全 文 ：中国科学: 生命科学 2010年 第 40卷 第 10期: 963 ~ 969

SCIENTIA SINICA Vitae www.scichina.com life.scichina.com

英文版见: Gao F, Su Q, Fan Y L, et al. Expression pattern and core region analysis of AtMPK3 promoter in response to environmental stresses. Sci China Life Sci,
2010, 53: 1315―1321, doi: 10.1007/s11427-010-4079-0

SCIENCE CHINA PRESS
论 文
拟南芥AtMPK3启动子应答逆境信号的表达模式和
必需区域分析
高飞①②, 苏琦①, 范云六①, 王磊①*
① 中国农业科学院生物技术研究所/国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程, 北京 100081;
② 中央民族大学生命与环境科学学院, 北京 100081
* 联系人, E-mail: wanglei@caas.net.cn
收稿日期: 2010-07-22; 接受日期: 2010-07-28
国家重点基础研究发展计划(批准号: 2006CB101601, 2007CB108801)和高等学校学科创新引智计划(批准号: B08044)资助项目

摘要 蛋白激酶 AtMPK3参与MAPK级联途径, 在植物逆境信号转导中起重要作用. 为深入研
究 AtMPK3 基因在转录水平上应答各种环境胁迫的分子机制, 本研究从拟南芥基因组中分离了
AtMPK3基因转录起始位点上游 1016 bp的启动子序列, 对其进行了生物信息学分析. 对该启动子
进行了系列缺失突变, 并将完整启动子和缺失启动子片段与 GUS报告基因融合, 转基因导入到拟
南芥中. 携带 AtMPK3 启动子及其各种缺失突变体的转基因植株在干旱、高盐、低温、机械损伤
等胁迫条件的 GUS组织化学染色和荧光定量分析表明, AtMPK3启动子应答干旱、高盐、低温、
机械损伤逆境信号的必需元件位于启动子序列中转录起始位点上游−188 ~ −62 区域内, 揭示了
AtMPK3 启动子在不同环境胁迫条件下的表达模式的差异. 本研究结果有助于阐述 AtMPK3 基因
在转录水平上应答不同胁迫信号分子机制.
关键词
拟南芥
AtMPK3
启动子
逆境



植物需要适应外部环境的各种变化, 以维持自
身的正常生长发育 . 自然界中存在着多种不利于植
物的环境因素, 包括干旱、涝害、盐碱、高温、低温
等非生物逆境, 以及动物和昆虫噬食、微生物侵染等
生物逆境 , 这些逆境因子不同程度地损害植物的生
长和农作物的收成 . 植物在进化过程中发展了一些
精确调控的调节机制来应对各种逆境条件 . 当植物
面临不利的环境条件时, 这些外界逆境信号能够被
植物的某些部位所感受, 并传递到细胞内, 部分逆境
信号通过信号转导通路迅速地被传递到细胞核内 .
接收到环境逆境信号后, 很多基因的表达量增强或
者减弱, 进一步引起细胞内各种生物学过程的变化,
包括物质和能量代谢过程的调整 , 最后实现逆境条
件下细胞内各种平衡及稳态的重建[1]. 目前已经阐明,
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,
MAPK)在植物环境逆境信号转导过程中发挥着极为
重要的作用[2,3].
研究表明, 在植物机体内, 各种外界环境逆境信
号、内部激素(脱落酸、乙烯、赤霉素和生长素等)以
及细胞增殖信号都是通过 MAPK 信号途径传递的[4~6].
MAPK 信号途径由 MAPKKK(mitogen-activated
protein kinase kinase kinase), MAPKK(mitogen-
activated protein kinase kinase)及下游的 MAPK 组成,
MAPK 通过一系列磷酸化反应放大并传递外界逆境
高飞等: 拟南芥 AtMPK3 启动子应答逆境信号的表达模式和必需区域分析

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信号 , 最终引起细胞内广泛的逆境反应 [7]. 各种
MAPK 位于 MAPK 信号途径的下游位置 , 可由
MAPKK 磷酸化其苏氨酸和/或酪氨酸所活化. 值得
注意的是, 在植物体内, MAPK 既发生磷酸化等翻译
后调控, 又在转录水平受到广泛的调控[4]. 在拟南芥
(Arabidopsis thaliana)中已经鉴定了 20多个 MAPK蛋
白 , 其中对 AtMPK3 的研究最为清楚 . 已证明
AtMPK3 可被渗透胁迫信号所激活[8], 参与脱落酸介
导的信号途径[9], 并与植物的内在免疫能力和气孔发
育相关[10,11], AtMPK3 基因的转录水平在高盐、低温、
机械损伤、渗透和氧化胁迫和几丁质处理下均上
调[4,8,12,13].
目前, AtMPK3 在 MAPK 信号通路中如何通过自
身磷酸化状态的转换发挥信号接收与传递的功能已
经清楚, 但是对 AtMPK3 基因在转录水平上如何应答
各种环境胁迫信号的研究还远远不够 , 特别是缺乏
对 AtMPK3 基因响应逆境的表达调控模式及 AtMPK3
基因启动子的结构功能方面的研究 . 本研究分离得
到了 AtMPK3 基因启动子序列, 利用生物信息学工具
分析了该启动子区域内包含的潜在的顺式作用元件,
构建了 AtMPK3 基因启动子的系列缺失突变体, 并连
接 Gus 基因, 在拟南芥中进行了稳定表达, 通过对转
基因植株的 GUS 酶活在多种逆境条件下的定性和定
量分析, 初步阐明了 AtMPK3 基因响应干旱、高盐、
低温和机械损伤等环境胁迫的表达模式 , 确定了
AtMPK3 基因启动子区域应答各种环境胁迫的必需
DNA 区域.
1 材料与方法
1.1 植物材料与胁迫处理
用于遗传转化的哥伦比亚型拟南芥种植在温室
土壤中, 具体生长条件为长日照(16 h 日/8 h 夜), 光
照强度 280 μmol·m2·s1, 温度 18~23℃, 湿度 35%.
拟南芥转基因植株生长在含 1%蔗糖的 MS 平板
上. 种子萌发 1 周后用于各种胁迫处理. 处理条件分
别为: 低温, 4℃; 高盐, 250 mmol/L NaCl; 模拟干旱,
10%PEG6000溶液; 机械损伤胁迫的处理条件依照文
献[4]进行. 各种胁迫处理 1, 4, 10 和 24 h 后, 对整体
植株取样(分别为 1, 4, 10 和 24 h 组), 用于 GUS 活性
测定. 胁迫前的植物材料作为对照组(0 h).
1.2 AtMPK3基因启动子序列的分离和载体构建
以哥伦比亚型拟南芥的基因组为模版, PCR 扩增
AtMPK3 基因启动子序列. 使用的特异引物为: 5′-
AAGCTTAGCTTCAAGTAGAGCAC-3′(HindⅢ)和
5 ′-GGATCCAGAGACTGAGATTGAGGATTG-3 ′
(BamHⅠ). 扩增片段连接到 pGEM-T easy 载体内后,
进行 DNA 序列测定, 确认扩增片段包含了 1142 bp
的 AtMPK3 基因启动子序列(P1-AtMPK3). 使用启动
子预测软件 PLACE Database(http://www.Dna.affrc.go.
jp/PLACE/)
[14]和 The Arabidopsis Gene Regulatory
Information Server(AGRIS)(http://arabidopsis.med.ohio-
state.edu/)
[15,16]分析了 AtMPK3 基因启动子序列中潜
在的顺式作用元件的种类和分布情况.
对 P1-AtMPK3 进行了系列缺失, 构建了一系列
5′启动子片段缺失突变体. 使用的正向引物分别为:
P2(5′-AAGCTTCACAATGACGTAAGCA-3′), P3(5′-AA-
GCTTCTATATAATAATAATA-3′), P4(5′-AAGCTTA-
TTATTTAAACTATGG-3′)和 P5(5′-AAGCTTCGATC-
TTCTCTGCCTTT-3′), 反向引物均为 5′-GGATCCA-
GAGACTGAGATTGAGGATTG-3′. 由此获得的启动
子突变体分别被命名为: P2-AtMPK3, P3-AtMPK3, P4-
AtMPK3 和 P5-AtMPK3. 将 P1-AtMPK3, P2-AtMPK3,
P3-AtMPK3, P4-AtMPK3 和 P5-AtMPK3 进行 HindⅢ
和 BamH Ⅰ 酶 切 , 连 接 到 pBI121 载 体 的 β-
glucuronidase(Gus)上游的相应多克隆位点处 , 得到
系列缺失的 AtMPK3::Gus 载体, 分别命名为 P1, P2,
P3, P4 和 P5(图 1).
1.3 拟南芥的转化
通过浸花法将 AtMPK3::Gus 系列载体 P1, P2,
P3, P4 和 P5 经农杆菌 LBA4404 介导转入到拟南芥
中[17,18]. 使用 50 mg/L 的卡那霉素对转化植株进行两
轮筛选, 然后以转基因植株的基因组 DNA 为模板进


图 1 AtMPK3基因启动子序列系列缺失突变体融合
Gus基因示意图
中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 10 期

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行 PCR 分析, 以确认 AtMPK3:: Gus 的稳定整合. 使
用的引物为 5′-CAATCCTCAATCTCAGTCTCTC-3′
(AtMPK3 启动子特异引物)和 5′-TTCCTGATTATTG-
ACCCACAC-3′(载体 Gus 基因特异引物).
1.4 GUS组化染色和荧光定量分析
按照文献[19]方法进行 GUS 组化染色. 简要过
程为: 拟南芥植株浸没在染色液中 37℃过夜染色 ,
染色液组成为: 5%DMSO, 0.5 mg/mL X-Gluc, 100
mmol/L NaH2PO4(pH 7.0), 50 mmol/L 铁氰化钾, 50
mmol/L 亚铁氰化钾, 0.1%Triton X-100. 随后移去染
色液, 用含 90%乙醇和 10%冰醋酸的溶液漂洗植物
材料, 直至脱去叶绿素. GUS 荧光定量分析按照文
献[20]进行, 蛋白定量采用 Bradford 法[21].
2 结果
2.1 AtMPK3基因启动子序列中含有多个逆境应答
相关顺式作用元件
通过 PCR 扩增分离得到 AtMPK3(基因座位号:
AT3G45640)基因长 1016 bp 的启动子区域, 并进行
了 DNA 测序验证. 为了了解 AtMPK3 基因启动子序
列中顺式作用元件的分布情况 , 使用两种启动子顺
式作用元件预测软件, 即 PLACE[14]和 AGRIS[15,16],
对该基因启动子区域进行了生物信息学分析 . 结果
表明, 在 AtMPK3 基因启动子区域中, 存在着多个与
环境胁迫和激素应答相关的顺式作用元件(表 1). 在
这些顺式作用元件中, MYB, MYC 和 CBF 结合位点
被报道参与干旱应答 ; GT-1 参与高盐逆境响应 ;
LTRE-1 可能在低温信号转导中发挥作用; W-box 涉
及损伤响应 ; 而 ASF-1 结合位点 , GA-responsive
element, GCC-box 和 TCA1 motif 可能分别参与生长
素、赤霉素、乙烯和水杨酸等激素应答. 以上结果为
进一步通过实验方法研究 AtMPK3 基因启动子对于
各种环境的应答奠定了基础.
2.2 AtMPK3启动子的表达受干旱、高盐、低温和
机械损伤胁迫的诱导
为了研究 AtMPK3 启动子对各种环境胁迫的响
应情况, 将 1016 bp AtMPK3 启动子序列与 Gus 报告
基因融合, 通过农杆菌介导导入拟南芥. 对筛选验证
后的转基因植株进行不同持续时间(1, 4, 10 和 24 h)的
模拟干旱、高盐、低温和机械损伤胁迫处理, 随后对
胁迫处理前后的植株进行组织化学染色 , 以评估

表 1 AtMPK3基因启动子中可能参与环境胁迫和激素应答的顺式作用元件
顺式作用元件 起始位置 核心序列 可能的功能
MYB1AT −401, −410 WAACCA ABA 和干旱反应
MYB4 结合位点 −934 TAACAAA 应答多种环境胁迫
MYC 结合位点 −394 CACATG 应答干旱和 ABA 反应
GCC-box −84 GCCGCC 应答病原、乙烯和茉莉酸信号
CBFHV/CBF 结合位点 −94 RYCGAC 干旱和低温反应
LTRE-1(低温响应元件) −765 CCGAAA 低温反应
W-box motif −115 TTGACT 应答水杨酸和机械损伤信号
WBOXATNPR1/W-box −114, −122 TTGAC 应答乙烯和机械损伤信号
GT1GMSCAM4/GT-1 motif −538, −544, −744 GAAAAA 病原和高盐胁迫响应
DPBFCOREDCDC3 −339, −395 ACACNNG ABA 反应
ABREOSRAB21 −824 ACGTSSSC ABA 反应
AGCBOXNPGLB/乙烯响应元件 −84 AGCCGCC 乙烯反应
TCA1 motif −20 TCATCTTCTT 应答水杨酸和其他胁迫信号
ASF1MOTIFCAMV/ASF-1 结合位点 −121, −862 TGACG 应答生长素和水杨酸信号
TGA-box 1/生长素响应元件(AUXRE) −862 TGACGTAA 应答生长素信号
CATATGGMSAUR −911 CATATG 应答生长素信号
GARE2OSREP1/赤霉素响应元件 −318 TAACGTA 应答赤霉素信号
GAREAT/赤霉素响应元件 −935 TAACAAR 应答赤霉素信号

高飞等: 拟南芥 AtMPK3 启动子应答逆境信号的表达模式和必需区域分析

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AtMPK3 启动子在各种环境胁迫的转录强度. 结果表
明, AtMPK3 启动子在拟南芥中的表达受干旱、高盐、
低温和机械损伤胁迫的诱导(图 2). 从图 2 中也可以
观察到, 在不同的逆境胁迫下, 随胁迫时间的延长,
AtMPK3 启动子也显示出不同的表达特征 , 如
AtMPK3 启动子在高盐、低温和机械损伤胁迫下的 1,
4, 10 和 24 h 4 个时间点均有明显的表达, 而在干旱
胁迫下, 则只在 1 h 这一时间点有明显的表达, 在其
他时间点的表达较弱.
考虑到组织化学染色这一定性方法的精确度有
限, 又进行了 GUS 酶活性的荧光定量检测, 以揭示
AtMPK3 启动子对各种环境胁迫的表达模式. GUS 荧
光定量表明, 在胁迫后的各个时间点, AtMPK3 启动
子的转录明显受到高盐、低温和机械损伤胁迫的诱导
(图 3), 但在干旱胁迫条件下, AtMPK3 启动子的转录
活性在 1 h 最高(P<0.01), 在 4, 10 和 24 h 3 个时间点
的转录活性仅稍高于胁迫前(0 h). 以上结果验证了
GUS 组织化学染色的结果. 另外, 定量测定结果还
显示出 AtMPK3 启动子的最高转录活性出现在高盐
和低温胁迫条件下的不同时间点(高盐, 10 h; 低温,
24 h). 在不同的环境胁迫条件下, AtMPK3 启动子显
示出不同的表达模式, 这可能与 AtMPK3 启动子区域
内存在的多个顺式作用元件有关.
2.3 AtMPK3启动子应答环境胁迫的必需元件位于
转录起始位点上游188 ~ 62区域内
通过生物信息学分析可知, AtMPK3 启动子序列
内分布着多个参与环境胁迫应答的顺式作用元件 .
为了确定 AtMPK3 启动子应答环境胁迫的必需元件
所在的核心区域, 对 AtMPK3 启动子序列进行了系列
缺失突变, 并连接到 Gus 报告基因的上游, 并将获得
的系列缺失突变(P2, P3, P4 和 P5)导入拟南芥. 对筛
选鉴定后得到的转基因植株进行 GUS 组织化学染色
(图 2)和荧光定量分析(图 4). 结果表明, 除了 P5以外,
其他启动子缺失突变体(P2, P3 和 P4)在干旱、高盐、
低温和机械损伤胁迫下, 转录活性均有所提高, 说明



图 2 携带 AtMPK3:: Gus的转基因拟南芥 GUS 组织化学染色示意图
(A) 干旱胁迫处理; (B) 高盐胁迫处理; (C) 低温胁迫处理; (D) 机械损伤胁迫处理. 处理持续 1, 4, 10 和 24 h 后取样, 将整体植株进行
GUS 组织化学染色. 胁迫处理前的植物作为对照组(0 h)
中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 10 期

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AtMPK3 启动子序列中应答以上 4 种环境胁迫信号的
必需区域位于转录起始位点上游−188 ~ −62 区域内.
同时表明, P1 的转录水平及表达模式与 P2, P3 和 P4
存在差异, 说明, 虽然 AtMPK3 启动子序列中应答环
境胁迫信号的必需元件位于−188 ~ −62 区域内, 但位
于此区域外的−1016 ~ −188区域内的顺式作用元件也
能够在一定程度上影响启动子的转录活性. 此外, 对
完整的和系列缺失的 AtMPK3 启动子的转录活性分
析也验证了 AtMPK3 启动子在不同环境胁迫条件下
的表达模式差异.
3 讨论
作为 MAPK 信号途径下游终端成员 , 拟南芥
AtMAK3 在环境胁迫和激素信号转导中发挥着关键
的作用 . 目前已报道的研究主要集中于 AtMAK3
在接收到 MAPK 信号途径上游传导来的信号后 ,
如何发生磷酸化和去磷酸化状态的转换 , 而对于
AtMAK3 如何在转录水平上应答环境胁迫信号的研
究还较少.
“启动子”一般被定义为基因组序列中位于基因



图 3 拟南芥 AtMPK3启动子在干旱、高盐、低温和机械损伤胁迫下的表达情况
(A) 干旱胁迫处理; (B) 高盐胁迫处理; (C) 低温胁迫处理; (D) 机械损伤胁迫处理. 处理持续 1, 4, 10 和 24 h 后取样, 将整体植株进行
GUS 荧光定量分析. 胁迫处理前的植物作为对照组(0 h). 每个时间点的数值为 4 个独立转基因植株测定值的平均值



图 4 完整的和系列缺失的 AtMPK3启动子在干旱、高盐、低温和机械损伤胁迫下的表达模式
(A) 干旱胁迫处理; (B) 高盐胁迫处理; (C) 低温胁迫处理; (D) 机械损伤胁迫处理. 处理持续 1, 4, 10 和 24 h 后取样, 将整体植株进行
GUS 荧光定量分析. 胁迫处理前的植物作为对照组(0 h). 每个时间点的数值为 4 个独立转基因植株测定值的平均数. 为简化图形, 图中
未标注误差棒
高飞等: 拟南芥 AtMPK3 启动子应答逆境信号的表达模式和必需区域分析

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的转录起始位点之前的一段 DNA 序列, 尽管转录起
始位点之后的序列也可能影响转录 . 虽然近端启动
子(proximal promoter, 转录起始位点之前的几百个碱
基对的 DNA 序列)和远端启动子(distal promoter)中可
能都包含着影响植物发育和环境因子响应的顺式作
用元件, 但大多数顺式作用元件位于近端启动子区
域内[22]. 本研究利用 PCR 扩增技术分离了一段明显
长于近端启动子的 DNA 序列(转录起始位点之前
1016 bp 长的一段 DNA 序列)进行启动子结构与功能
研究.
目前, 有多个专业的植物启动子序列数据库网
站可以提供已经证实的植物启动子核心序列及其相
互作用的转录因子信息, 包括 PlantCARE[23], RegSite
(http://softberry.com), PLACE
[14]和 AGRIS[15,16]等. 本
研究使用 PLACE 和 AGRIS 两个数据库预测了
AtMAK3 启动子序列中的顺式作用元件的分布情况,
发现存在多个顺式作用元件的核心序列 . 由于在植
物中已经证明 , 细胞分裂和环境胁迫相关的信号转
导过程都涉及 MAP 激酶途径, 甚至 ABA、生长素、
乙烯和细胞分裂素的信号转导也要通过 MAP 激酶通
路, 那么, 在 AtMAK3 启动子序列中预测出多个可能
参与非生物胁迫、生物胁迫与激素反应的顺式作用元
件并不意外.
本研究表明 , AtMAK3 启动子的转录活性受干
旱、高盐、低温和机械损伤胁迫的诱导, 而且在高盐
和低温胁迫下显示出较高的转录活性. 在已发表的
论文中也报道了类似的结果, 如 AtMAK3 的转录在渗
透胁迫[8]、高盐胁迫[4]、低温逆境[4]和机械损伤胁迫[4]
下升高, 本结果与先前进行的研究基本一致. 同时揭
示了 AtMAK3 启动子在干旱、高盐、低温和机械损伤
胁迫 4 种不同逆境下的表达模式存在明显差异, 特别
是在 PEG 处理模拟干旱胁迫条件下的表达模式与其
他胁迫条件下的不同. 推测造成这种差异的原因可
能与 AtMAK3 启动子序列中存在的具体顺式作用元
件有关.
通过启动子序列的系列缺失、植物转基因和
GUS 酶活分析, 将 AtMAK3 启动子应答干旱、高盐、
低温和机械损伤等环境胁迫的核心元件和必需区域
定位于−188 ~ −62. 在这个仅为 126 bp 的区域中, 密
集分布着8个顺式作用元件, 数量接近1016 bp的启动
子序列中全部 18 个顺式作用元件数量的 1/2, 这一比
例也印证了这段序列的重要性. 在−188 ~ −62 区域中,
一个 CBF 结合位点/CBFHV(RYCGAC), 同时也是一
个 DRE(dehydration responsive element, CCGAC), 可
能介导植物 AtMAK3 基因对于干旱、高盐和低温胁迫
信号的应答 [24~26]; 一个被证明参与水杨酸和逆境反
应的顺式作用元件—— TCA1 motif (TCATCTT-
CTT)
[27]
, 可能在植物 AtMAK3 基因环境胁迫响应中
发挥重要作用. 定位于−188 ~ −62 区域内的 GCC-box,
W-box motif 和 WBOXATNPR1 被报道参与病原侵袭
和机械损伤胁迫信号 [28~30], 它们可能介导了植物
AtMAK3 基因对于机械损伤的反应. 综上, 本研究有
助于加深对于植物 AtMAK3 基因应答环境胁迫的分
子机制的认识.


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