全 文 ：基因组学与应用生物学，2011年，第 30卷，第 6期，第 682-686页
Genomics and Applied Biology, 2011, Vol.30, No.6, 682-686
基金项目：本研究由国家自然科学基金面上项目(31070217)资助
研究报告
A Letter
Deg2蛋白酶在拟南芥光损伤 D1降解及光保护中的作用
陈娜 1 温泽文 1 胡建成 1 张东远 2*
1草地农业系统国家重点实验室,兰州大学草地农业科技学院,兰州, 730020; 2山东省能源资源重点实验室,中科院青岛生物能源与过程研究
所,青岛, 266101
*通讯作者, zhangdy@qibebt.ac.cn
摘 要 已有研究表明叶绿体内有 200种蛋白酶，然而，多数蛋白酶的作用机制尚不清楚，尤其哪些蛋白酶参
与了 D1蛋白周转。其中 Deg2蛋白酶体外实验证明，其参与了光损伤 D1蛋白的的初步剪切。为了进一步研究
Deg2蛋白酶在植物体内的作用机制，我们筛选了拟南芥Deg2蛋白酶功能缺陷型突变体。在 120 μmol·m-2·s-1
光照生长条件下，deg2突变体与野生型的生长曲线基本一致；在进一步的高光胁迫(1 800 μmol·m-2·s-1)处理及
相同的光胁迫处理条件下，无论林可霉素存在与否，突变体 PSⅡ的最大光化学效率(Fv/Fm)都和野生型没有区
别；利用蛋白免疫印迹实验同样证明了光损伤 D1蛋白的降解速度在 deg2突变体和野生型之间也没有明显区
别。我们认为 Deg2蛋白酶在光抑制情况下对于光损伤 D1蛋白的降解以及 PSⅡ的修复不是必需的。
关键词 拟南芥, Deg2, D1蛋白,降解,光保护
Functional Analysis of Photodamaged D1 Protein Degradation and Photo-
protection of Chloroplast Deg2 Protease in Arabidopsis
Chen Na 1 Wen Zewen 1 Hu Jiancheng 1 Zhang Dongyuan 2*
1 State Key Laboratory of Grassland Farming Systems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou, 730020;
2 Shandong Provincial Key Laboratory of Energy Genetics, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences,
Qingdao, 266101
* Corresponding author, zhangdy@qibebt.ac.cn
DOI: 10.3969/gab.030.000682
Abstract More than 200 proteases in chloroplasts have been reported. However, their possible mechanisms re-
mained largely unknown, especially the proteases involved in the degradation of photodamaged D1 protein. Deg2
protease has been proved that it performed the primary cleavage of the photodamaged D1 protein in vitro and lo-
cated at the stromal side of the chloroplast thylakoid membrane. To further investigate the function of Deg2 in vi-
vo, deg2 mutant of Arabidopsis was isolated, which was lacking the expression of Deg2 protease. Under normal il-
lumination conditions (120 μmol·m-2·s-1), the phenotype of the deg2mutant was similar to wild-type plants. During
the high light treatment (1 800 μmol·m-2·s-1), either in the absence or presence of lincomycin, the maximum pho-
tochemical efficiency of PSⅡ (Fv/Fm) in deg2 mutant was also similar to that in wild-type. Further western blot
analysis showed that the degradation rate of the photodamaged D1 protein in deg2 mutants was also equivalent to
that of in wild-type. In conclusion, our results suggested that Deg2 protease was not necessary for D1 degradation
and photoprotection of photosystemⅡ from photoinhibition.
Keywords Arabidopsis thaliana, Deg2, D1 protein, Degradation, Photoprotection
目前研究认为叶绿体内有 200多种蛋白酶，这
些蛋白酶广泛参与了叶绿体的生物发生和结构维持
(Adam et al., 1996; Andersson and Aro, 1997)。另外一
个重要作用就是其作为分子伴侣参与蛋白质合成、
转运以及定位。植物在生长、发育、繁殖和胁迫等过
程中不可避免地产生大量损伤蛋白以及错误折叠蛋
白等，这类蛋白的清除主要由这些蛋白酶进行降解。
同样，叶绿体蛋白处于不断合成和降解的动态平衡。
在这一过程中，叶绿体内的蛋白酶担负着周转蛋白
的降解以及分子伴侣等功能。已有研究表明，主要的
4类蛋白酶存在于拟南芥叶绿体中，分别为 Clp (ca-
seinolytic protease)蛋白酶、FtsH (filamentation temper-
ature-sensitive H)蛋白酶、Deg (degradation of periplas-
mic proteins)蛋白酶以及 SppA (signal peptide pepti-
dase)蛋白酶。
拟南芥中 Deg蛋白酶家族到目前为止共发现有
16个成员(Deg1~Deg 16) (Huesgen et al., 2005)，其中
已经被证明有 7个定位于叶绿体。Deg蛋白酶属于
不依赖于 ATP的内源肽酶，都含有一个由 Ser-His-
Asp 残基组成的催化三联体。Deg 蛋白酶(命名为
DegP)最早发现于大肠杆菌(Pallen and Wren, 1997)，
它定位于内膜周质侧(Skórko-Glonek et al., 1997)。另
外还有 DegQ和 DegS蛋白酶也被陆续发现。其中拟
南芥 Deg2蛋白酶和原核生物 DegP/Htr蛋白酶具有
较高同源性，同源度为 44%，属于 GTP依赖的蛋白
酶。DegP2蛋白酶在 N端第 1位 ~第 69位氨基酸是
它的转运肽，第 144位 ~第 282位氨基酸是具有蛋
白酶活性的结构域，是胰蛋白酶类型丝氨酸蛋白酶
所特有的结构域，在其第 308位 ~第 373位氨基酸
是一个介导蛋白-蛋白相互作用的65个氨基酸残
基的 PDZ结构域，另外在其 C端第 440位 ~第 450
位有一个疏水结构域(Hauβühl et al., 2001)。
已有研究表明，Deg2定位于类囊体膜基质片层
的基质侧(Hauβühl et al., 2001)。在不同胁迫条件下，
如在高光、热激和冷处理等条件下，其转录水平显著
提高(Sinvany-Villalobo et al., 2004)。体外实验证明，
Deg2蛋白酶参与了 D1损伤蛋白的降解，首先在 D1
蛋白 DE环的第 241位 ~第 245位氨基酸残基处将
D1蛋白剪切为 10 kD和 23 kD两个片断(Hauβühl et
al., 2001)。然而关于其在损伤 D1蛋白的降解中还存
在争议(Hauβühl et al., 2001; Huesgen et al., 2006)。另
外 Luciński等(2011)人也证明了 Deg2蛋白酶参与了
胁迫条件下 Lhcb6蛋白的降解。为了深入解析 Deg2
蛋白酶在拟南芥光抑制过程中的分子作用机制，本
论文通过分子生物学手段获得了 Deg2蛋白酶功能
缺失拟南芥突变体，进一步探讨在光抑制条件下
Deg2蛋白酶对拟南芥 PSⅡ最大光化学效率以及其
反应中心 D1蛋白周转的影响。
1结果分析
1.1 Deg2突变体的筛选与鉴定
为了研究 Deg2蛋白酶在光损伤 PSⅡ反应中心
D1蛋白降解过程中的作用机制，我们从 NASC (not-
tingham arabidopsis stock centre)购买了突变株 N1157-
84。根据数据库提供的 T-DNA插入位点两端引物
LP(5-CAGAGGTACATTCCCCACCTC-3)和RP(5-
TGTGCAGGATAAATGAGAGGG-3)以及T-DNA左
臂特异性序列 LBb1 (5-GCGTGGACCGCTTGCTG
CAACT-3)。通过 PCR筛选出了纯合 deg2突变体。
利用引物 LBb1 和 RP 进行 PCR 扩增，有预期的
426 bp大小的片段证明有 T-DNA插入(图 1A)，进一
步以 LP、RP为引物筛选纯合的突变体，由于 T-DNA
的插入，在突变体中不能检测到目的片段，证明 1
号、3号突变体为纯合体(图 1B)。对涌道 1的产物利
用 3130xl 测序仪进行了测序以及比对分析，确定
T-DNA插入位点在 At2g47940 (Deg2)第 5个外显子
上。对该基因进一步 RT-PCR 分析证实了由于
T-DNA的插入导致了 Deg2基因转录本的完全缺失
(图 1C)。另外由于 deg2突变体中 T-DNA右端是 4个
串联 35S超强启动子，因此有可能导致上下游基因
的表达量变化。我们利用 RT-PCR方法分别检测了
上下游基因的表达量。结果如图 1C所示，上下游基
因的表达没有受到影响。
1.2突变体 deg2的表型
在正常光照(120 μmol·m-2·s-1)培养条件下，deg2
突变体生长速度及其色素含量与野生型相比没有什
么区别(图 2A)。叶面积分析结果显示，突变体的生
长曲线与野生型几乎完全一致(图 2B)，证明 Deg2基
因的缺失没有影响突变体的正常生长。
图 1 deg2突变体分离鉴定
注: A:突变体 T-DNA鉴定; B:突变体纯合体鉴定; C: Deg2及
其上下游基因在野生型和 deg2突变体中的 RT-PCR分析; M:
Marker; WT:野生型对照; 1~3:两株纯合突变体
Figure 1 Identification of the deg2 mutant
Note: A: Identification of the T-DNA insertion; B: Homologues
mutant by PCR; C: RT-PCR analysis of Deg2 gene expression;
M: Marker; WT: Wide type; 1,3: Two homozygous mutants
Deg2蛋白酶在拟南芥光损伤 D1降解及光保护中的作用
Photodamaged D1 Protein Degradation and Photoprotection of Chloroplast Deg2 Protease in Arabidopsis 683
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
1.3强光诱导 deg2突变体的 PSⅡ的光抑制情况
上述结果证实蛋白水解酶 Deg2在正常光照生
长条件下，未对植株造成明显的影响。我们将 deg2
突变体和野生型离体叶片进行高光处理，检测了
deg2突变体和野生型中 PSⅡ的光抑制情况。结果如
图 3A所示，随着光胁迫时间的增加，野生型和 deg2
突变体叶片 Fv/Fm明显下降，且二者下降速度以及
幅度均没有明显区别。加入叶绿体蛋白合成抑制剂
林可霉素后，野生型和 deg2突变体叶片的 Fv/Fm下
降的速率明显加快，同样二者下降水平和趋势也基
本一致。因此得出结论，deg2突变体和野生型对光胁
迫的敏感程度基本一致。
我们进一步利用蛋白免疫印迹实验分析了强光
处理过程中 deg2 突变体 PSⅡ反应中心蛋白 D1 的
周转情况。如图 3B所示，在高光胁迫且加入叶绿体
蛋白合成抑制剂林可霉素条件下，随着处理时间的
延长，光损伤 D1蛋白的降解速度在 deg2突变体和
野生型都明显加快，但二者之间 D1蛋白的降解速度
也没有什么明显差异。作为 PSⅡ中心的 D2蛋白含
量在 deg2突变体和野生型较为稳定，并且在二者互
间差异也不明显(图 3C)。从上述实验我们可以确定
图 2野生型和 deg2突变体植株的表型及生长曲线
注: A:野生型与 deg2突变体生长 5周植株; B:野生型与 deg2
突变体生长曲线
Figure 2 Phenotype and growth rate of WT plants and deg2 mu-
tant
Note: A: Phenotype of 5-weeks-old WT and deg2 mutant; B:
Growth kinetics of deg2 mutants and WT plant
图 3 野生型和 deg2 突变体光抑制条件下 PSⅡ光化学效率
(Fv/Fm)及其反应中心 D1蛋白降解分析
注: A:在高光处理条件下,林可霉素存在与否野生型和 deg2
突变体 PSⅡ光化学效率（Fv/Fm）的变化; B,C:高光处理并且
有林可霉素存在条件下,蛋白免疫印迹分析 PSⅡ中心 D1, D2
含量变化
Figure 3 PSⅡ photochemistry efficiency (Fv/Fm) and degradation
of PSⅡ reaction center D1 protein under high light illumination
Note: A: Analysis of PSⅡ photochemistry efficiency under high
light illumination from the WT and deg2 mutant in the absence or
presence of lincomycin; B,C: Western blotting analysis of D1 and
D2 protein content in WT and deg2 mutant under high light illu-
mination in presence of lincomycin
蛋白水解酶 Deg2在光损伤 D1蛋白的降解中没有起
到重要的作用。
2讨论
近年来，关于植物光合作用研究被越来越多的
学者所重视，尤其是 PSⅡ蛋白复合物稳定及周转。
PSⅡ是光能吸收的第一个复合物并且执行电荷的分
离以及水裂解，因此在高光胁迫条件下 PSⅡ始终
处于损伤及修复的动态平衡之中。光胁迫首先导致
PSⅡ反应中心 D1蛋白受到损伤，进而 PSⅡ反应中
心失活及解体，光损伤的 D1蛋白被被相应的蛋白酶
降解，同时伴随着 D1蛋白从头合成，新合成 D1 蛋
白重新整合到缺少 D1蛋白的 PSⅡ蛋白复合体，从
而恢复成为有活性 PSⅡ复合物(Barber and Anders-
son, 1992; Aro et al., 1993)。通过这种修复过程保持
光胁迫条件下 D1蛋白以及 PSⅡ稳定和周转(Zhang
and Aro, 2002)。
已有研究表明损伤的 D1蛋白在叶绿体中的蛋
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Deg2蛋白酶在拟南芥光损伤 D1降解及光保护中的作用
Photodamaged D1 Protein Degradation and Photoprotection of Chloroplast Deg2 Protease in Arabidopsis
白酶作用下迅速降解。已有研究表明，在拟南芥叶绿
体中主要有 4类蛋白酶家族，并且证实有几种蛋白
酶参与了光损伤 D1蛋白的降解，其中 FtsH2蛋白酶
参与了 D1蛋白的首次剪切(Bailey et al., 2002; Yosh-
ioka et al., 2006)。在 FtsH2蛋白酶的缺失拟南芥 var2
突变体中，高光处理条件下，与野生型相比，突变体
PSⅡ Fv/Fm下降速度明显比野生型快，而且光损伤
D1 蛋白的降解速度受到了明显抑制(Bailey et al.,
2002)。在 Deg蛋白酶家族中，Deg5和 Deg8被证明
参与了损伤 D1蛋白的降解(Sun et al., 2007)。另外体
外实验证明 Deg2蛋白酶也被载体外证明参与了 D1
损伤蛋白的降解，它可以将 D1蛋白裂解为 10 kD
和 23 kD片断。然而关于其在损伤 D1蛋白的降解
体内实验中还存在争议(Hauβühl et al., 2001; Huesgen
et al., 2006)。
本研究利用 Deg2功能缺失突变体深入探讨了
Deg2 蛋白酶对 PSⅡ活性的影响以及在光损伤 D1
降解中的作用。研究结果表明，在正常光照生长条件
下 Deg2蛋白酶的缺失对拟南芥植株的生长基本没
有影响(图 2)。体外实验证明 Deg2蛋白酶可以将 D1
蛋白降解(Hauβühl et al., 2001)，为了在拟南芥体内
验证其对损伤 D1蛋白的降解特性，本研究通过蛋白
免疫印迹实验检测了高光胁迫条件下 D1蛋白的周
转情况。研究结果显示在无论有没有抑制叶绿体蛋
白合成的前提下，光损伤 D1蛋白的降解都没有受到
影响(图 3)。
通过上述实验，证明了 deg2 突变体无论是在
PSⅡ最大光化学效率，还是光损伤 D1蛋白以及 PSⅡ
复合物的周转和野生型都没有明显区别。因此我们
认为 Deg2蛋白酶在光抑制情况下对于拟南芥光损
伤 D1蛋白的降解以及 PSⅡ的修复不是必需的。
3材料与方法
3.1试验材料
野生型拟南芥(Columbia-0)，以及突变体植株由
Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)购得。拟
南芥种子经 4℃下避光放置 24~48 h春化，种植于恒
温培养间，短日照(12 h光照 /12 h黑暗)生长，温度为
22℃，光照强度 120 μmol·m-2·s-1。
植物材料高光处理：取温室中培养 5周的 deg2突
变体与野生型离体叶片浸于水中，在 1800μmol·m-2·s-1
光强进行光抑制处理，在 120 μmol·m-2·s-1光强进行
光恢复实验。为了研究光抑制时叶绿体编码的蛋白
合成情况，将 deg2突变体和野生型离体叶片浸于
1 mmol/L的林可霉素的溶液中，先于光照强度为
20 μmol·m-2·s-1的环境中放置 30 min (对照叶片浸
于水中)，然后再进行高光制处分别 1 h、2 h和 3 h，
分别利用 PAM-2000 测定室温荧光参数并且提取
类囊体膜。
3.2 RT-PCR分析
用 Trizol 法提取的 deg2突变体和野生型 RNA
作为底物，用反转录试剂盒 (TaKaRa)反转录合成
cDNA。然后利用下列特异引物进行 PCR反应检测
deg2 (At2g47940)以及其上下游基因 At2g47930 和
At2g47950的表达情况，选用 actin 基因的表达作为
内标。
deg2-F：5-CTTTTCTCCAGAGTTCCGACA-3；
deg2-R：5-TCAACAAGAAAATGGAGAAG-3；
At2g47930-F：5-GAATCGTCTATCATGCCGA
CAAT-3；
At2g47930-R：5-AGGCACAAAAAACACAC
ACTATC-3；
At2g47950-F：5-GAACACAACCAACAACGT
GTTTG-3；
At2g47950-R：5-GTTGTGCATTAAAAGCCA
AAGGG-3；
actin-F：5-AACTGGGATGATATGGAGAA-3；
actin-R：5-CCTCCAATCCAGACACTGTA-3。
3.3拟南芥生长曲线及 PSⅡ最大光化学效率的测定
从野生型和 deg2 突变体生长至两周开始，
LI-3000C便携式叶面积仪测量其叶面积，每隔 4 d测
量一次。利用 PAM 2000 (pulse amplitude modulated
fluorometer 2000)便携式叶绿素荧光仪按照 Peng等
(2006)方法测定拟南芥光系统Ⅱ最大光合效率 Fv/Fm。
3.4聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印记分析
采用 Laemmli (1970)蛋白分离缓冲液系统进行
SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶浓度为 4%，分离胶浓度
为 15%。利用 Bio-rad蛋白转移装置，在 180 mA下转
膜 1.5 h，将 SDS-PAGE 上蛋白转移到尼龙膜(Hy-
bond-C)上。用 2% BSA封闭液封闭转有蛋白的尼龙
膜 4 h后，之后加入相应蛋白特异性抗体过夜。接着按
1:5 000比例加入羊抗兔的辣根过氧化物酶 HRP抗
体，反应 2~4 h。最后利用超敏化学发光液进行发光以
及 X-ray底片曝光。
685
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
作者贡献
陈娜负责实验研究的执行及写作；温泽文负责试
验结果分析；张东远负责本研究的实验设计。
致谢
感谢山东省能源资源重点实验室提供的研究平
台，感谢课题组全体成员的支持。
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