全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2008,16 (2):292~298
*基金项目：国家自然科学基金项目（No.30470169）资助。
**通讯作者。Authorforcorespondence.副研究员，博士，主要从事植物激素信号转导方面的研究。E-mail:.
收稿日期：2007-06-26 接受日期：2007-10-12
·研究论文·
拟南芥激活标签突变体库的构建及突变体表型的分析*
曹冬梅 1，2**，范喜英 2，王云山 1，康黎芳 1
(1.山西省农业科学院园艺研究所，太原030031；2.中国科学院植物研究所，北京100093）
摘要：激活标签技术(activationtagging)在植物功能基因组学的研究中具有重要的作用。实验以拟南芥(Arabidopsisthaliana)
bzr1-D为材料，用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的转化方法，构建了一个含有50000个独立抗Basta株系的激
活标签突变体库。其中有47个株系有明显的表型改变，包括花期的改变、株型矮小、叶片形状改变、叶柄变长、叶表皮毛消失、
育性降低以及恢复了bzr1-D茎叶处的打折等。并通过TAIL-PCR和NestedPCR的方法得到了若干T-DNA侧翼序列。结果显
示突变体含有1～3个拷贝的T-DNA插入，分别插入到拟南芥的1、4和5号染色体中。
关键词：激活标签技术；拟南芥bzr1-D；表型；T-DNA侧翼序列
中图分类号:S188 文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2008)02-0292-07
ConstructionofanActivationTaggingLibraryofArabidopsis
andMutantPhenotypeAnalysis
CAODong-mei1,2**,FANXi-ying2,WANGYun-shan1,KANGLi-fang1
(1.InstituteofHorticulture,ShanxiAgricultureAcademyofScience,Taiyuan030031,China;
2.InstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Beijing100093,China)
Abstract:Activationtaggingplaysanimportantroleinplantgenomicsstudy.Inthispaper,anactivationtagginglibrary
containingindependent50000Basta-resistantlineswasconstructedbyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationwhich
usedArabidopsisbzr1-Dmutantasmaterials.Amongthesetransformants,47linesshowedobviousphenotypeswhichwerediferent
frombzr1-D,containinglatefloweringtime,dwarf,changedleafshape,longerleafpetiole,trichomelessleaf,sterilityandnokink
betweenstem/leaf.SomeT-DNAflankingsequenceswereobtainedbyTail-PCRandNestedPCR.Resultsshowedthatthemutants
containedonetothreeT-DNAinsertions,andtheinsertionsdistributedinthefirst,fourthandfifthchromosomeofArabidopsis
genome.
Keywords:activationtagging;Arabidopsisbzr1-D;phenotype;T-DNAflankingsequence
拟南芥 (Arabidopsisthaliana)为十字花科
(Crucifereae)拟南芥属一年生草本植物。因其具有基
因组小、重复序列少、生长周期短、易于遗传转化、生
物信息学资源丰富等其它植物无可比拟的优点，从
而被科学家当作模式植物，广泛应用于植物生物学
的各个研究领域。更重要的是，拟南芥基因组的全序
列物理图谱已于2000年12月公布(TheArabidopsis
GenomeInitiative,2000)，是第一个基因组被全部测
序的植物，这一里程碑式的工作必将对植物生物学
的发展产生重大而深远的意义。
功能基因组学是后基因组时代的重要研究内
容。而突变体已被广泛的应用到正向遗传学研究中，
通过对突变体的分析可以了解大量未知序列的功
能，目前人们已经利用T-DNA的插入在拟南芥中
建立了大量的突变体群体，早期的T-DNA标签是
以基因敲除为目的，产生隐性突变，然而对于具有冗
余功能的基因家族却无能为力，因而产生了激活标
签（activationtgging）技术，它能使所插入的标签附
近的基因过量表达而产生显性突变（Hayashietal.,
1992）,显性突变的表型可以在T1代直接观察到，然
而对于显性致死的突变体则很难保留后代。目前利
用激活标签系统已成功地分离到许多表型明显的突
第2期 曹冬梅等:拟南芥激活标签突变体库的构建及突变体表型的分析
变体，Weigeletal.（2000）通过对25000个株系的筛
选确定了23个有明显表型的突变体，其中2个是在
长日照条件下延迟开花的显性突变体 esc-1D和
jaw-1D。Marsch-Martinezetal.（2002）将玉米 En-1
转座子组成的激活标签系统应用于拟南芥中，在8
300个株系中鉴定了31个显性突变体。油菜素内酯
信号途径中，运用激活标签系统发现了 BRS1和
BAK1（Lietal.,2001;Lietal.,2002）。编码生长素合
成过程的1个限速酶YUCCA基因也是用该方法分
离得到的（Bartel,1997）。近年来，利用此系统已将大
量的与植物抗病性、生长发育、代谢以及与环境相互
作用的基因鉴定出来（Lietal.,2002;Borevitzetal.,
2000;Grantetal.,2003;Masakietal.,2005）。
BZR1在BR途径中具有很重要的功能，但是关
于它的研究还有很多的未知。因此本实验用激活标
签载体转化突变体bzr1-D，筛选bzr1-D表型增强或
者减弱的突变体，应该可以获得BR信号转导的新
组分蛋白。目前已经筛选了5万多转基因株系，构建
了拟南芥激活标签突变体库，并对突变体表型进行
了分析，同时对部分突变体T-DNA侧翼序列进行
了扩增。该突变体库的建成将为研究一些重要基因
的功能提供一个技术平台。
1 材料和方法
1.1 材料
本实验所用的实验材料为拟南芥（Arabidopsis
thaliana）bzr1-D，其生态型为Columbia(Col-O)。种子
由美国CarnegieInstitution的王志勇教授提供。
将拟南芥种子吸胀后，置于4℃冰箱中春化2
d，然后播种于含有1/3蛭石的腐质土表面，播后用
塑料薄膜覆盖，在光/暗时间比为16h/8h、室温为
21±1℃的条件下生长，待拟南芥出苗整齐时去除薄
膜培养。待花序长至10cm高时，将花序从基部剪
掉，等花序再次长出并且花蕾旺盛期时进行转化。
本实验所用的激活标签质粒（activationtagging
vector）为pDSK15-11。该激活标签质粒在T-DNA
右边界含有4个串联的CaMV35S增强子序列，一
个bar基因可用于后代抗Basta筛选。质粒在大肠杆
菌(Escherichiacoli)中的选择标记为羧苄青霉素和
庆大霉素抗性。所用农杆菌(Agrobacteriumtumefa-
ciens)菌株为GV3101-P。实验中所用的限制性内切
酶、TaqDNA聚合酶、常用试剂和药品均购自Sig-
ma、Promega等公司或国产分析纯。引物由上海生工
生物工程公司合成。测序由北京华大中生科技发展
有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1拟南芥的转化和筛选 参照 Bechtoldetal.
（1993）的方法进行。挑含有pDSK15-11的农杆菌单
菌落于YEP液体培养基中，28℃，200r/min下振荡
培养过夜；按1:50的比例转接到新鲜的含抗生素
的YEP液体培养基中扩大培养至对数生长期(菌液
OD600约为1.5)；5000g离心10min，弃上清。将沉
淀重新悬浮于渗透培养基，组成为含 5%蔗糖和
0.02%SilwetL-77(表面活性剂)的1/2MS液体培养
基，调OD600=0.8。
拟南芥转化方法采用的是 floraldip方法
(CloughandBent,1998)。将拟南芥培养钵倒置于装
有渗透缓冲液的容器上，浸透1~2min，取出培养钵
置于托盘中，用保鲜膜覆盖1d，以利农杆菌侵染转
化。5d后按上述方法重复转化1次。拟南芥转化之
后，按照正常的生长条件培养，待其拟南芥所有的角
果完全枯黄、开裂时，即可收获种子。筛选拟南芥时，
播种密度要大一些。待真叶长到2~4片时，喷施除
草剂Basta(商品名为FinaleR，有效成份为5.78%
glufosinate-ammonium)，筛选对除草剂有抗性的转
化植株，每3~5d喷施1次，连续喷3次，将表型有
明显变化的转化植株拍照，并单株采收，其余的转化
植株单株采收，或30株为1组，每组的植株分别混
合采收。
1.2.2 TAIL-PCR 参照 Liuetal.（1995）的方法。
TAIL-PCR的3个特异性引物：
DSKLB1：CGACAGTGGTCCCAAAGATGG；
DSKLB2：GGACGTGAATGTAGACACGTCGAAA；
DSKLB3：AACGCTGCGGACATCTACA。
13个简并引物：
AD1：NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT；
AD2：NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GT；
AD3：(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA；
AD4：AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG；
AD5：TC(G/C)TNAG(T/A)ACNT(A/T)GGA；
AD6：NACGT(G/C)A(A/T)T(G/C)CNAGA；
AD7：NTCGA(G/C)T(A/T)TNG(A/T)GAA；
AD8：NTCGT(G/C)(A/T)GANA(A/T)GTT；
AD9：NCAGCT(G/C)(A/T)CTNT(A/T)GA；
AD10：NCTCGT(G/C)(A/T)GANT(A/T)GA；
AD11：NGTCGA(G/C)(A/T)CANT(A/T)CTA；
AD12：NGTCGACGA(G/C)(A/T)CTNA(A/T)CAA；
AD13：AG(A/T)CANG(A/T)TNCA(A/T)GAA。
第1轮PCR反应程序：92℃3min;95℃30s;
(94℃10s;62℃1min;72℃2min)4个循环；94℃
293
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
10s;25℃2min;72℃2min;(94℃10s;65℃1
min;72℃ 2min;94℃ 10s;65℃ 1min;72℃ 2
min;94℃ 10s;44℃ 1min;72℃ 2min)14个循
环；72℃5min。将第1轮的产物稀释50倍后取1
μL为模板进行第2轮扩增，扩增条件为：(94℃10
s;65℃1min;72℃2min;94℃10s;65℃1min;
72℃2min;94℃10s;45℃1min;72℃2min)12
个循环;72℃5min。以第2轮的产物稀释10倍后
取 1μL为模板，扩增条件为 (94℃ 10s;45℃ 1
min;72℃ 2min)19个循环;72℃ 7min。前两轮
PCR的反应体系均为20μL，第3轮的反应体系为
50μL。
1.2.3 NestedPCR 参照 JoeEckersLabProtocol
（htp:/signal.salk.edu/T-DNArecovery.pdf） 略加改
动。所用的引物:
AP1:AGATGGTGCACGATGCACAGTTGAAGTGACGATG
TCAGGAGGGCTGGT；
AP2:AGATGGTGCACGATGCACAG；
AP4:ACAGTTGAAGTGACGATGTCAGG；
APH:AGCTACCAGCCC；
APB:GATCACCAGCCC；
APE:AATTACCAGCCC；
DSKLB1：CGACAGTGGTCCCAAAGATGG；
DSKLB2：GGACGTGAATGTAGACACGTCGAAA。
步骤：①取100ngDNA酶切，分别用HindⅢ、
BamHⅠ+BglⅡ和 EcoRⅠ内切酶酶切；②加接头
AP1+APH(HindⅢ酶切产物),或AP1+APB(BamH
ⅠandBglⅡ酶切产物),或AP1+APE (EcoRⅠ酶切
产物)和T4连接酶，16℃过夜；③纯化连接产物，取
2μL产物作摸板进行PCR，1轮PCR产物稀释100
倍后取1μL进行第2轮PCR。第1轮PCR所用的
引物是DSKLB1和AP2，第2轮PCR所用的引物
是DSKLB2和AP4。第1轮PCR程序：95℃变性5
min，94℃,20s,70℃,30s,72℃,2min，5个循环，
94℃，20s，62℃,30s,72℃,2min，25个循环后，
72℃延伸 10min。第 2轮 PCR程序：94℃ 30s，
62℃30s，72℃2min。30~40个循环后，72℃延伸
10min；④第2轮PCR产物直接测序或连接到T-
载体后测序。
2 结果
2.1 拟南芥bzr1-D的转化
自2004年5月至2006年10月，运用激活标签
系统对大约5000株拟南芥bzr1-D进行了转化。当
拟南芥的主枝开始现蕾时，打顶以促进侧枝生长。农
杆菌转化前1d去掉已结实的种荚，同时发现1周
后开花的花蕾转化效率最高。共得到抗Basta的抗
性植株约50000株，受环境及人为因素的影响，不
同批次间的转化效率有明显的区别，最高达2%左
右。在转化植株筛选的过程中还发现，在苗期2~4
片真叶时开始喷Basta效果较好，每隔3d喷1次，
共喷3次，如果在幼苗长到相互之间特别拥挤的时
候再喷Basta，会出现非转化植株也不死的现象。筛
选所用的最适Basta浓度为0.43%。
2.2 激活标签突变株系表型分析
由于本实验所采用的是激活标签系统得到的突
变体库，属于功能获得型突变体，可以直接对T1代
进行表型分析，此外，激活标签也可能造成T-DNA
插入突变，即缺失型突变，所以对部分突变体T2代
也进行了分析。所得的突变体（图1）主要是直观可
见的植株形态的改变，包括株型、株高、叶形、育性
等。概括为以下几类：
①花期改变,如突变体B6的花期比bzr1-D的
花期推后 15d左右，B38的花期推后 10d左右，
B26的花期推后1周左右，B16的花期推后约30d。
②株型变小,在本实验中发现了若干个株型矮小的
突变体，但除了矮小之外，各个突变体还有其它的表
型。如B21叶片深绿，叶圆叶柄短，株型紧凑，生育
期较长；B13叶片小，株高不足10cm，育性降低；
B47叶片皱缩紧凑，营养生长期较长；B26叶色深
绿，开花较晚。③叶片形状改变，这一类突变体比较
多，但是不同突变体的表型又是千差万别。较对照相
比，B10叶片宽，叶多，叶柄也短；B47叶片表面凸凹
不平，叶缘向下翻卷但两边向上折，株型小，开花晚；
B15叶片宽大，叶缘缺刻变深；B38叶面皱缩，叶缘
及叶两侧没有翻卷的现象；B20莲座叶和茎生叶都
变得肥大；B30叶片向上卷成筒状。④叶柄变长，在
诸多的突变体中，发现了1个叶柄明显变长的突变
体（B16），而且育性大大地降低。⑤叶表皮毛缺失，
B11是一个叶片没有表皮毛的突变体，茎上表皮毛
也明显地减少。⑥恢复了bzr1-D茎叶处打折，本实
验所用于转化的拟南芥材料是bzr1-D，是BR信号
转导途径中的一个显性突变体，其明显特征是茎叶
连接处有打弯的现象，而突变体B20和B26抑制了
bzr1-D茎叶连接处打弯的表型，将其恢复到野生型
的状态，由此推测B20和B26可能和BR信号转导
途径有关。⑦育性降低，如突变体B13、B16、B26
等。
2.3 T-DNA侧翼序列的扩增和分析
为了对引起突变表型基因的功能进行分析，对
294
第2期 曹冬梅等:拟南芥激活标签突变体库的构建及突变体表型的分析
图1.部分T1代转化植株的表型
Fig.1.DiferentphenotypesofsomeT1transformants
B6.晚花;B10.莲座叶宽,叶柄短,叶数多;B11.叶和茎无表皮毛;B13,植株矮小,不育;B15.莲座叶大;B16.叶柄长,不育,晚花;B20.莲座叶和茎生
叶大;B21.植株特别矮小,叶小,几乎看不到叶柄;B26.茎生叶和茎之间没有打弯的现象,而这一特点是突变体bzr1-D的表型;B30.叶片向上卷
曲;B38.莲座叶皱缩;B47.叶小且卷曲。.
B6.Lateflowering;B10.Widerroseteleaves,shortpetiolesandmoreleaves;B11.Trichomelessleavesandstem;B13.Dwarf,sterile;B15.Bigrosete
leaves;B16.Longerpetiole,sterilityandlateflowering;B20.Bigroseteandcaulineleaves;B21.Extremelydwarf,smalleavesandnodominant
petiole;B26.Nokinkbetweencaulineleafandstem,whichexistsinbzr1-D;B30.Ingrowthontheadaxialsurface;B38.Curledroseteleaves;
B47.Smalandcurledroseteleaves.
295
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
3 讨论
3.1 激活标签法的利用
突变体在植物功能基因组学研究中具有不可替
代的作用，这种方法在拟南芥（Weigeletal.,2000）、
水稻(Jeonetal.,2000)中都已有了成功的应用.激活
标记技术是构建功能获得型突变体库的有效方法，
目前该方法在拟南芥突变体研究中取得了很大进展
（Weigeletal.,2000;Nakazawaetal.,2003），本实验
利用该法，以拟南芥bzr1-D为受体材料，获得了
50000个抗除草剂的T1代T-DNA插入标签系，对
表型明显的株系进行了表型分析，并利NestedPCR
和TailPCR法得到了部分T-DNA插入位点侧翼的
拟南芥基因组序列，这将有利于后代的遗传分析以
及引起表型改变的基因的克隆。
3.2 拟南芥激活标签突变体库的评估
在拟南芥T1代的转化植株中，绝大多数没有显
著的形态变化，约有千分之一的株系在植株的株型、
株高、叶形以及育性等方面表现出与对照明显不同
的表型，主要包括矮化、叶形态改变和不育等，在本
实验中仅仅发现了将近40个表型明显改变的突变
体，这可能是由于并非所有的在增强子作用范围内
的基因都被增强表达的结果（Jeongetal.,2002），也
可能是植物基因组内存在自我保护机制，有些基因
在特殊的调节分布区以外存在绝缘因子，用来防止
其它调节因子错误调控造成的（OkiandKamakaka,
2002）。另外，Jeongetal.(2002)的研究证实增强子只
是增强内源表达，而不改变基因的表达模式，如果激
表1部分侧翼序列在拟南芥基因组中的比对分析
Table1BlastanalysisofpartialflankingsequencesinArabidopsisgenome
突变系列编号 侧翼序列扩增方法 染色体 BlastN结果BlastNresults
No.ofmutantlines Methodofamplifying No.ofchromosome 分数 E值 相关性/%
flankingsequences Score E-value Identity
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B14
B15
B16
B20
B26
B30
B38
B47
Tail-PCR
NestedPCR
NestedPCR
Tail-PCR
NestedPCR
Tail-PCR
Tail-PCR
Tail-PCR
Tail-PCR
NestedPCR
NestedPCR
Tail-PCR
Tail-PCR
NestedPCR
Tail-PCR
NestedPCR
Tail-PCR
Tail-PCR
Tail-PCR
4
5
5
4
4
4
5
5
5
1
1
1
4
1
4
1
1
1
5
410
740
357
345
1181
751
559
894
580
690
405
291
155
617
753
137
821
459
924
5e-113
0.0
2e-97
1e-93
0.0
0.0
5e-158
0.0
4e-164
0.0
1e-111
3e-77
3e-36
3e-175
0.0
5e-31
0.0
3e-128
0.0
100
97
100
93
99
99
98
99
95
97
94
100
100
98
100
93
89
99
100
几个表型明显的突变体进行T-DNA侧翼序列的扩
增。本实验选择了16个突变体作为材料进行侧翼序
列的扩增。通过对质粒拯救法、NestedPCR法和
Tail-PCR法比较后发现，Tail-PCR和 NestedPCR
是两种比较有效的方法，本实验均采用这两种方法。
将获得的PCR产物直接进行测序，测序结果在htp:
/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST和 www.arabidopsis.
org比对，表1列出了所得到的侧翼序列的信息。从
表1可以看出，有的突变体含有1个T-DNA插入，
有的突变体含有2个T-DNA插入，有的含有3个
拷贝的T-DNA，而且分析的几个T-DNA分别插入
到拟南芥的1、4和5号染色体中，在19个侧翼序列
分析中发现，有14个T-DNA是插在2个基因的中
间，有5个是插在1个基因的内部。
296
第2期 曹冬梅等:拟南芥激活标签突变体库的构建及突变体表型的分析
参 考 文 献
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活标签插入到完全不表达基因、正常情况下不表达
的基因附近，将不能检测到增强表达；或者插到某些
不易被检测到的特殊位置表达的基因附近，也会对
检测带来影响。所以在那些没有检测到增强表达的
株系里，未必增强表达就一定没有或不会发生，它可
能已经发生在某些没有被检测到的组织中，也有可
能在某些特定的生长条件下发生。
本实验所构建的激活标签突变体库只有50000
个独立转化株系，这远远没有达到一个饱和突变体
库的要求，Krysanetal.(1999）通过研究发现，拟南芥
T-DNA突变体库的大小取决于3个因素：基因的大
小、基因组的大小以及 T-DNA标签的数目。
Azpirozetal.(1997）研究表明T-DNA在拟南芥基因
组中是随机分布的，如果以每个转化植株中平均含
有1.5个T-DNA标签计算，则一个饱和的突变体库
需要产生80000个独立的转化株系，但由于实验条
件的限制，本实验未取得理想的数目，这也是导致没
有更多的T1代表型改变的原因所在。
3.3 T-DNA侧翼序列扩增方法探讨
T-DNA侧翼序列的分析是进一步研究引起突
变表型基因功能的基础，也已成为目前研究大量未
知功能基因的主要方法之一。目前已经发展了一些
基于PCR技术的侧翼序列分析方法，有质粒拯救方
法(Rommenetal.,1992)、反向PCR(inverseorinvert-
edPCR，IPCR)法（Ochmanetal.,1988）、Tail-PCR（Li-
uetal.,1995）、和 NestedPCR(JoeEckerslabproto-
col)等。
Tail-PCR是一种较为成熟的扩增T-DNA插入
旁邻序列的技术(Liuetal.,1995)。它有许多优点:所
需要的DNA模板量很少，且对DNA的纯度要求不
高，在PCR扩增前不需要任何特殊的DNA操作(如
限制性酶切、酶连等)，PCR产物可以直接用于测序。
但Tail-PCR方法也有缺陷，如整个Tail-PCR需要
一系列连续的反应，反应条件的设置要求比较精细，
不是每每次反应都有阳性结果，且需要的组合比较
多等。本实验利用该法得到了12个侧翼序列，为了
增加产物的特异性，每次都进行3轮PCR扩增。本
实验所用的兼并引物有13条，这样最后经常会得到
若干个PCR产物，选择条带大小不同的产物直接测
序，根据测序的结果不仅可以得到T-DNA的侧翼
序列，还可以大体预测T-DNA有多少个拷贝插入，
这样也有利于突变体的后代遗传分析。
NestedPCR是本实验所用的另一种扩增侧翼
序列的方法，它是将基因组DNA用限制性内切酶
酶切，之后加入人工合成的一个长接头和一个短接
头，然后分别利用T-DNA载体上的一个引物和接
头上的一段引物两轮嵌套式扩增，所得PCR产物直
接测序。本实验利用该法得到了7个侧翼序列，该方
法的成功率比较大，但操作烦琐，如果想得到多个
PCR产物，必须用不同的酶去酶切，加入的接头也
不同。质粒拯救法和IPCR法也是直接和有效的方
法，但是二者均存在操作复杂，工作量大，非特异性
扩增率较高的缺点。前期实验表明它们的失败率比
较高，所以本实验未采用。
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农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
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