全 文 ：第4 2卷第 5期 上海师范大学学报(自然科学版) Vol ． 42，No． 5
2 0 1 3年 1 0 月 Journal of Shanghai Normal University(Natural Sciences) Oct ． ，2 0 1 3
拟南芥 HSP70 基因启动子表达载体的构建及
在烟草 BY2 细胞中的应用
郑 帮，陈 燕，褚艳霞，孙虎林，郑亚洁，孙恒吉，司英语，周树敏，张 卫*
(上海大学 生命科学学院，上海 200444)
摘 要:探讨了拟南芥的 HSP70 基因在液体悬浮培养的烟草 BY2 细胞中的表达及应用． 用
PCＲ扩增的方法从拟南芥 col 生态型基因组中扩增获得 HSP70 基因启动子序列，将其连入
p1300 表达载体且以 GFP为报告基因，将该表达载体采用农杆菌转基因转入液体悬浮培养的
烟草 BY2 细胞中，观察转基因细胞中报告基因 GFP 的表达情况．结果显示: HSP70: GFP 转基
因液体悬浮培养的烟草 BY2 细胞中有 GFP 的表达．该表达载体可在液体悬浮培养的 BY2 细
胞中正常表达，且可在较短时间内获得大量实验材料，对拟南芥的 HSP70 基因启动子的进一
步研究提供理论依据和丰富的实验材料，且可明显缩短实验周期．
关键词:拟南芥; HSP70 基因启动子; GFP; 烟草 BY2 细胞
中图分类号:Q 754 文献标识码:A 文章编号:1000-5137(2013)05-0492-07
收稿日期:2013-05-31
基金项目:上海市教委浦江人才计划(08PJ1405500) ;国家自然科学基金面上项目(30870225)
作者简介:郑 帮(1987 －) ，男，上海大学生命科学学院硕士研究生;张 卫(1966 －) ，男，博士，上海大学生命科学
学院教授．
* 通信作者
0 引 言
热激蛋白 HSP70 是拟南芥 HSP70 基因家族中的一种，其表达会随着温度的升高而增强，即热激特
性［1］．这种热激特性是由热激蛋白 HSP70 的启动子决定的，因此拟南芥的 HSP70 基因启动子也成为研
究的热点之一．在以拟南芥植株为实验材料，将含有拟南芥的 HSP70 基因启动子的表达载体转入其中
进行表达．受到植株生长周期长的影响，会造成实验周期长，对实验进展造成一定的影响．烟草 BY2 细
胞(Nicotiana tabacum L． cv Bright Yellow2，BY2)是非常重要而且用途广泛的细胞系［2 － 3］，由 Kato 等于
1972 年分离得到［4］． BY2 细胞可以比较容易地转化外源基因，此外，BY2 细胞系拥有高度的同一性，且
生长迅速，可获得具高度同周期性的 BY2 细胞，1 周内便可增加 80 ～ 100 倍．因此，BY2 细胞已成为研究
生物研究的模式系统［5］，而且转基因 BY2 细胞团和悬浮培养细胞都较容易获得．因此若能将含有拟南
芥的 HSP70 基因启动子且以 GFP为报告基因的表达载体转入其中，且可正常表达报告基因，则可明显
缩短实验周期，对热激蛋白 HSP70 启动子的后续实验研究提供大量丰富的实验材料．
1 材 料
1． 1 植物材料
本实验室自有拟南芥 Columbia生态型(Arabidopsis thaliana) ，置于温度为 22℃，光照为 16 h 光照，
8 h黑暗的人工光照温室培养［6］．实验室自有液体悬浮烟草 BY2 细胞，27 ℃，130 r /min，暗培养［7］．培养
第 5 期 郑 帮，陈 燕，褚艳霞，等:拟南芥 HSP70 基因启动子表达载体的构建及在烟草 BY2 细胞中的应用
基配方见参考文献［7］．
1． 2 引物和试剂
在 www． arabidopsis． org网站下载 HSP70启动子的序列并依据启动子的序列设计引物，在上下游引物
两端分别加入 HindⅢ和 Sac1酶切位点．长度选取转录起始点至上游 1． 5 kbp．实验所用引物如表 1所示．
实验室自有 GFP － T质粒． GFP基因序列已经测序验证且正确．
表 1 实验所用引物
引物作用 上 /下游(酶切位点) 序列
HSP70 克隆
上游(BamHⅠ) CAT． 0 GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
下游(Sal I) CAT GTCGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA
HSP70 阳性转基因细胞鉴定
上游 AGTTACTATTTGACAATTTA
下游 CCCTCGAACTTCACCTCGGC
引物合成由上海生工生物工程公司进行合成．
PCＲ扩增采用 takara公司生产的 KOD PCＲ扩增试剂盒． PCＲ扩增参数为:
94 ℃ 2 min
变性: 94 ℃ 30 s
退火: 52 ℃ 30 s
延伸: 68 ℃ 30 s /K
72 ℃ 10 min





10 ℃ 10 min
33 times ．
胶回收试剂盒由 takara公司生产的胶回收试剂盒进行胶回收．
pMD18 － T载体和连接酶 Solution I由 TAKAＲA公司生产．连接体系(10 μL)如下所示:
基因片段: 1． 5 μL
T载体: 0． 5 μL
Solution I: 5 μL
ddH2O: 3 μL
2 方 法
2． 1 基因组抽提
采用试剂盒抽提基因组的方法．试剂盒购自康为世纪生物技术公司．
2． 2 表达载体的构建流程
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2． 3 转化入农杆菌
将构建好的表达载体采用热激转化的方法转入农杆菌 GV3101，并对农杆菌菌落进行阳性克隆的筛
选和鉴定．转化方法详见参考文献［8 － 9］．
2． 4 转基因
(1)将鉴定已经转入表达载体的农杆菌 GV3101 阳性克隆划板，且挑取单克隆进行小型摇培
(5 mL) ，继而进行转基因操作．具体转化步骤:
(2)从农杆菌平板上挑取单菌落于 2 mL LB培养基，250 r /min，28℃过夜，OD600 至 0． 6．
(3)洗农杆菌:1 mL菌液:2500 g 离心 10 min，室温，去上清，加入 1 mL 10 mmol /L MgSO4，混匀，
2500 g 离心 10 min，去上清，加入 1 mL 10 mmol /L MgSO4，混匀，加入 2 μL 200 mmol /L As(有利于转化，
也可不加) ，室温静置 2 h．
(4)分装悬浮培养的烟草 BY2 细胞 5 mL于小培养皿中(一般 1 个基因做 2 个，1 个空白对照) ，用
移液器吹打 20 次，诱导缺口，有利于转化．
(5)加入 100 μL 处理好的农杆菌，轻轻摇匀，对照加入 100 lL ddH2O．
(6)28℃静置暗培养 48 h．
(7)每个培养皿中加入 5 mL BY2 液体培养基轻轻摇匀．
(8)转入 50 mL EP管，用 BY2 液体培养基补到总体积 25 mL．
(9)1000 g离心 5 min，室温．
(10)小心倒去上清，均匀倒在含有潮霉素的 BY2 固体培养基平板．
(11)28℃静置培养 3 周．
2． 5 阳性克隆细胞团的筛选
转基因 BY2 细胞转化后约 3 周可在 50 μg /mL的潮霉素和万古霉素抗性平板上长出阳性单克隆的
细胞团，潮霉素起到筛选阳性克隆的作用，万古霉素起抑制农杆菌的生长，并将所筛选到的阳性单克隆
细胞团移出至新的 50 μg /mL的潮霉素抗性平板传接一代，再接至液体培养基培养传代，如图 1 所示:
图 1 转化后的 BY2 细胞传代
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3 结 果
3． 1 HSP70 启动子克隆
从拟南芥基因组中 PCＲ 扩增 HSP70 启动子(图 2)和 HSP70 启动子与 T － 载体连接后的酶切
(图 3)鉴定电泳图．
1:HSP70 启动子 PCＲ扩增产物 M:分子 marker
图 2 PCＲ 扩增 HSP70 启动子
1:T － HSP70 阳性克隆质粒样品酶切 M:分子 marker
图 3 HSP70 启动子与 T －载体连接后酶切鉴定
将 HSP70 启动子测序结果与 NCBI网站的原始序列进行比对，测序结果和原始序列完全匹配，无缺
失、错配等．
HSP70 启动子序列如图 4 所示．
图 4 HSP70 启动子序列
3． 2 表达载体的鉴定
将构建好的表达载体阳性克隆抽提质粒并进行酶切鉴定．对 HSP70 启动子采用 HindⅢ和 SacI进行
双酶切鉴定(图 5) ，对 GFP采用 BamHI和 Sal I进行双酶切鉴定(图 6) ，并用 HindⅢ和 SalI进行双酶切
切出 HSP70 启动子加 GFP片段(图 7) ，分别切出 1． 5 kb条带，750 bp条带，2． 25 kb条带以及剩余的载
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体条带．酶切鉴定结果如图 7．
3． 3 转基因 BY2 细胞鉴定
对筛选到的阳性细胞团基因组进行 PCＲ鉴定，PCＲ扩增条带包括 GFP及 HSP70 启动子部分片段，
长度约为 550bp，抗性平板共筛选到 11 个阳性细胞团，PCＲ鉴定结果如图 8．
1:p1300 － HSP70:GFP阳性克隆质粒样品酶切 M:分子 marker
图 5 HSP70 启动子酶切鉴定
1:p1300 － HSP70:GFP阳性克隆质粒酶切 M:分子 marker
图 6 GFP酶切鉴定
1:p1300 － HSP70:GFP阳性克隆
质粒酶切 M:分子 marker
图 7 HSP70 启动子和 GFP酶切鉴定
－:以非转基因 BY2 细胞基因组为模板 +:以 p1300 － HSP70:GFP
质粒为模板 M:分子量标记 1 ～ 10:分别以 1 ～ 10 号 p1300 － HSP70:
GFP转基因 BY2 细胞基因组 DNA为模板
图 8 转基因细胞 PCＲ鉴定
3． 4 荧光观察
通过采用激光共聚焦荧光显微镜对转基因和非转基因即野生型(WT)BY2 细胞的荧光观察发现，
野生型即非转基因 BY2 细胞有极其微弱的自发荧光，几乎看不到，但转基因 BY2 细胞的荧光要远远强
于野生型 BY2 细胞(图 9)．同时对野生型和荧光强度进行定量(图 10)． ＲT － PCＲ结果证明野生型 BY2
细胞中并无 GFP的表达，而转基因 BY2 细胞中表达很强(图 11)．
1:非转基因 BY2 细胞;2:转基因 BY2 细胞
图 9 BY2 细胞荧光观察
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Y:纵轴表示相对荧光强度(无量纲) ;X:横轴表示基因型
图 10 荧光定量结果 1:非转基因 BY2 细胞;2:转基因 BY2 细胞
图 11 ＲT － PCＲ结果
4 讨 论
拟南芥的 HSP70 基因启动子是一种热激起动子，对其的研究一直是现代生物学的热点，其表达的
强弱受到受到多方面因素的影响，如外界温度，自身启动子的顺式元件以及反式元件的协同作用［1］．随
着现代分子生物学的发展，实验操作的很多环节均可采用试剂盒来快速完成实验的操作，大大节省了时
间，但是植物种植的时间很难缩短，因此在实验材料的获得上往往会限制实验的进展速度，具体以拟南
芥为例，其生育周期常为 42 ～ 56 d，在生长到 20 d左右时可以转化，收到种子干燥 10 d后才可筛选阳性
苗，在筛选阳性苗的过程中还要经过春化，发苗等过程，在阳性苗生长到可以取材进行时，后续实验还要
生长一段时间［10］，且植株生长周期有限，有幼苗期和衰老时期不可能随时进行取材，但是液体悬浮培养
的 BY2 细胞生命周期短，转接传代操作简单，可随时取材进行观察，省去植物种植的时间，因此将拟南
芥的 HSP70 基因启动子表达 GFP的表达载体转入液体悬浮培养的 BY2 细胞，可在一次转化后大量传
接培养，4 ～ 7 d便可传代培养一次，相比于种植一代植物可节省大量时间，可明显缩短后续实验的周
期，且由于液体悬浮培养的 BY2 细胞繁殖快，可大量传接，因此可以获得大量的实验材料，从而利于对
拟南芥的 HSP70 基因启动子的研究，并对其他基因的研究提供可借鉴的思路．
参考文献:
［1］ CATHEＲINE H U，SIOUYING L，WEN T，et al． Ｒecent gene duplication and subfunctionalization produced a mitochondrial
grpE，the nucleotide exchange factor of the Hsp70 complex，specialized in thermotolerance to chronic heat stress in
arabidopsis［J］． Plant Physiology，2012，158:747 －758．
［2］ WU Y Y，MATTHEW W，SOPHIE B，et al． Functional identification of two nonredundant arabidopsis (1，2)
fucosyltransferases specific to arabinogalactan proteins［J］． The Journal of Biological Chemistry，2010，285(18):13638
－13645．
［3］ CHANHUI L，ZHONG Ｒ Q，YE Z H． Arabi dopsis family GT43 members are xylan xylosyltransferases required for the
elongation of the xylan backbone［J］． Plant Cell Physiol，2012，53(1):135 － 143．
［4］ KATO K，MATSUMOTO T，KOIWAI S，et al． Liquid suspension culture of tobaco cells［M］/ /TEＲUI G． Ferment
Technology Today． Osaka:Society of Fermentation Technology，1972:689 － 695．
［5］ XIN G，GNTHEＲ B，PETEＲ N． The cytoskeleton is disrupted by the bacterial effector HrpZ，but not by the bacterial
PAMP flg22，in tobacco BY － 2 cells［J］． Journal of Experimental Botany，2013，64(7):1805 － 1816．
［6］ 赵术珍，毕玉平．拟南芥室内繁种技术的改进［J］．山东农业科学，2011，3:50 － 51．
［7］ 吴科瀛，梁玉玲．烟草 BY2 细胞培养及盐胁迫研究［J］．畜牧与饲料科学，2009，30(4):8 － 9．
761
上海师范大学学报(自然科学版) 2013 年
［8］ 萨姆布鲁克 J，拉塞尔 D W．分子克隆实验指南(上下册)［M］．黄培堂，译．北京:科学出版社，2005．
［9］ 张好富，张宪银．一种不依赖于无菌培养的拟南芥活体转基因种子筛选方法［J］．浙江大学学报:农业与生命科学
版，2009，35(4):372 － 376．
［10］ 刘守伟，刘士勇．拟南芥室内培养技术研究［J］．东北农业大学学报，2007，38(2):279 － 281．
Construction of the expression vector HSP70 gene promoter in
Arabidopsis thaliana and application in tobacco BY2 cell
ZHENG Bang，CHEN Yan，CHU Yanxia，SUN Hulin，ZHENG Yajie，
SUN Hengji，SI Yingyu，ZHOU Shumin，ZHANG Wei*
(School of Life Science，Shanghai University，Shanghai 200444，China)
Abstract:To investigate the expression and application of the HSP70 gene of arabidopsis in liquid suspension culture of BY2 cell
in tobacco，using the method of PCＲ to amplificate genome from arabidopsis thaliana col ecotype，HSP70 gene promoter sequence，
to be connected to p1300 and expression vector with GFP as report gene． The expression vector is using agrobacterium-mediated
transgenic tobacco BY2 into liquid suspension culture cells to observe the expression of GFP report gene in transgenic cells．
Ｒesults:HSP70:GFP transgenic tobacco BY2 of liquid suspension culture cells contains GFP． Conclusion:the expression vector
can be normal expressed in liquid suspension culture of BY2 cell． And a large number of experimental materials can be obtained
in a relatively short time． HSP70 gene promoter of arabidopsis thaliana provide the oretical basis for further research and abundant
experimental materials and obviously shorten the experimental period．
Key words:arabidopsis thaliana;HSP70 gene promoter;GFP;Tobacco BY2 cells
( 责任编辑:顾浩然)
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