥的生长特
征反应 参与了盐胁迫应答 ,但是其具体
位于哪个位置或如何进行调控还需要研究 于是 ,
以 途径中的主要应答分子 , 作为
标记基因 ,分析在 转基因拟南芥中这些
基因的表达水平变化 结果显示 在 转
基因拟南芥过量表达株系中 , 、 表达量
显著增加 ,抑制表达株系则相反 和
在 中 ,表达量增加 ,分别达到野生型的
和 倍以上 ,在 中也分别达到了 和
倍以上 在抑制表达株系中则相反 ,均仅为野生型
的 以下
编码质膜上的 反向转运体
编码具有类似酵母 的 端的苏氨酸
丝氨酸蛋白激酶 盐胁迫下它们与维持植物体内
十营养有关 ,而且在一条信号通路上 〕 体内
扩十的靶蛋白很多 , 蛋白激酶 、磷酸酶和 结
合蛋白都可能参与了该信号转导途径 , 。〕胞内
平衡的调节 ,一方面依赖于质膜上的 ,
另外一方面 ,胞内液泡膜上分布的 也可以
通过转运 进人液泡而达到降低 伤害的作
用
根据以上实验结果 ,推测 参与拟南
芥盐胁迫应答 ,通过对 调控下游的信号分子
, 过量表达使得信号传递更
快 ,表现出盐胁迫下的生长敏感 ,而在
阔粥均友籍“的
,﹄,上﹃
溯契粥友坦
十
图
一 一
荧光定童 检测 、 的相对表达
, 一
四川大学学报 自然科学版 第 卷
抑制表达引起信号传递受阻 ,不能正常传递 ,因而
表现盐胁迫信号的缺失 ,生长反应迟钝 、不敏感
讨 论
土壤盐渍化是现在农业生产中面临的最大的
环境胁迫之一 ,严重影响全球农业生产与生态环
境 尤其在干旱地区 、沿海地区 ,由于过度蒸发 、海
水倒灌 、以及过度灌溉等原因导致土壤中盐分上
升 土壤中的高盐分将导致植物体内离子代谢紊
乱 , 引起生物产量降低 , 甚至植物死亡 土壤盐碱
化造成土地资源的浪费 ,不利于农业生产 的发展
全球至少有 的灌溉土地都受到盐胁迫的严重
危害 为了减少盐胁迫的危害 ,盐胁迫应答以及耐
盐性研究成为长期的研究的热点
是线粒体外膜的重要蛋 白 ,控制着线
粒体内外重要的物质进出 ,参与植物体内的各种信
号传递
通过对 转基因植株的种子萌发 ,气
孔运动的观察 ,发现 过量表达提高拟南
芥对 的敏感性 ,其表达量降低引起拟南芥对
失敏 由此认为 ,在拟南芥对 的胁迫应
答中 , 参是该途径的一个调控因子
十在细胞中是重要的第二信使 ,参与了细
胞中广泛的信号转导过程 指出 ,在正常条
件下植物体正常生长所需的钙 , 在盐胁迫条件下
变得不足 〕,这可能是由于盐离子抑制了植物体
对 十的吸收和利用 盐胁迫对植物的伤害 ,主要
通过破坏质膜上的钙信号系统完整性和传递过
程 ·``〕因而盐胁迫下补充适量的外源钙 ,一方面
可 以缓解 因钙不 足造成 的矿质营养缺乏 , 另一方
面适量的钙能够协助质膜的稳定和钙信号系统的
正常发生和传递 , 从而维持细胞内离子平衡
盐胁迫中 ,胞外 减轻盐胁迫主要是 由于
“十能减少细胞壁和质膜对 的吸附 ,保持了
植物细胞内膜系统的完整性和功能 ,增加了质膜
十通道的活性 ·` 〕,降低 十 、, 〕`
通过 对 处 理 补充 的实验 ,发 现 ,
十修正了 失调引起的 胁迫应答的
失控 ,使得本该受到 胁迫而降低的种子萌发
率恢复到未受胁迫 的水平 由此认 为 , 十参与了
相关 的 胁迫应答过程 ,然而 ,其具体
作用的方式还需要进一步研究
植物在受 到盐胁迫 伤害时 ,生长紊 乱 , 、
和 酶活 、 含量等生理生化指标发
生改变 如 基因转入油菜 〕后 ,盐胁迫中植
株 、 和 酶活增加 , 含量降低 ,
同时油菜耐盐性的提高 在本实验中 ,未对此进行
详细分析 ,其中是否有类似表现 ,还需要进一步实
验证明
于是 ,提出了 参与拟南芥体内盐胁迫
应答过程的模式 在 胁迫应答的信号转导
中 ,存在如下的传递过程 环境中的盐胁迫
信号传递给细胞 ,经过一系列传递后到达
过量表达使得信号经由 十传递放大信
号 ,引起胁迫过度的下游的反应 ,产生毒害效应 或
盐胁迫应答基 因 , 表达量随之改变 而
抑制表达使得信号传递受阻 ,下游反应停留在正常
生长环境的状态 ,植株反应迟钝
在线粒体中具有重要地位 ,在此只对
参与植物盐胁迫应答过程提出了简单
而直接的证据 而 的具体传递过程 ,相互联
系的上下游蛋 白 , 在 能量交换 的核 心位 置
及其相关的传递过程与能量代谢之间是否有直接
的关系 ,等等 ,依然了解得很少 更深人的 了解
口八 作为信号传递分子的作用 ,还有很多研究
工作有待进行
参考文献
」
〕
〕
〔
」
〕
一
卜
」 , ,
, ,
。 。 〕 , ,
,
。 〕
, ,
, , ,
〕 , ,
, ,
, 一
, ,
, ,
,
第 期 文国琴等 参与拟南芥盆胁迫信号应答过程
〔 〕 , ,
〕 , , , 。
〕
, ,
〕 , , ,
一 〕 ,
,
〕 , , ,
,
〕
, ,
〕 , , ,亡
〔 〕
, ,
〔 文国琴 ,刘震 ,李德款 , 等 拟南芥电压依赖型阴离
子通道参与水杨酸信号应答【〕 中国农业科技导
报 , ,
〕 , , , 。
〔 〕 , ,
〔 〕 , 〔 」
, ,
〔 〕 君
〔 ,
,
〕
〕 ,
,
龚明 , 杨兴富 钙对玉米幼苗抗盐性的效应 〔 〕 植
物生理学通讯 , ,
冯文新 , 张宝红 钙处理对盐胁迫下大豆种子萌发
及其生理生化指标的影响 〕 大豆科学 , ,
︼,门」内, `,孟`土一
吞 〕 ,
, ,
么
,
〔 , ,
, , ,
,
〕 , ,
,
〔 〕 , ,
, ,
, , ,
,
〕 , ,
元 〕
, , ,
奉斌 , 代其林 , 刘婷婷 , 等 转 基因甘蓝型油
菜对 胁迫的耐受性应答 〔 」 四川大学学报
自然科学版 , ,
一气︶乙心乙自工一
〕
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