全 文 ：中国农学通报 2011,27(12):249-254
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化CO2与磷
酸烯醇式丙酮酸（PEP）的羧化反应，最后生成草酰乙
酸和无机磷酸。PEPC是一种具有多种生理功能的细
胞质酶，广泛分布于高等植物、蓝藻和细菌中[1-2]。研究
表明，不同类型植物的 PEPC具有不同功能，在C4和
CAM植物中，PEPC负责光合作用中无机碳的初始同
化；C3植物的PEPC在促进TCA循环中间代谢物的回
补、协调碳和氮的代谢等方面有重要作用，被认为是控
制C3植物蛋白质与油脂含量比的一个关键酶[3-6]。还
基金项目：国家自然科学基金项目“油料作物高油种质资源创制的机理及其应用”（30430450）；“油菜籽脂肪酸生物合成的双重遗传调控”
（30370910）。
第一作者简介：冯都华，男，1986年出生，江西九江人，硕士研究生，研究方向：拟南芥PEPC基因的功能鉴定。通信地址：321004浙江省金华市迎宾
大道688号浙江师范大学化学与生命科学学院，E-mail：fengduhua86@yahoo.com.cn。
通讯作者：陈锦清，男，1953年出生，浙江瑞安人，研究员，主要从事植物基因工程及遗传育种研究。通信地址：310021浙江省杭州市石桥路198号浙
江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，Tel：0571-86404392，E-mail：j.q.chen28@163.com。
收稿日期：2011-01-11，修回日期：2011-04-18。
拟南芥植物型PEPC基因人工小RNA表达载体
的构建与遗传转化
冯都华 1,2，王伏林 2，陈锦清 2
（1浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004；
2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，杭州 310021）
摘 要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是植物中具有多种生理功能的酶。为探索拟南芥中植物型
PEPC基因对模式植物拟南芥脂肪酸含量以及抗逆性等方面的影响，笔者构建了同时敲除拟南芥
Atppc1、Atppc2和Atppc3基因的人工小RNA（amiRNA）植物表达载体 pFGC-amiAtppc123，经根癌农杆
菌EHA105介导，用花序浸染法转化拟南芥，成功获得转基因植株。RT-PCR半定量分析表明人工小
RNA在转化植株中成功进行了超量表达。该试验为分析拟南芥脂肪酸含量以及抗逆性方面提供了基
础材料。
关键词：PEPC；拟南芥；amiRNA；脂肪酸含量；花序浸染
中图分类号：Q78 文献标志码：A 论文编号：2011-0081
Construction of Plant-type Phosphoenolpyruate Carboxylase (PEPC) Gene Artificial miRNA
Expression Vector and Transformation in Arabidopsis thaliana
Feng Duhua1,2, Wang Fulin2, Chen Jinqing2
(1College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua Zhejiang 321004;
2Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021)
Abstract: To investigate the functions of PEPC in lipid content, fatty acid composition and the response to
environmental stress in C3 plants, Arabidopsis thaliana plant-type PEPC genes (referred to as Atppc1, Atppc2
and Atppc3) were silence by the artificial miRNA (amiRNA) technique. The author constructed the plant
expression vector named pFGC-amiAtppc123 and transformed it into Arabidopsis thaliana via in floral dip
method. Transgenic plants were confirmed by PCR. The amiRNA transcript levels were detected by
semi-quantitative RT-PCR. The results showed that amiRNA expression was drastically increased in
transgenic plant compared with non-transgenic plants.
Key words: PEPC; Arabidopsis thaliana; amiRNA; lipid content; in floral dip
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有研究表明，PEPC可能与植物对环境胁迫的响应有
关[7-9]。
拟南芥含有 4 个 PEPC 基因，分别为 Atppc1、
Atppc2、Atppc3 和 Atppc4。其中 Atppc1、Atppc2 和
Atppc3相互之间同源性较高，属于植物型PEPC基因；
而Atppc4所编码的酶缺少磷酸化结构域，为典型的细
菌型PEPC基因[10-11]。目前对拟南芥PEPC基因家族表
达背景的了解较为清晰[12]，研究还表明Atppc4在抵抗
干旱和盐胁迫逆境时作用更大 [13]，而拟南芥PEPC基
因家族各基因的具体功能仍然未知。
微小RNA(microRNA，简称miRNA）的研究已成
为目前的一大热点，微小RNA是一类在真核生物中广
泛存在的长度约为20~23个核苷酸的非编码小分子单
链RNA，通过与靶mRNA互补配对，导致mRNA的降
解或翻译抑制，从而在转录后水平对靶基因的表达进
行负调控。Schwab等[14-16]设计了一种有效的使植物基
因沉默的工具——人工小 RNA（Artificial miRNAs，
amiRNA），在拟南芥、水稻和小立碗藓等植物的应用
表明，amiRNA能有效地抑制单个靶基因或多基因的
表达。本试验利用拟南芥内源miR319a前体骨架，构
建了同时沉默拟南芥 3 个植物型 PEPC 基因的
amiRNA表达载体，转化野生型拟南芥，该研究对探明
拟南芥PEPC基因的功能具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 植物材料、菌株和载体
野生型拟南芥(Col-0)、大肠杆菌（DH5α）、根癌农
杆菌（EHA105）、植物表达载体pFGC5941均由本实验
室保存；pRS300 质粒由 Rebecca Schwab 提供；
pGEM-T Easy载体购自Promega公司。
1.2 酶和主要试剂
pfu高保真聚合酶、T4 DNA连接酶、M-MLV逆转
录试剂盒购自Promega；rTaq DNA聚合酶、Trizol试剂
盒购自TaKaRa（大连）；Advantage 2 polymerase mix购
自 Clontech；限制性内切酶、DNA分子Marker购自
Fermentas；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、抗
生素等购自上海生工，引物由上海生工合成；其他试剂
为国产分析纯。
1.3 引物设计
根 据 拟 南 芥 Atppc1（AT1G53310.1）、Atppc2
（AT2G42600.1）和Atppc3（AT3G14940.1）的序列，登录
WMD3 （Web MicroRNA Designer， http://wmd3.
weigelworld.org/cgi-bin/ webapp.cgi），设 计 相 应 的
amiRNA前体的扩增引物Ⅰ~Ⅳ（见表1）。前端A引物
和末端B引物采用Schwab给出的序列（表1）[17]。
1.4 表达载体构建
参照Schwab的方法[17]，使用所设计的 6条引物和
pfu高保真聚合酶，以 pRS300质粒为模板，采用重叠
PCR的方法克隆目标基因amiRNA的前体片段。该片
段经电泳、切胶回收、3’加 polyA后，再连接到 pGEM
T-easy 载 体 上 得 到 重 组 克 隆 ，命 名 为
pGEM-amiAtppc123，用EcoR I酶切鉴定，将阳性克隆
送 上 海 生 工 测 序 。 Xho Ⅰ 和 Xba Ⅰ 双 酶 切
pGEM-amiAtppc123和 pFGC5941，分别回收目的片段
和载体片段进行连接，连接产物转至大肠杆菌，抽提质
粒，用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，表达载体命名为
pFGC-amiAtppc123（见图1）。
图1 人工小RNA植物表达载体结构图
1.5 拟南芥的转化和筛选
利用冻融法将表达载体 pFGC-amiAtppc123转入
根癌农杆菌EHA105感受态细胞，将菌液涂布于含卡
那霉素和利福平的YEB固体培养基上，28℃，培养 2
天，参照Clough[18]的方法，进行农杆菌培养，利用花序
浸染法转化野生型拟南芥。将T0代拟南芥种子播种
在营养土上，出苗后，喷施除草剂（草丁膦3000倍稀释
液）进行筛选。
1.6 转基因植株的检测
CTAB法小量提取抗性苗叶片DNA，根据表达载
体上的35S启动子和OCS终止子序列设计引物：35S-F
和OCS-R（表1），对抗性苗进行PCR检测。
1.7 转基因植株人工小RNA的表达分析
Trizol法一步提取拟南芥叶片总RNA，参照Chen
的方法[19]，设计目标 amiRNA的茎环RT引物和PCR引
物（表1）。参照Varkonyi的方法[20]，进行 amiRNA的逆
CaMV 35S OCS
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冯都华等：拟南芥植物型PEPC基因人工小RNA表达载体的构建与遗传转化
转录和 PCR，RT反应体系 10 μL，包括 5.5 μL RNA模
板，1 μL 茎环 RT 引物（1 μmol），0.5 μL dNTPs
（10 μmol），0.5 μL逆转录酶M-MLV，2 μL逆转录酶缓
冲液和0.5 μL RNase抑制剂。在0.2 mL反应管中先加
入模板、茎环 RT引物和 dNTPs，混匀后 65℃变性
5 min，迅速放到冰中冷却，再加入其他组分。16℃
30 min；20℃ 30 s，42℃ 30 s，50℃ 1 s，60个循环；最后
85℃反应5 min终止逆转录。取1 μL逆转录产物进行
PCR 反应，反应体系 20 μL，含 0.5 μL Advantage 2
polymerase mix，2 μL 10×PCR buffer，0.5 μL dNTPs，
0.5 μL 正 向 引 物 ami123-F 和 0.5 μL 反 向 引 物
ami123-R，用水补足至 20 μL。PCR反应程序：94℃
2 min；94℃ 15 s，65℃ 1 min，分别进行25和30个循环；
最后 72℃延伸 2 min。同时按照M-MLV逆转录试剂
盒说明书中的方法，进行总 RNA的逆转录，使用
ubiquitin-F 和 ubiquitin-R 引物（表 1），扩增内参
ubiquitin，PCR反应体系和反应程序同上，进行25个循
环。
表1 引物序列
名称
载体构建
PCR鉴定
amiRNA的表达
内参
I miR-s
II miR-a
III miR*s
IV miR*
A
B
35S-F
OCS-R
stemloop RT
ami123-F
ami123-R
ubiquitin-F
ubiquitin-R
序列(5→3)
gatatagagataatgtaagcgcctctctcttttgtattcc
gaggcgcttacattatctctatatcaaagagaatcaatga
gaggagcttacattaactctatttcacaggtcgtgatatg
gaaatagagttaatgtaagctcctctacatatatattcct
ctgcaaggcgattaagttgggtaac
gcggataacaatttcacacaggaaacag
acctaacagaactcgccgta
gtggcgctctatcatagatg
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacggcgct
gcccgcgtatagagataatgtaagc
gcggcggtaccttaatacattg
atgcagatcttcgtgaaaac
tcaagcttcaactccttctt
2 结果与分析
2.1 植物表达载体pFGC-amiAtppc123的构建
登录WMD3网站，将 Atppc1~3基因在拟南芥
cDNA数据库中进行BLAST，设计出目标 amiRNA片
段：5’TATAGAGATAATGTAAGCGCC3’，该 amiRNA
的 21碱基成熟片段与Atppc1~3的基因序列在相应位
点存在配对（图 2）。再根据 amiRNA序列使用Oligo
功能设计出扩增 amiRNA前体片段的Ⅰ~Ⅳ引物。以
图2 人工小RNA片段与各目标基因的配对定位
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质粒 pRS300为模板，通过巢式 PCR扩增出 694 bp大
小的目标 amiRNA的前体片段（图 3）。将目标基因
amiRNA的前体片段克隆到 pGEM T-easy载体上，得
到重组克隆 pGEM-amiAtppc123，EcoR I酶切结果符
合557 bp的预期（图4）。将阳性克隆送至上海生工公
司测序，结果显示插入序列与设计序列一致。分别将
载体 pGEM-amiAtppc123和表达载体 pFGC-5941用
Xho I和Xba I双酶切，分别回收目的片段和载体片段
进行连接，得到表达载体 pFGC-amiAtppc123，重组质
粒用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切检测，得到的小片段也符
合 464 bp的预期（图 5），表明成功获得了拟南芥植物
型PEPC基因amiRNA的植物表达载体。
2.2 转基因植株的获得
利用花序浸染法转化拟南芥，将T0代拟南芥转基
因种子播种在营养土上，喷施除草剂后，大部分植株发
黄枯死，而少数植株可以正常生长，具备抗除草剂特
性。3周后，用CTAB法小量提取正常生长植株的叶片
DNA，以野生型拟南芥为阴性对照，质粒为阳性对照，
使用 35S-F和OCS-R引物进行PCR检测，转基因拟南
芥得到了1条约1200 bp的特异条带，表明已获得转基
因拟南芥植株（图6）。
2.3 人工小RNA在转基因拟南芥中的表达
Trizol法提取野生型和 2个转基因株系拟南芥叶
片总RNA，以茎环RT引物进行 amiRNA的逆转录，以
引物 ami123-F和 ami123-R进行 PCR扩增，对转基因
植株amiRNA的表达进行半定量检测。PCR反应进行
25个循环和 30个循环后，用 3%TAE进行电泳。同时
以随机引物和Oligod(T)18引物进行总RNA的逆转录，
以引物 ubiquitin-F和 ubiquitin-R扩增内参 ubiquitin，
PCR反应进行 25个循环后，用 3%TAE进行电泳（图
M：GeneRuler DNA Ladder Mix；1：amiRNA的前体片段
图3 PCR扩增人工小RNA前体片段的电泳检测
M 1
3000 bp
1000 bp
500 bp
M 1 2 3 4
3000 bp
1000 bp
500 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
6000 bp
3000 bp
1000 bp
M：GeneRuler DNA Ladder Mix；
1~4：EcoR I酶切质粒pGEM-amiAtppc123
图4 重组克隆pGEM-amiAtppc123的酶切鉴定
M 1 2 3 4
3000 bp
1000 bp
500 bp
M：GeneRuler DNA Ladder Mix；
1~4：Xho I和Xba I双酶切质粒pFGC-amiAtppc123
图5 表达载体pFGC-amiAtppc123的酶切鉴定
M：GeneRuler 1 kb DNA Ladder；1：野生型对照；2：质粒pFGC-amiAtppc123；3—11：转基因植株
图6 部分转化植株的PCR检测
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冯都华等：拟南芥植物型PEPC基因人工小RNA表达载体的构建与遗传转化
7）。结果显示，当对照和转基因株系的总RNA模板量
都为0.2 µg时，对照没有出现目的带，转基因株系1和
2分别出现目的带；而在相同体系下，当对照和转基因
株系的总RNA模板量都为 1 µg时，出现了相似的结
果，说明本试验构建的 amiRNA在转基因拟南芥株系
中超量表达。
3 结论与讨论
由于PEPC在植物光合作用、蛋白质/脂类代谢以
及逆境胁迫过程中的重要作用，利用基因工程技术手
段调控植物PEPC基因的表达已成为热点。作为研究
方法的一种补充，本试验利用人工小RNA技术构建的
真核表达载体 pFGC-amiAtppc123，在转入拟南芥后，
amiRNA进行了超量表达。转基因拟南芥的表型变
化、各基因的表达水平、PEPC酶活性、脂肪酸含量与
成分、干旱及盐碱胁迫等方面有待后续研究。
PEPC基因在植物中多以基因家族存在，使用传
统的反义RNA技术或RNA干涉技术敲除一个基因，
其他的同源基因可能会大量表达，进行补偿作用，从而
减弱沉默效果；而如果构建RNAi串联的表达载体以
同时干涉几个基因，则需要进行多次酶切和连接步骤；
相对地，笔者采用的 amiRNA技术是利用植物内源的
microRNA骨架序列进行片段替换产生的，该方法需
时短、操作简单，其成熟片段序列专一和特异结合靶目
标的优点，使它可以有效地作用于单基因或具有相似
功能的多基因家族，而不影响其他非靶基因的表达。
同时，在人工小RNA载体的构建和转化过程中，
应注意以下问题：首先，由于成熟的amiRNA片段序列
与沉默效率高度相关，经过 4轮 PCR得到的人工小
RNA前体，在克隆至T载体后，需重复测序验证，以保
证所设计的 amiRNA序列已正确替换 pRS300的原有
序列；其次，理论上的结合效率是基于 amiRNA与靶
mRNA两者结合位点序列推测得到的，由于mRNA的
实际高级结构难以预测，所选 amiRNA片段可能无法
接近靶位点，因而对同一靶基因或基因家族选择 2~3
个 amiRNA序列是比较保险的方法，这部分的工作也
在进行中；最后，在应用花序浸染法转化拟南芥时，用
1/2MS+5%蔗糖溶液稀释农杆菌菌体，将加入的表面
活性剂（Silwet L-77）终浓度由0.05%降低为0.02%，可
以减少浸染后拟南芥花序发黄致死的毒性现象，提高
转化效率。
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