全 文 ：中国农学通报 2016,32(14):44-49
Chinese Agricultural Science Bulletin
新疆小拟南芥NPR1基因对植物
系统获得性抗性的影响
裴 娟，欧秀玲，李 凤，孔德真，王 琨，易小龙，祝建波，王爱英
（石河子大学生命科学学院，石河子农业生物技术重点实验室，新疆石河子 832003）
摘 要：旨在研究小拟南芥NPR1基因的第三内含子对基因表达的影响。克隆出带有第三内含子的小拟
南芥NPR1基因，构建诱导型植物表达载体并对拟南芥进行农杆菌遗传转化，经 5 mmol/L外源水杨酸
12 h诱导，利用Real-time PCR技术检测拟南芥病程相关蛋白的表达量。结果显示野生型拟南芥的
NPR1、PR-1、PR-2、PR-5表达量高于转基因拟南芥；相对于野生型拟南芥，转基因拟南芥中SOD、POD酶
活显著降低，而CAT酶活增加未达到显著水平。结果表明转入含有第三内含子的Ap.NPR1基因，转基
因植株系统获得性抗性途径受到抑制，植株抗病性降低，说明第三内含子使得系统获得性抗性途径的基
因表达受到抑制。
关键词：拟南芥；小拟南芥；NPR1基因；系统获得性抗性
中图分类号：Q78 文献标志码：A 论文编号：casb15120034
Effect of NPR1 Gene from Arabidopsis pumila on Plant Systemic Acquired Resistance
Pei Juan, Ou Xiuling, Li Feng, Kong Dezhen, Wang Kun, Yi Xiaolong, Zhu Jianbo, Wang Aiying
(Shihezi Key Laboratory of Agriculture Biotechnology, College of Life Science, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003)
Abstract: The aim is to study the effect of the third intron in Arabidopsis pumila’s NPR1 gene on gene
expression. Arabidopsis pumila NPR1 gene was cloned with the third intron, plant expression vector of NPR1
gene was constructed and Arabidopsis thaliana were transformed via Agrobacterium tumefaciens. After being
induced 12 h with 5 mmol/L exogenous salicylic acid, the expression of the pathogenesis-related protein was
detected with Real-time PCR. The results showed that the expression of NPR1, PR-1, PR-2, PR-5 in wild-
type Arabidopsis thaliana was higher than those of the transgenic Arabidopsis thaliana. Compared with wild-
type Arabidopsis thaliana, the SOD and POD activities significantly decreased in transgenic Arabidopsis
thaliana, while the CAT activity did not increase significantly. The results showed that when the gene Ap.NPR1
containing the third intron was transferred into Arabidopsis thaliana, the transgenic plants systemic acquired
resistance pathway was inhibited, and the plant disease resistance was reduced, which indicated that the third
intron inhibited the gene expression of the systemic acquired resistance pathway.
Key words: Arabidopsis thaliana; Arabidopsis pumila; NPR1 gene; systemic acquired resistance (SAR)
0 引言
植物在与病原物长期并存，协同进化的影响下逐
渐形成一系列植物体的免疫抵抗，从而有效地抑制病
原物对植物自身的侵害。当植物的某个局部受到逆境
因子的侵染的时候，会产生逆境信号物质，在其他非侵
染部位甚至植物整体和个体之间诱导产生对这种逆境
基金项目：国家自然科学基金“小拟南芥NPR1基因第三内含子功能及其SAR分析”(C050103)。
第一作者简介：裴娟，女，1990年出生，研究生，研究方向：环境生物技术。通信地址：832003新疆石河子市北四路石河子大学生命科学学院农业生
物技术重点实验室，Tel：0993-2058500，E-mail：535375601@qq.com。
通讯作者：王爱英，女，1972年出生，山东成武人，副研究员，研究生导师，硕士，研究方向：植物基因工程。通信地址：832003新疆石河子市北四路石
河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，Tel：0993-2058500，E-mail：way-sh@126.com。
收稿日期：2015-12-06，修回日期：2016-02-22。
裴 娟等：新疆小拟南芥NPR1基因对植物系统获得性抗性的影响
的抗性机制，称为系统获得性抗性(systemic acquired
resistance, SAR)[1]。植物非病原菌株与植物互作时会
诱导植物产生的对逆境和病害的系统抗性称为诱导性
系统抗性(Induced systemic resistance, ISR)[2]。
在植物抗病反应过程中，抗病信号必须由内源信
号分子从侵染部位传导至整株植物，引起相应的系统
性抗性，因而内源信号分子在植物抗病信号传导途径
中起重要作用。目前研究较多的植物内源信号分子是
水杨酸(SA)，茉莉酸(JA)和乙烯(Et)。SAR和HR需要
SA介导，称之为SA-依赖性途径，这一途径中PR-1[3]蛋
白协同表达。外源 SA可引发PR基因的表达且通过
NPR1基因增强其广谱抗病性[4]。当植株受到病菌侵
染或 SA处理下[5]，NPR1基因可从二聚体形式变为单
体形式，然后从细胞质进入细胞核，并与TGA转录因
子结合，同时PR基因的启动子上具有响应SA信号的
as-1基序，此基序可与NPR1基因结合，从而激活PR基
因的表达[6]。
内含子是非编码序列，曾经被认为他的存在没有
任何意义，在功能方面更是无用基因，到现在为止，内
含子的功能还不是很清楚 [7]。根据其剪切机制的不
同，可将内含子分为 3类：真核mRNA内含子、自我剪
接内含子和真核 tRNA内含子。随着分子生物技术的
发展，人们发现内含子对基因表达有重要作用。在没
有蛋白质存在的情况下，RNA分子可通过自身的自我
剪接反应将核苷酸间的内含子剪接掉，该过程除需要
Mg2+、鸟苷酸外，不需要其他任何酶的参与，并且将相
邻片断的5’端、3’端连接成为成熟的RNA。
本试验主要研究 SA-依赖性途径中的水杨酸途
径，通过从新疆小拟南芥中克隆含有第三内含子的
NPR1抗病基因，构建诱导性表达载体，蘸花法转化拟
南芥，经Real-time PCR测定下游病源基因表达量，旨
在为揭示内含子对基因表达的影响提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
野生型小拟南芥(Arabidopsis pumila)、野生型拟
南芥(Arabidopsis thaliana)为本实验室采集；植物表达
载体PBI121、大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌GV3101由
石河子大学农业生物技术重点实验室保存。
Taq酶、连接酶、限制性内切酶、反转录酶 (M-
MLV reverse transcriptase)、寡聚引物Oligo-d (T) 18和
dNTPs，RNA酶抑制剂(RNase inhabitor)普通琼脂糖凝
胶DNA回收试剂盒等购于宝生物工程（大连）有限公
司，pGM-T vector购于北京Tiangen公司。引物合成、
序列测定由北京华大基因有限公司完成。
1.2 引物
所用引物由北京华大基因公司合成，引物信息见
表1。
1.3 试验方法
1.3.1 小拟南芥NPR1基因的克隆 Trizol法提取采用
250 μmol/L茉莉酸处理 12 h的小拟南芥mRNA，反转
名称
NPR1上游
NPR1下游
actin 8-F
actin 8-R
序列
(BamHI)GGATCC CGGAACCTGTGATGGAC
(SacI)GAGCTC CGCCAAGGATAGAG
GATTGGTGGTTCTATCCTTGCT
CTGCTTCATCATACTCTGCCTTA
用途
克隆NPR1基因
内参引物
表1 引物序列
注：下划线为酶切位点。
录 cDNA为模板；设计NPR1基因引物序列，RT-PCR
扩增克隆得到NPR1基因；克隆到pGM-T vector上，经
PCR检测及限制性内切酶 SacI和BamHI双酶切检测
的阳性克隆由北京华大基因公司测序。
1.3.2 植物过表达载体的构建 分别提取 PGM- Ap.
NPR1和植物表达载体 PBI121的质粒，SacI和BamHI
双酶切载体 PBI121和 PGM-Ap.NPR1，分别回收载体
大片段和目的小片段，按载体:片段=1:7的比例，16℃连
接16 h，转化DH5α。筛选重组子后，进行菌液PCR，提
取质粒进行双酶切鉴定，并命名为PBI121-Ap.NPR1。
1.3.3 植株的遗传转化与分子鉴定 采用冻融法将重组
质粒转入农杆菌GV3101中，通过蘸花法[8]转化拟南芥
植株后，收取侵染后的种子于选择培养基(1/2MS+
50 mg/L Kan+ 0.15 mg/L IAA)上进行筛选；挑选长势
好的植株提取总DNA，应用NPR1基因特异性引物进
行PCR检测，筛选获得转基因阳性植株。
1.3.4 NPR1基因及病程相关蛋白基因的检测 利用
Trizol法提取拟南芥、小拟南芥、转基因拟南芥的
mRNA，反转录为 cDNA；以拟南芥为对照，外源喷施
5 mmol/L水杨酸(SA)12 h后，以拟南芥 actin-8为内参
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基因，进行Real-Time PCR定量分析，检测Ap.NPR1基
因及下游病程相关蛋白基因 PR-1、PR-2、PR-5的表
达量。
1.3.5 抗病相关酶活性的测定 对野生型小拟南芥、拟
南芥及转基因拟南芥叶片外源喷施 5 mmol/L的水杨
酸(SA)，处理后 24 h，每一植株取 3个叶片，每片植株
样品0.5 g，未处理的野生型拟南芥作为对照，3个重复
为 1组，共 6组，测定植株采用 SA处理后 POD、CAT、
SOD酶活性。
1.3.6 数据处理及分析 利用 Excel及 SPSS软件进行
数据处理及分析。
2 结果与分析
2.1 小拟南芥NPR1基因的获得
以小拟南芥 cDNA为模板，以NPR1特异性引物
进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，扩增得到的目的片
段为大小为 1892 bp（如图 1）。用限制性内切酶
BamHI和 SacI对含有 NPR1基因的重组质粒 pGM-
NPR1进行双酶切，电泳显示在约1892 bp处得到目的
条带。酶切正确的质粒测序，经DNAman与拟南芥比
对后发现小拟南芥NPR1基因多出 110 bp，发现为第
三内含子；测序正确克隆命名为pGM-Ap.NPR1。
2.2 植物过表达载体的构建
质粒进行 SacI和 BamHI双酶切载体 PBI121和
PGM-Ap.NPR1，分别回收载体大片段和目的基因小片
段，按载体:片段=1:7的比例，16℃连接 16 h，转化
DH5α。筛选重组子后，进行菌液PCR，提取质粒后进
行双酶切鉴定。
2.3 蘸花法对拟南芥的转化
通过蘸花法转化拟南芥，收取T0代种子在选择培
养基上进行筛选。
2.4 PCR及RT-PCR对转基因植株的鉴定
挑选转基因植株长势好的T0代植株提取DNA，
进行 PCR（如图 2）检测，结果显示能够扩增出预期
1892 bp左右的目的条带，表明已成功获得转基因拟
南芥。
2.5 RT-PCR检测NPR1基因与病程相关蛋白基因PR-1、
PR-2、PR-5的表达
以拟南芥为对照，外源喷施5 mmol/L水杨酸(SA)
12 h后，提取其 mRNA并转录为 cDNA；以拟南芥
actin-8作为内参基因，进行Real-Time PCR定量分析，
检测Ap.NPR1基因的表达量及病程相关蛋白表达基
因PR-1、PR-2、PR-5的表达量（图3）。
从图3中可看出在5 mmol/L外源水杨酸(SA) 12 h
诱导后，相对于拟南芥，转Ap.NPR1拟南芥，Ap.NPR1
的表达量降低了，可能是由于转基因拟南芥中含有自
我剪接第三内含子，使Ap.NPR1的表达量受到抑制，
但却未完全抑制。从图中可看出转基因植株外源喷施
5 mmol/L水杨酸 12 h后，转基因植株中 PR-1、PR-2、
PR-5基因的表达量都低于野生型拟南芥。由于转入
含有第三内含子的Ap.NPR1，抑制了一部分Ap.NPR1
基因的表达，导致NPR1基因在水杨酸诱导途径中的
下游病程相关蛋白 PR-1、PR-2、PR-5基因的表达量
较低。
2.6 植株SA处理后体内SOD、POD、CAT酶活性
经 5 mmol/L SA处理植株叶片 24 h后，测定植株
体内与抗病相关酶活性。图 4所示，野生植株经外源
水杨酸处理后，植株体内水杨酸含量升高，并且水杨酸
与水杨酸受体结合形成复合物，植株自身可积累一定
量的H2O2，从而提高植株体内 SOD、POD[9]酶活，同时
也可诱导下游NPR1基因的表达；通过抑制CAT酶活
可提高自身H2O2含量，CAT酶活较高。未经外源水杨
酸处理，野生型拟南芥与转基因拟南芥的 SOD、POD
及CAT的酶活差异不明显；而经过外源水杨酸处理
后，相对于野生型拟南芥，转基因拟南芥中SOD、POD
酶活显著降低，而CAT酶活增加未达到显著水平。可
能是由于转入含有自我剪接内含子的Ap.NPR1，而使
SOD、POD酶活显著降低，使转基因植株的抗病性
降低。
3 讨论
经外源茉莉酸处理新疆小拟南芥，克隆得到小拟
南芥的NPR1基因，测序发现该基因与拟南芥的NPR1
M：DNA markerⅢ；1：阳性对照；2~8：PCR产物
图1 Ap.NPR1基因PCR产物
M：DNA markerⅢ；11：阴性性对照；1~10：PCR产物
图2 转基因植株DNA PCR鉴定
2000 bp
1200 bp
1800 bp
1892 bp
2000 bp
1200 bp
1892 bp
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裴 娟等：新疆小拟南芥NPR1基因对植物系统获得性抗性的影响
基因相比多一个自我剪切内含子结构，为第三内含
子。构建植物表达载体，转化拟南芥，抗生素筛选以及
PCR检测获得阳性植株。NPR1[10]基因是SAR信号途
径中的一个关键的调控因子，是诱导PR相关基因表达
所必需的。内源 SA水平的提高与 PR的诱导表达及
抗性的产生有关，外源供给SA能够刺激拟南芥等PR
基因的转录，从而提高其抗病性[11]。NPR1的缺失导致
PR1基因不表达，以及植株 SAR抗性的丧失；将小拟
南芥NPR1基因转入野生型拟南芥；转基因植株组成
性表现SAR，这些结果清楚说明NPR1在SAR中的关
键作用。前人研究了 SAR与 ISR途径之间的协同关
系，研究结果表明非致病菌侵染后，系统通过NPR1基
图3 Real-Time PCR检测转基因植株Ap.NPR1及病程相关蛋白表达基因相对表达量
S
O
D
酶
活
/[
U
/(
g
·m
in
)]
P
O
D
酶
活
/[
U
/(
g
·m
in
)]
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因介导SAR途径和 ISR途径，该结果以及后来的研究
结果说明NPR1不仅在SA介导的SAR，也在茉莉酸介
导的 ISR产生中起重要调控作用；有研究者于2003年
揭示了 SAR与 ISR途径之间的拮抗作用关系 [12-13]，研
究结果表明在致病菌DC3000侵染下，植株通过积累
SA，在细胞核中通过NPR1基因结合TGA[14]转录因子
激活下游病源基因PR1，从而进一步激活系统获得性
抗病途径(SAR)，而在细胞质中NPR1基因则抑制 JA
途径相关基因的表达，进一步抑制系统诱导性抗病途
径(ISR)。
水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等在植物防
卫信号传导中起重要作用，其介导的SA-非依赖性途
径和 SA-依赖性途径信号途径与植物抗性 [8]密切相
关。SA在 SAR和植物抗病方面非常重要，是激活植
物超敏反应(HR)和系统获得性抗性(SAR)的内源信号
分子，能诱导植物体产生抗病性，导致多种病程相关蛋
白的表达。对拟南芥及转基因拟南芥阳性植株体外喷
施茉莉酸，实时定量PCR检测发现，小拟南芥NPR1基
因能够在拟南芥中正常表达，同时也诱导了病程相关
蛋白基因PR-1、PR-2、PR-5的表达。由于转入含有自
我剪接内含子的NPR1基因，导致拟南芥茉莉酸诱导
SAR途径下游病程相关基因的表达受抑制，说明自我
剪接内含子的转入，对基因的表达呈负调控作用。到
目前为止，已有一些研究证明了内含子对基因的表达
有重要作用。Borokov[15]发现马铃薯蔗糖合成酶基因
的内含子中，含有一个类似启动子的结构，这种结构能
够调节基因自身启动子的活性，从而提高蔗糖合成酶
的表达水平。玉米泛素基因的第一个内含子能够启动
gusA的表达，具有类似于启动子的功能。Bornstein在
研究人胶原蛋白α(I)基因的表达调控时发现内含子内
的一段 274 bp的反向重复序列A274可阻碍基因的转
录，A274的作用具有方向性，仅当其3’端处于胶原蛋
白基因启动子下游时才表现阻碍，对胶原蛋白基因的
启动子引入突变后，A274这一阻碍作用消失了。内含
子增强基因表达活性的功能取决于它的位置和方向即
具有位置效应及方向依赖性。研究发现将玉米趋缩基
因(sh1)的第一个内含子正向插入嵌合结35S-cat的 cat
编码区上游，可使转基因烟草、玉米、水稻中的cat表达
活性提高 60~150倍，而当其反向插入同样位置时，对
cat表达活性则起到抑制作用。另外，当该内含子分别
以正向和反向插入嵌合结构 35S-cat的 35S启动子上
游时，对cat表达均没有影响。
经过外源水杨酸处理的转基因拟南芥，其 SOD、
POD酶活显著降低，CAT酶活增加未达到显著水平，
与病程相关基因的表达量降低结果相符。可能是由于
转入含有自我剪接第三内含子的Ap.NPR1，使抗病基
因的表达量降低，使转基因植株的抗病性降低。进一
步验证了第三内含子对基因的表达呈负调控作用。
本研究从野生型小拟南芥中克隆得到NPR1基因
的同时构建了植物表达载体，并应用农杆菌介导法转
入拟南芥植株；通过实时定量PCR检测SAR途径中的
水杨酸途径中，检测转基因植株下游病源相关基因的
表达，在外源水杨酸诱导下，PR-1、PR-2、PR-5的表达
量降低及SOD、POD酶活显著降低，表明转入含自我
剪接内含子的Ap.NPR1基因，使转基因植株的抗病性
降低，进而说明第三内含子对抗病诱导的基因表达有
抑制作用。
参考文献
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图4 5 mmol/L SA处理后，植株体内SOD、POD、CAT酶活
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