全 文 ：第 39卷第 2期　　　　　　　　　　 　　　　　上海师范大学学报(自然科学版) Vol.39, No.2
2 0 1 0年 4月　　　　　　　　　　 JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) Apr., 2 0 1 0
拟南芥转录因子 TDF1的原核
表达及多克隆抗体制备
周　茜 1 , 曹志林 2 , 俞　俞 1 , 杨仲南 1＊
(1.上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 200234;
2.河南工程学院 资源与环境学院 ,郑州 451191)
摘　要:在拟南芥花药发育过程中 , MYB家族转录因子 TDF1在调控绒毡层发育及后期功能
上起到关键的作用.利用 PCR方法扩增 TDF1基因并克隆到原核表达载体 pET-32a.将表达载
体 TDF1-pET32a转入大肠杆菌 BL21(DE3),用 IPTG成功诱导表达了分子量约为 56KD的
TDF1融合蛋白.该融合蛋白主要以包涵体形式存在 ,分离出包涵体后进行可溶性处理作为抗
原免疫家兔.制备出的多克隆抗血清经 ELISA测定效价为 1∶2560 , Westernblot检测表明该抗
血清与 TDF1融合蛋白识别良好.TDF1抗体的制备有助于进一步从生化水平上研究 TDF1在
花药发育中的功能.
关键词:原核表达;拟南芥;转录因子;TDF1;融合蛋白;多克隆抗体
中图分类号:Q511　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5137(2010)02-0175-06
　　　　　　　　　　
收稿日期:2009-11-25
基金项目:国家自然科学基金(30770206).
作者简介:周　茜(1985-), 女 ,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生;杨仲南(1965 -), 上海师范大学
生命与环境科学学院教授.
＊通讯作者.
0　引　言
转录因子是指与靶基因启动子中的顺式作用元件发生特异性相互作用 ,并对转录过程起激活或抑
制作用的 DNA结合蛋白.MYB家族转录因子以保守的 DNA结合域为共同特征 ,是植物最大的转录因
子家族之一 , R2R3-MYB转录因子是植物中数目最多的一类 MYB蛋白 ,其 N-端都含有包含 2个重复的
螺旋-转角 -螺旋的 R2R3DNA结合结构域 [ 1, 2] .花药是植物的雄性生殖器官 ,是花粉发育的场所.绒毡层
在花药发育过程中起着至关重要的作用 ,它释放酶复合物降解胼胝质 ,提供花粉发育所必需的营养物
质 ,并参与调控花粉外壁的形成 [ 3] .TDF1基因编码了一个拟南芥细胞核定位的 R2R3-MYB家族转录因
子.在花药发育早期 ,该转录因子特异性地在绒毡层 ,花粉母细胞和小孢子中高效表达.该基因突变 ,绒
毡层发育异常 ,其功能出现紊乱 ,导致花粉不能形成 ,突变体呈雄性不育表型 [ 4] .但是在生化水平上 ,
TDF1在花药发育中的具体功能还不清楚.
抗体的制备是在生化水平上研究蛋白质功能的一个重要途径.根据制备的原理和方法 ,抗体可分为
多克隆抗体 ,单克隆抗体和基因工程抗体 ,其中多克隆抗体的制备方法比较成熟 ,过程简单 ,因此被广泛
应用.由于一种抗原有多个不同的抗原决定簇 , B淋巴细胞克隆可以识别每一个抗原决定簇 ,并产生出
针对它们的抗体 ,因此这种异种免疫血清中含有的抗体是多克隆抗体 [ 5] .利用原核表达的蛋白免疫动
物来制备多克隆抗体是一种十分有效的方法.在本研究中 ,克隆获得 TDF1基因 ,并构建了原核表达载
　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
体 TDF1-pET32a,将其转入大肠杆菌 BL21(DE3),经 IPTG诱导后在原核细胞中成功表达了这个蛋白.
该融合蛋白主要以不溶的包涵体形式表达 ,以洗涤纯化溶解后的包涵体作为抗原免疫家兔 ,制备出了效
价较高 ,特异性较强的多克隆抗体 ,这些工作为进一步用生化手段研究该转录因子的 DNA结合位点和
下游基因奠定了基础.
1　材料与方法
1.1　试剂和材料
1.1.1　质粒与菌株
pMD18-T载体购自大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司;原核表达载体 pET-32a(+)购自北京鼎国
生物技术有限公司;大肠杆菌感受态菌株 DH5α及 BL21(DE3)由本实验室提供.
1.1.2　生物学试剂
T4 DNA连接酶 、限制性内切酶 SacI、XhoI和 PrimestarDNA聚合酶购自大连宝生物工程(TaKaRa)
有限公司;福氏完全佐剂 、福氏不完全佐剂 、dNTPs、PCR产物回收试剂盒 、Tris、SDS、TEMED及 IPTG等
常用分子生物学试剂购自北京鼎国生物技术有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔 IgG、ECL
化学发光检测试剂盒 、PVDF膜购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司;引物由 Invitrogen公司合成.
1.2　方法
1.2.1　TDF1基因的克隆
参照 GenBank中序列设计用于扩增 TDF1基因的引物.上游引物序列为 TDF1F:5′-AAGAGCTCAT-
GGGAAGACCTCCTTGTTG-3′,含有 SacI位点;下游引物序列为 TDF1R:5′-AACTCGAGATAATCGAAAT-
CATTCAAGAGTTGA-3′, 含有 XhoI位点.以实验室现有的含 TDF1基因的质粒 [ 4]作为 PCR模板.PCR
反应体系为:10×bufer5 ×10-6 L, dNTPMixture5 ×10-6 L(0.0025 mol/L), 引物各 1.5 ×10-6 L
(0.01 mol/L),模板1×10-6 L, PrimestarDNA聚合酶 1×10-6 L,去离子水补充体积至 5×10-5 L,反应
条件为 2步法:94℃变性 30 s, 62℃退火及延伸 1min, 35个循环;72℃ 10min.经琼脂糖凝胶电泳后 ,
回收扩增产物 ,连接到 pMD18-T载体(步骤参照 TaKaRa公司说明书),转化至 E.coliDH5α中 ,涂布于
含氨苄青霉素(100mg/L)的 LB固体培养基上 , 37 ℃培养过夜.筛选出克隆后 ,挑取单菌落 ,提取质粒 ,
用 SacI、XhoI限制性内切酶进行双酶切鉴定 ,将鉴定正确的克隆进行测序(上海桑尼公司).
1.2.2　原核表达载体 TDF1-pET32a的构建
上述重组质粒 TDF1-T用 SacI, XhoI于 37 ℃消化 5h, 经琼脂糖凝胶电泳 , 回收的 TDF1片段与同
样用 SacI, XhoI酶切的 pET-32a载体进行连接 , 转化入感受态 E.coliDH5α中 , 涂布于含氨苄青霉素
(100mg/L)的 LB固体培养基上.挑取单菌落培养后抽提质粒 ,进行 PCR和双酶切鉴定 ,保存重组质粒.
1.2.3　融合蛋白的诱导表达及可溶性分析
鉴定正确的 TDF1-pET32a质粒与空载体 pET32a(阴性对照)分别转化表达菌株 E.coliBL21(DE3)
感受态 ,涂在含有氨苄青霉素的 LB平板上 , 37 ℃培养过夜.挑取 TDF1-pET32a和 pET32a各一个单菌
落分别于 1mL含氨苄青霉素的 LB液体培养基中 , 37 ℃振荡培养过夜.各取 5×10-5 L菌液转至 5 mL
含氨苄青霉素的 LB液体培养基中 , 置 37 ℃振荡培养 2 ～ 4 h, 至 OD600为 0.5 ～ 1.0, 各取 1mL菌液放
入离心管中 , 高速离心 1 min, 收集细菌沉淀 (未经 IPTG诱导).剩余的菌液加入 IPTG,至终浓度为
0.001 mol/L进行蛋白诱导 , 在 1h, 2 h, 3.5h, 5 h分别收集 1 mL菌液 , 并测定其 OD值 , 高速离心
1 min, 收集细菌沉淀.每管细菌沉淀按 OD值大小加入适量的 1×SDS蛋白加样缓冲液 , 置于 100 ℃煮
沸 3 min,离心后取上清于 12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳 [ 6] .
融合蛋白可溶性分析:1mL诱导菌液离心后 ,加入 5×10-5 LPBS重悬菌体 ,然后用液氮反复冻融
十次 ,离心后分别收集上清跟沉淀 ,沉淀再以 5×10-5 LPBS重悬 ,进行 SDS-PAGE电泳 ,分析融合蛋白
是以包涵体还是可溶蛋白形式存在.
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　第 2期 周　茜 , 曹志林 , 俞　俞, 等:拟南芥转录因子 TDF1的原核表达及多克隆抗体制备 　　
1.2.4　包涵体蛋白的可溶性处理及抗原制备
包涵体蛋白的可溶性处理参照 Kirubakaran等[ 7]的方法 , 将包涵体用 3倍体积的洗涤缓冲液
(0.01 mol/LTris-HCl, pH7.5, 0.3mol/LNaCl, 0.001mol/LEDTA, 1%TritonX-100和 1mol/Lurea)清
洗三次 ,每次 4℃ 10000转离心 10 min,然后包涵体沉淀溶解于 10倍体积的溶解缓冲液(0.05 mol/L
Tris-HCl, pH7.8;0.005mol/LMgCl2;0.0025 mol/L2-mercaptoethanol;0.1% (w/v)Tween20;8 mol/L
urea),在室温下孵育 1 h.
抗原制备:纯化溶解后的包涵体上样进行 SDS-PAGE电泳 , PAGE胶用考马斯亮兰染色液染 20 min
后 ,再用脱色液脱色干净.用刀片切下 56KD处的目的条带 ,放在干净的离心管中 ,加适量的 PBS溶液 ,
用磨棒碾碎备用.
1.2.5　多克隆抗体制备及效价鉴定
抗体制备:取 1mL碾碎的包含抗原的 PAGE胶与 1 mL弗氏完全佐剂混匀后对成年健康家兔进行
背部多点皮下注射 , 10d后用相同的碾碎的样品与 1 mL弗氏不完全佐剂混匀 ,注射家兔.相同的实验
再重复两次(后两次不加弗氏不完全佐剂),每次间隔 10d.最后一次注射一周后 ,对被免疫的兔子进行
心脏取血 ,血液放 37℃温育 1 h,然后放 4℃过夜 ,析出的血清加叠氮钠 ,分装后 -20℃保存.
用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价 ,免疫后的兔抗血清用 PBS逐一按 2倍稀释分别加入
已包被抗原的反应孔中 ,以 PBS做为阴性对照 ,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶5000),用
底物 TMB显色 , 2 mol/LH2SO4终止反应.用酶标仪在 A450测定吸光值.
1.2.6　Westernblot检测
Westernblot检测:将样品蛋白进行 SDS-PAGE电泳后 ,经电转仪转移到 PVDF膜上.将膜用含 5%
脱脂奶粉的 TBST溶液封闭 1.5h, 清洗后加入按 1∶200稀释于 TBST中的兔多克隆抗体 , 在摇床放置
1 h,以 TBST清洗一抗 1 h,每 15 min换一次清洗液.再加稀释于 TBST中的 HRP标记的羊抗兔 IgG
(1∶10000),在摇床放置 1h, TBST清洗二抗 1h,每 15min换一次清洗液.洗膜后加 ECL工作液 ,在可见
光下室温孵育膜数分钟 ,将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于 X光片曝光暗盒.然后转入暗室将 X光胶
片压在膜上曝光数秒 ,显影定影于 X光胶片上.
2　结果与分析
2.1　TDF1融合蛋白表达载体的构建
以前期工作中构建的含有 TDF1基因的质粒 [ 4] 为模板 , 利用上述引物 , 在高保真 PrimeStar
聚合酶的作用下经 PCR扩增得到大小为 951 bp的 TDF1基因(图 1 -A).随后 ,将获得的 TDF1
基因克隆到 pMD18-T载体 ,得到过渡载体 TDF1-T.经限制性内切酶 SacI/XhoI消化后 ,电泳结
果表明 TDF1已成功克隆入 pMD18-T(图 1 -B).利用 T载体上的 M13通用引物进行测序分
析 ,结果表明目的片段序列与 Genbank数据库序列吻合 .为了获得大量的 TDF1蛋白 ,采用了原
核表达的载体 pET-32a(+)进行蛋白表达实验.用限制性内切酶 SacI和 XhoI将过渡载体中
TDF1片段切下后 , 将其克隆入 pET-32a(+),转化 E.coliDH5α感受态后的重组质粒用限制性
酶切鉴定可以看到一条大约 951 bp的条带 (图 1 -C),测序结果表明目的基因 TDF1位于正确
的读码框中 ,获得了原核表达质粒 TDF1-pET32a.将构建好的 TDF1-pET32a及作为阴性对照的
pET32a空载体转化入表达菌株 E.coliBL21(DE3)感受态中 , PCR鉴定显示 TDF1-pET32a含有
目的基因片段(图 1-D).
2.2　TDF1融合蛋白的原核表达
预期的 TDF1蛋白分子量为 35.8KD[ 4] , pET32a质粒所带标签蛋白(Trx-Tag, His-Tag及 S-Tag)分子
量为 20.4KD(图 2B2),所以表达的 TDF1与标签蛋白融合后分子量约为 56.2KD.按照材料与方法中所
述步骤进行蛋白诱导表达实验 , SDS-PAGE电泳结果显示 ,诱导 1h, 2 h, 3.5h及 5 h后 ,在 56.2KD处可
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　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
见 TDF1重组蛋白的条带(图 2 A2 ～ A5).此外 , TDF1的蛋白表达量随诱导时间延长而逐渐增加(图 2
A2 ～ A5),表明 TDF1重组蛋白能够在原核中稳定表达.
图 1　融合蛋白表达载体的构建 图 2　TDF1重组蛋白的诱导表达
图 3　融合蛋白可溶性分析及包涵体的纯化溶解
2.3　融合蛋白可溶性分析
SDS-PAGE电泳结果显示 ,诱导菌经液氮
反复冻融后 ,上清液里几乎没有目的融合蛋
白 ,而融合蛋白大部分都存在沉淀中 ,故诱导
表达的 TDF1重组蛋白主要是以不溶的包涵
体形式表达(图 3-3, 3-4).对包涵体进行洗涤
纯化和溶解后 ,可以看到大部分的杂蛋白已
被去除(图 3-5),切胶富集融合蛋白包涵体后
用于抗体制备.
2.4　抗体的制备与检测
溶解后的融合蛋白包涵体进行 SDS-
PAGE电泳 , 切下的含有目的蛋白的 PAGE
胶碾碎后分 4次注射家兔后 ,对家兔进行心
脏取血 ,血液经 37 ℃温育后 ,低温放置过夜
析出多克隆抗血清.多抗经 ELISA实验测定效价 ,因底物是 TMB,故用酶标仪在 A450测定吸光值.计
算样本 OD值与对照 OD值的比值 P, P大于等于 2.1为阳性 ,小于 2.1大于 1.6为可疑 ,小于 1.6为
阴性.实验数据见表 1,当抗血清稀释至 2560倍的时候 , P值为 2.6,为阳性 ,稀释到 5120倍的时候 ,
P值为 1.6,结果不可信 ,而稀释到更高倍数时 , P值小于 1.6了 ,表现为阴性.故实验结果表明抗血
清效价为 1∶2560.
表 1　ELISA实验结果 　
稀释倍数 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240
样本平均 OD值 1.156 1.015 0.883 0.737 0.548 0.354 0.210 0.130 0.087 0.073
阴性对照 OD值 0.052 0.050 0.052 0.053 0.050 0.052 0.050 0.050 0.054 0.051
OD样本 /OD对照 22.2 20.3 17.0 13.9 11.0 6.8 4.2 2.6 1.6 1.4
　　为了进一步分析获得的抗体对 TDF1蛋白的识别 ,用 Westernblot技术检测抗体.杂交后经 HRP标
记的羊抗兔显色试剂盒显色 ,用 X光胶片显影 ,在胶片上可在目的蛋白 56.2KD处看到清晰的条带 ,这
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图 4　融合蛋白Westernblot检测结果
表明多克隆抗体与目的蛋白识别良好(图 4).
3　讨　论
本研究利用分子生物学技术克隆了 TDF1基因 ,并逐步构建
到原核表达载体 pET32a中.诱导表达结果显示 ,构建的原核表达
载体 TDF1-pET32a经 IPTG诱导后 , TDF1融合蛋白以包涵体的形
式得到了高效稳定的表达.产生的包涵体是高密度 ,不溶性的蛋
白表达产物 ,它的形成使目的蛋白的分离纯化变得更为容易.先
前的研究表明 ,包涵体经过洗涤后可以去除可溶的 ,粘附的细菌
蛋白.多数情况下 ,调整洗涤的条件可使包涵体中外源蛋白的纯
度达到 90%以上 ,从中提取的蛋白可以直接用作抗原[ 6] .故而在本实验中将包涵体先用含 1mol/L尿素
的缓冲液清洗多次 ,尽可能除去菌液中含有的可溶性的杂蛋白 ,清洗后的包涵体再用含 8 mol/L浓度尿
素的缓冲液在室温下溶解 ,这样处理后的包涵体内外源蛋白被溶解 ,离心后存在于上清里.经 SDS-
PAGE电泳后可以看到大部分杂蛋白已经被去除 ,用刀片切下 56KD左右的目的蛋白可以做为抗原免疫
家兔.对获得的多克隆抗血清经 Westernblot技术检测 ,结果显示制备的抗体与目的蛋白识别良好.
R2R3-MYB转录因子广泛参与植物次生代谢调控 、激素和环境因子的应答 ,并对细胞分化 、器官的
形成 、植物叶片的形态建成及抗病具有重要的调节作用 [ 8] .然而对于 MYB转录因子 TDF1作用位点及
下游基因的研究并不清楚.虽然可以采用 CASTing的策略寻找转录因子的 DNA结合位点 [ 9, 10] ,染色质
免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation, ChIp)的方法可以用来在体内鉴定转录因子直接调控的下游
基因.但是这些方法都需要特异性很高的蛋白抗体 [ 11] .本研究制备的抗体与目的融合蛋白 TDF1特异
性较强 ,可用于 TDF1作用位点及其直接调控的下游基因功能的研究 ,有助于生化水平上深入研究
TDF1在花药发育中的分子机理.
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Prokaryoticexpressionofthearabidopsistranscriptionfactor
TDF1 andpreparationofitspolyclonalantibodies
ZHOUXi1 , CAOZhi-lin2 , YUYu1 , YANGZhong-nan1＊
(1.ColegeofLifeandEnvironmentSciences, ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234, China;
2.DepartmentofResourceandEnvironmentalEngineering, HenanInstituteofEngineering, Zhengzhou451191, China)
Abstract:InArabidopsis, TDF1 encodesaMYBtranscriptionfactorwhichplaysavitalroleintapetaldevelopmentandfunction
duringantherdevelopment.Inthisstudy, theTDF1 genewasobtainedbyPCRmethodandclonedintotheexpressionvectorpET-
32a.Aftertheprokaryoticexpressionvector`TDF1-pET32a introducedintoE.coliBL21(DE3), theTDF1recombinantprotein
of56.2KDwasexpressedbyinductionwithIPTG.Thefusionproteinmajorlyexistedintheinclusionbody.Afterextractedfrom
theinclusionbody, theTDF1proteinwasusedastheantigentoimmunerabbits.ELISAassayshowedthatthetiteroftheprepared
polyclonalantibodywas1∶2560.TheimmunologicalspecificityofthepolyclonalantibodytoTDF1wasconfirmedbyWesternblot
analysis.ThepreparedantibodyinthisworkshouldfacilitatethefurtherfunctionalinvestigationofTDF1 inbiochemicallevelsin
Arabidopsisantherdevelopment.
Keywords:prokaryoticexpression;arabidopsis;transcriptionfactor;TDF1;fusionprotein;polyclonalantibody
(责任编辑:郁　慧)
更正:本刊第三十九卷第一期《在 quintessence中极端整体单极子黑洞的拟正则模 》作者奚萍
的工作单位应为 “上海师范大学天体物理联合研究中心 ”.
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