全 文 ：华北农学报 · 2010, 25(2):35-39
收稿日期:2009-12-21
基金项目:吉林省科技厅项目(20060545);长春市科技局国际合作项目(2007GH28)
作者简介:潘怡欧(1978-),女 ,吉林长春人 ,讲师 ,博士 ,主要从事昆虫毒理学和昆虫生理生化研究。
通讯作者:席景会(1965-),男 ,黑龙江人 ,教授 ,博士,硕士生导师 ,主要从事昆虫与植物互作蛋白质组学的相关研究。
茉莉酸诱导的拟南芥叶片蛋白质组分析
潘怡欧 ,刘琳琳 ,张炬红 ,张　静 ,安少利 ,许　鹏 ,靳军灵 ,刘志伟 ,席景会
(吉林大学 植物科学学院 ,吉林 长春　130062)
　　摘要:植物在长期进化过程中形成了自我防御机制 , 能够产生特异的抗性蛋白来应对各种生物因子的胁迫 , 其中
茉莉酸信号途径是植物必需的防御机制。本研究对拟南芥施用茉莉酸处理和对照叶片蛋白质的差异表达变化 , 并试
图通过蛋白质组学技术来检测茉莉酸诱导的蛋白质 ,通过蛋白质双向电泳发现有 28个蛋白点发生了显著的变化 ,其
中 19个蛋白点上调表达 , 9个蛋白点下调表达。选择 10个差异蛋白点进行了质谱鉴定 , 它们分别是苏氨酸蛋白激
酶 、热激蛋白 、不依赖于维生素 B
12
的蛋氨酸合酶 、腺嘌呤琥珀酸合酶 、碳酸酐酶等 , 这些蛋白质可能在拟南芥叶片应
答茉莉酸反应的过程中起到重要作用 ,进一步进行差异蛋白的功能分析对揭示茉莉酸信号通路和植物防御机制的关
系具有重要的作用。
关键词:拟南芥;茉莉酸甲酯;双向电泳;质谱
中图分类号:Q51　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2010)02-0035-05
ProteomicAnalysisofArabidopsisLeafProteins
inResponsetoMethylJasmonate
PANYi-ou, LIULin-lin, ZHANGJu-hong, ZHANGJing,
ANShao-li, XUPeng, JINJun-ling, LIUZhi-wei, XIJing-hui
(ColegeofPlantScience, JilinUniversity, Changchun　130062, China)
Abstract:Plantsproducejasmonicacidormethyljasmonate(MeJA)inresponsetomanybioticstresses, particu-
larlyinsectherbivores.Jasmonateisessentialsignalpathwayforinsectdefenseinplants.Togetabeterunderstanding
thedefenseresponseinplantsforMeJA, two-dimensionalelectrophoresis(2-DE)accompaniedwithmassspectrometry
(MS)werethereforeappliedtothestudy.Inthisstudy, weidentifiedsomeproteinsinvolvedinjasmonatesignaling,
whichisessentialforplantdefense.Oftheexperiments, 28proteinspotswithatleast2-foldchangedexpressionwere
foundinArabidopsis, 10outofwhichweresuccessfulyidentifiedusingMALDI-TOF/TOFMSanalysis.TheMeJAre-
sponsiveproteinsincludedserine-threonineproteinkinase, chloroplastheatshockprotein70-1, independentVB12 me-
thioninesynthetase, adenylosuccinatesynthase, carbonicanhydrase, andetal.Wewereabletodetermineafewpro-
teinsthatdisplayedabundancechangesinresponsetoMeJA.UnderstandinghowtheplantresponsetoMeJAisregula-
tedwilprovidetoolsforabeterstudyofinduceddefensemechanism.
Keywords:Arabidopsisthaliana;Methyljasmonate;Two-dimensionalelectrophoresis;Massspectrometry
　　当植物受到生物和非生物因子胁迫时 ,植物会
产生茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)。茉莉酸是
植物体内亚麻酸经十八碳烷酸途径合成的一种植物
激素。它的作用是作为信号分子去激活植物防御反
应相关基因的表达 ,茉莉酸类物质在诱导植物发生
抗性反应中发挥重要作用 。研究发现 ,大豆 、水稻 、
拟南芥等植物遭到昆虫为害和病原物侵染后 ,茉莉
酸类物质水平升高;同时 ,外源茉莉酸类物质可以诱
导相关防御基因的表达 。用茉莉酸类化合物处理植
物 ,不仅可系统诱导蛋白酶抑制剂和多酚氧化酶的
合成 ,还能增加过氧化物酶和脂氧合酶等防御蛋白
的活性 ,从而提高植物的抗虫性[ 1] 。 Mewis等 [ 2]利
36　 华　北　农　学　报 25卷
用突变体以及外源激素处理等方法证实 JA与植物
的诱导防御相关 。至今有关植物对植食者诱导抗性
的研究中 ,主要注重诱导抗性现象的描述及其生理
生化机理的探索 ,有关植物产生抗虫作用的机制在
许多方面还不清楚 ,如各种信号通路在细胞和分子
水平上调控植物诱导防御的机制 ,茉莉酸信号通路
相关蛋白与植物抗虫性的关系等[ 3] 。
自从 Farmer和 Ryan[ 4]报道外源茉莉酸甲酯能
够诱导植物的抗虫性后 ,茉莉酸和茉莉酸甲酯对植
物抗虫作用的诱导受到了人们的关注 ,有许多研究
报道[ 5] 。茉莉酸能调节植物生长发育的多个过程 ,
更为重要的是 ,茉莉酸能提高植物在虫害胁迫条件
下的抗性反应 ,并且可以作为激发子诱导植物防卫
基因的表达 [ 6] 。
植物防御分子机制的研究取得了一定的进展 ,
但仍然有很多利用基因组学技术难以解决的问题 。
同时基因在转录 、翻译后产生蛋白质的过程中 ,存在
着转录水平 、翻译水平的调控 ,仅在核酸水平不能提
供完整的信息。蛋白质组学的发展为虫害诱导的植
物防御机制的研究开拓了新的思路 ,突破从单个基
因或基因组着手研究的局限性 ,为进一步阐明许多
尚不清晰的植物诱导防御机制提供了技术基础 。
本研究以模式植物拟南芥为材料 ,利用 MeJA
做激发子 ,分析了拟南芥叶片在 MeJA处理后蛋白
表达的差异 ,以期探讨非生物激发子诱导拟南芥的
效果 ,旨在为有效利用植物诱导防御机制提供理论
依据。
1　材料和方法
1.1　试验材料及处理
拟南芥(Arabidopsisthanliana, Col-0),拟南芥种
子在 MS培养基中培养至出芽后 7 d,幼苗转移至营
养土和蛭石混合培养(营养土∶蛭石≈2∶1),在人工
气候箱中培养 21 d,培养条件为白天 22℃,光强度
80 μmol/(s·m2),夜晚培养温度 20℃,相对湿度为
75%,光暗比为 16 h∶8 h。
喷洒 MeJA诱导处理组:配制 0.1mmol/L浓度的
MeJA,取出培养 28d的拟南芥 ,把 0.1mmol/L浓度的
MeJA溶液喷洒在拟南芥叶片上 ,放置回培养箱中 , 8 h
后收集植株 ,液氮冷冻 ,放入 -80℃冰箱中保存。
空白对照组:用 MiliQ级纯水喷洒培养 28 d的
拟南芥植株 , 8 h后收集植株 , 液氮冷冻 , 放入
-80℃冰箱中保存 。
1.2　蛋白质样品制备
蛋白质提取方法采用饱和酚抽提法 [ 7] 。样品
溶解在常用的蛋白质裂解液中(7 mol/L尿素 , 2
mol/L硫脲 , 2% CHAPS, 2% SB3-10, 20 mmol/L
DTT, 5 mmol/LTCEP, 2% IPGBufer, 0.002%溴酚
蓝)。蛋白浓度采用 Bradford法 [ 8]测定 ,蛋白质样
品冻存于 -80℃备用 。
1.3　蛋白质双向电泳
1.3.1　等电聚焦(IEF)　剥开固相 pH梯度(IPG)
胶条(pH4 ～ 7)保护膜后 ,将 IPG胶条胶面朝下置
于预先加好样品液的聚焦槽中 ,矿物油覆盖后室温水
化 16 h(水化上样 300μg),然后进行等电聚焦电泳。
试验所用仪器为 EtanDALT双向电泳仪。
1.3.2　胶条平衡和 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳　等
电聚焦结束后进行 IPG胶条的平衡 ,胶条平衡参照
Finnie等[ 9]报道的方法进行 ,平衡后进行聚丙烯酰
胺凝胶电泳 ,采用恒流进行电泳 ,待电泳至凝胶前沿
约 0.5 cm时 ,终止电泳。每个试验样品重复 6次。
1.3.3　银染及凝胶图像分析　分析胶按照 Blum
等[ 10]报道的方法对蛋白质凝胶进行染色 ,染色结束
后 ,利用 ImageMasterTM 2DPlatinum6.0软件对双向
电泳凝胶图像进行分析 ,分析步骤包括差异蛋白点
检测 、凝胶图谱标准化处理 、蛋白点匹配和生物
统计 。
制备胶蛋白样品上样量为 1 200 μg,除了上样
量与分析胶不同外 ,其他电泳条件一致 ,利用考马斯
亮蓝法染色。
1.4　差异蛋白的质谱鉴定
从考马斯亮蓝染色的凝胶上选取差异蛋白点 ,
切取差异点后 ,采用胰蛋白酶对其进行酶解 ,酶解采
用 Hughes等 [ 11]报道的方法进行。利用 MALDI串
联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF, ultraflexII,
BrukerDaltonics)进行蛋白鉴定 ,通过 MASCOT网站
程序检索 NCBInr和 SwissProt数据库进行蛋白质的
鉴定 。
1.5　生物信息学分析
依据 MapMan数据库 (htp://www.mapman.
org.uk)提供的注释信息 ,以及美国拟南芥信息资源
中心(TheArabidopsisInformationResource, TAIR)提
供的信息 ,进行蛋白质功能分类。
2　结果与分析
2.1　茉莉酸诱导条件下拟南芥叶片蛋白质双向电泳
对拟南芥在茉莉酸甲酯处理后的样品和对照样
品的蛋白质进行了双向电泳 ,蛋白质凝胶进行银染
后 ,通过软件分析 ,在 pH4 ～ 7的蛋白质凝胶上 ,平均
可识别(1 036±41)个蛋白点 ,重复性较好(图 1)。
2期 潘怡欧等:茉莉酸诱导的拟南芥叶片蛋白质组分析 37　
图 1　茉莉酸诱导条件下拟南芥叶片蛋白质双向电泳图谱
Fig.1　Proteomicmapsoftwo-dimensionallyseparatedcontrolandJAinducedleafproteinsforArabidopsisthaliana
　　利用 ImageMaster2D软件凝胶图谱分析的结果
表明 ,一些蛋白在不同处理间的表达丰度存在明显
的差异 ,以蛋白质丰度变化在 2倍以上作为检测阈
值 ,结果表明在茉莉酸诱导条件下 ,有 28个蛋白点
的表达发生了变化 ,这些蛋白点在 2-DE图谱表现
上调或下调 ,反映了在茉莉酸甲酯诱导条件下拟南
芥叶片蛋白的表达特点。
2.2　茉莉酸诱导条件下拟南芥叶片蛋白的差异表达
对茉莉酸甲酯诱导组的拟南芥蛋白进行双向电
泳 ,比较对照和处理的 2-DE凝胶图谱 ,经分析发
现 ,茉莉酸甲酯喷洒诱导处理拟南芥 8 h后 ,有 28
个蛋白点的丰度发生了显著变化(蛋白点的丰度变
化在 2倍以上),其中 19个蛋白点上调表达 , 9个蛋
白点下调表达(图 2)。
差异蛋白质组学研究的目标在于通过不同处理
条件下样本之间蛋白质的差异 ,揭示并验证蛋白质
的变化与相关功能蛋白的关系 ,这需对蛋白进行质
谱鉴定和生物信息学分析 。
2.3　差异表达蛋白的质谱鉴定
利用 MALDI-TOF/TOFMS技术对制备胶表现
明显的 12个差异蛋白点进行了质谱分析 ,采用 Ma-
trixscience网站提供的 Mascot检索程序 ,进行数据
库检索 ,对检索数据进行分析 ,其中有 10个蛋白点
被成功鉴定 ,有 2个蛋白的分数较低 ,未能得到鉴
定 ,结果见表 1。
所鉴定的蛋白包括苏氨酸蛋白激酶 、热激蛋白 、
不依赖于维生素 B12的蛋氨酸合酶 、腺嘌呤琥珀酸合
酶 、碳酸酐酶 、DNA损伤修复蛋白 、二氢新蝶呤醛缩
酶 、肌动蛋白和尿苷酸激酶 ,还有一个未知功能的蛋
白质。经过功能分析发现这些蛋白在热胁迫 、氨基
酸代谢 、核苷酸代谢 、光合作用 、碳代谢等方面发挥
重要的作用。
图 2　拟南芥在茉莉酸甲酯诱导条件下的蛋白点的丰度变化
Fig.2　Imagesof2-DEfromArabidopsisthanlianaunder
MeJAstresswithproteinspotsabundancechanges
3　讨论与结论
3.1　热激蛋白(Chloroplastheatshockprotein70-
1, HSP70-1)
植物在长期的进化过程中 ,形成一系列独特的
生理机制 ,能够对不同类型的胁迫做出应答 ,以避免
或减少胁迫对自身的伤害 ,热激蛋白是植物对逆境
胁迫的防卫机制成员中的一员 ,其在逆境胁迫下的
表达增强可提高植物防御的能力 [ 12] 。 HSP70作为
分子伴侣 ,通过阻止蛋白聚合而有助于植物细胞适
38　 华　北　农　学　报 25卷
应不同逆境 ,当植物受到害虫危害后 ,叶片的蒸腾速
率增加 ,从而加大了干旱的风险 ,而 HSP70的诱导
表达可能有利于植物防御害虫的取食诱导所产生的
间接伤害。 Tsvetkova等 [ 13]研究结果表明 , HSP可以
调节膜脂多态性 ,稳定膜的液晶相 , HSP与膜脂的相
互作用可提高膜的流动性。HSP与膜的缔合作用可
以维护膜的完整性 ,这可能是植物在受到外界胁迫
下的保护机制之一 。
表 1　茉莉酸甲酯处理后差异蛋白的质谱鉴定
Tab.1　DifferentialyexpressedproteinsidentifiedbyMSinresponsetomethyljasmonicacidforArabidopsisthaliana
蛋白点号No. 登录号AGI 蛋白质名称Proteinname 蛋白功能Proteinfunction 蛋白分值Score 肽段匹配率 /%S.C
1 AT2G25880 threonineproteinkinase BIN35.2 80 53
2 AT4G24280 chloroplastheatshockprotein70-1 BIN20.2.1 511 34
4 AT5G17920 cobalamin-independentmethioninesynthase BIN13.1.3.4 475 30
10 AT3G57610 adenylosuccinatesynthase BIN23.1.2.20 196 6
13 AT3G05010 carbonicanhydrase BIN8.3 161 33
18 AT1G09310 unknownprotein BIN35.2 108 58
22 AT1G20340 DRT112 BIN1.1.5.1 119 27
24 AT3G11750 7, 8-dihydroneopterinaldolase BIN25.9 65 9
27 AT4G29350 actin BIN31.1 204 44
28 AT3G18680 uridylatekinase BIN23.4 301 40
　　活性氧(Reactiveoxygenspecies, ROS)作为信号
分子在植物抵抗病原菌的入侵和对逆境胁迫的过程
中起作用。当植物体遭遇逆境胁迫时 ,细胞中 ROS
水平会大大增加而形成氧化胁迫 ,造成细胞组分如
蛋白质 、碳水化合物和脂质的氧化损伤 。而 HSP作
为抗氧化剂 ,可以清除过剩的活性氧 ,表明在茉莉酸
处理情况下 , HSP表达量的提高有助于增强植物的
抗逆能力[ 14] 。在分子水平深入研究 HSP的功能以
及与其他蛋白分子之间的作用关系 ,将有助于弄清
其在提高植物抗逆能力的作用机制。
3.2　碳酸酐酶(Carbonicanhydrase)
碳酸酐酶是一个重要的光合作用酶 ,它通过催
化 CO2和 HCO3 -之间的相互转化反应 ,来降低 CO2
在叶肉细胞中的扩散阻力 ,为羧化反应提供底物 。
碳酸酐酶的作用是在液相中将 CO2分子融化为溶
解度高 、易于运输的离子态 HCO3 -,加快 CO2在液
相中的转运速率 ,减小光合作用非气孔限制 。碳酸
酐酶参与多种生物过程 ,包括 pH调节 、离子交换 、
CO2转运 、呼吸作用和光合 CO2固定等 [ 15] 。
在茉莉酸诱导条件下 ,碳酸酐酶表达量增加 ,说
明活性增强 ,不同程度地提高了植物的光合作用 ,碳
酸酐酶对光合作用的调控作用使得碳酸酐酶活性增
加的同时光合速率也上升 。而在病原菌侵染和昆虫
取食胁迫条件下 ,植物细胞原有的体内平衡被打破 ,
为了建立新的平衡植物需要启动各种防御措施 ,如
清除氧自由基及合成渗透调节物质 ,这些过程均需
要消耗额外的能量 ,碳酸酐酶的变化可能有助于植
物激活整个能量代谢过程 ,提高植物的防御功效 。
而 Slaymaker等 [ 16]报道 ,碳酸酐酶具有抗氧化活性 ,
能够降低植物在受到病原菌侵染时所产生过量的
ROS,增强了植物的抗病性。
在本试验中 ,通过质谱鉴定还检测到一个在茉
莉酸甲酯诱导下表达变化的未知功能的蛋白质 ,由
于对未知蛋白的信息了解有限 ,茉莉酸诱导的表达
变化与植物防御机制的关系还需要进行深入的
研究 。
本研究利用蛋白质双向电泳并结合质谱技术鉴
定了茉莉酸甲酯应答蛋白的改变 ,其中部分蛋白是
新发现的茉莉酸甲酯应答蛋白 ,经分析这些蛋白可
能在茉莉酸甲酯信号转换中发挥重要作用 ,它们的
功能需要进一步的研究 。
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