全 文 ：生物物理学报 第十八卷 第二期 二★★二年六月
ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.18 No.2 Jun.2002
拟南芥(Arabidopsis thal iana)是十字花科野
生小草 ,自交 、杂交均可育 。20世纪 60-70年代 ,对
拟南芥的化学和辐射育种开始大规模进行 , 根据上
百个突变体及非整倍体分析绘制的遗传连锁图谱表
明 , 5个连锁群遗传图距总和为 437 cM [ 1] 。80年代
后 , 植株小 、生育期短 、结籽多 、基因组简单(二倍
体约 70000 kb[ 2])、 变异丰富的拟南芥成为发育和
遗传学研究的模式物种。从拟南芥研究中揭示的代
谢缺陷 、 抗性突变和发育控制等基因 , 为植物的形
态发生 、生长调节研究和遗传改良奠定了基础[3 ] 。
自 1986年起 ,低能离子注入开始应用于作物品
种改良[4 ,5 ] 。低能离子的能量为 30-180 keV ,具有
轻损伤 、高突变率 、突变广谱 、安全性强等特点。近
年来 ,在甜菊[ 6] 、棉花[ 7] 、西红柿[ 8] 、水稻[ 9]等的离子
诱变中 ,产生了包括染色体行为异常 、结构变异等在
内的突变效应 ,提高了作物产量[6 ] ,或获得了早熟大
果[ 8] 。1990年 , RAPD 技术用于遗传研究获得了有
用的分子标记 [10 , 11] , 基因组 DNA 多态性的检测得
以快速 、 有效地进行 [ 12] , 甜菊 [ 13] 、 烟草 [ 14] 等离子
注入后引起植物变异的研究已经陆续报道。本研究
选取模式物种拟南芥 , 应用 RAPD技术分析低能
N
+离子(以 C+作为对比)注入的诱变效应。这将是
离子诱变技术应用到更多作物遗传改良的理论和应
用基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
将拟南芥干种子(胚的取向随机)用胶水粘贴在
铅箔上 ,面积为 4 cm2 ;自然干燥后置入离子注入机
(北京师范大学低能核物理研究所)靶室中进行离子
注入。靶室真空度优于 1×10-3 -2×10-3 Pa 。束流
保持在 10 μA以下 , 以控制注入时的温度(使样品
表面温度为室温)。 对照使用同批干种子 , 也用胶
水粘贴在铅箔上 , 其他设置状态除不进行离子注入
外 , 也均与注入组相同 。对照及各剂量种子数为
800-1000粒;每剂量中用不同株的种子同时注入 ,
但每株每剂量均设 1/2数目的对照。发芽指标数据
统计来自全部实验结果的总体计算。本研究注入离
子的种类是 N +、 C+ , 注入能量为 1.60×10-14 J ,
剂量为 1×1013 、 5×1013 、 1×1014 、 5×1014 、 1×
10
15 、 5×1015 、 1×1016 、 5×1016 ions/cm2 。
1.2 发芽指数(germination indices)检测
将未处理对照种子和离子注入种子置于培养皿
内湿润的双层滤纸上 , 先在 4℃冰箱中春化 3天 ,然
收稿日期:2001-10-29
基金项目:国家自然科学基金重大项目资助课题(19890300)
作者简介:梁前进 , 1963年生 ,副教授 ,博士 ,电话:(010)62207720,
E-mail:cenpg@95777.com.
通讯作者:张根发
拟南芥(Arabidopsis thaliana)氮 、碳离子注入
诱变效应分析
梁前进 , 胡玉连 , 张根发
(北京师范大学生命科学学院 , 北京 100088)
摘要:采用 N +、 C +离子注入拟南芥 (Arabidopsis tha liana)种子 , 统计了种子的发芽指数 (发芽率和发芽
势);用改良的 RAPD技术对 N +离子注入种子植株的 DNA 进行 11个引物的随机片段多态性扩增 。结果表明 ,合适
剂量的 N +、 C +离子注入可使种子发芽率提高 , 两种离子注入种子的发芽率峰值 (分别为 92.3%和 74.4%)都在
5×1014 ions/cm2;分析 N +离子注入材料发现 , 在 1×1013 -1×1016 ions/cm2 剂量范围内 , 基因组 DNA 的变异率
与发芽指数的变化趋势基本一致 ,变异率峰值(9.0%)在 1×1015 ions/cm2 。 结果提示 ,分析低能 N +离子诱变效应
的最佳注入剂量在 1×1014 -5×1015 ions/cm2 。 对 N +、C +离子注入的比较发现 , 一定范围内同等剂量 C +离子注
入的诱变率高于 N +离子注入 。
关键词:低能离子注入;拟南芥;离子诱变
中图分类号:Q345 文献标识码:A 文章编号:1000-6737(2002)02-0251-05
生 物 物 理 学 报252 2002年
Table 1 Primers used in RAPD and their sequences
Primers Sequences
OP A 7 GAAACGGGTG
OP E14 TGCGGCTGAG
OP F15 CCAGTACTCC
OP F20 GGTCTAGAGC
OP G 02 GGCACTGAGG
OP H08 GAAACACCCC
OP J06 TCGT TCCGCA
OP K15 CTCCTGCCAA
OP K19 CACAGGCGGA
OP R10 CCA TTCCCCA
OP R15 GGACAACGAG
后在 25℃左右的温室中培养。从第 4天开始统计发
芽指数[包括发芽率(germination percentage)和发
芽势(germina tion impetus)] ,每日一次 ,至第 12日
结束 。发芽指数计算方法:
发芽率 (%)=发芽终期全部正常发芽的种子数全部实验种子数 ×100
发芽势 (%)=第四日正常发芽的种子数全部实验种子数 ×100
1.3 DNA样品准备
待植株长至刚抽薹时取其叶子 ,采用高低盐 pH
值方法 [ 15] 提取基因组 DNA , 经 0.8%琼脂糖电泳 ,
结果表明提取的 DNA具有较好的完整性。经 DU-
640分光光度计检测 A260/A280约 1.8。
1.4 RAPD分析及诱变率检测
对于每个处理剂量 , 选取 5个单株基因组的
DNA , 用 Ope ron公司提供的 11个引物(表 1)进行
随机片段的多态性扩增。
根据 Wolf f[ 16] 、 Yoshida[ 17] 的报道 , PCR的
反应体系为 : dN TPs 200 μmol/L , MgCl2
2.0 mmol/L ,模板 DNA 20 ng ,引物 0.3 μmol/L ,
Taq酶 0.04 U/μL。根据 Yu等[ 18]的修改程序 ,采
取如下反应过程:94℃ 5 m in;94℃ 1 m in;35℃
30 s;40℃ 30 s;45℃ 30 s;72℃ 2 min (5个
循环);94℃ 30 s;35℃ 45 s;40℃ 45 s;45℃
45 s;72℃ 2 min(40个循环);72℃ 10 m in。
PCR产物经 1.4%琼脂糖凝胶电泳分离 、溴化
乙锭(EB)染色后 , 经数字化凝胶成像分析仪(天津
帝格科技公司)扫描 、分析 , 统计数据。诱变率的计
算:
变异率=实验组与对照组差异条带总条带数
2 结 果
2.1 发芽指标分析
结果见表 2。N +处理的 8个剂量中 ,峰值出现在
中间剂量 ,在 1×1014 和 5×1014 ions/cm2 两个剂量
发芽率 (分别达 76.7%和 92.3%)明显高于对照
(10.0%和 25.6%), 其余均低于对照;C+处理的三
个剂量中 , 剂量为 5×1014 io ns/ cm2 时 , 发芽率
(74.4%)明显高于对照(7.7%),其余剂量都低于对
照 。
因此 , 各剂量处理对种子的发芽率都产生了一
定的影响;合适的离子注入剂量可以促进种子的发
芽率。
根据公式 , 可知发芽势反映了种子第一天发芽
的比例。由表 2可知 , 除了 N + 离子注入 5×1014
io ns/cm2剂量(发芽势提高了 15.7%)外 ,其余各种
处理的发芽势均明显低于对照。说明各种剂量处理
可能都对种子产生了一定的损伤 , 从而影响了种子
的发芽速度 , 但合适剂量的离子注入也可以保持一
定大小的发芽势 。
2.2 N+离子注入诱变率检测
RAPD扩增共用引物 11种 ,其中 4种引物(OP
H08 , OP K15 , OP J6 , OP J11)扩增出差异片
段 。图 1是 N +离子注入材料以引物 OP H08扩增
的 RAPD结果;图 2是 C+离子注入材料以引物 OP
H08扩增的结果 ,作为对比。图中显示了 3个离子剂
量部分植株的电泳结果 。扩增差异及条带分子质量
见表 3。
Table 2 Germina tion indices o f the seeds
implanted wit h N
+ and C + ions
doses
(ions/cm2)
germination
percentages(%)
germination
impetuses(%)
contro l ——— 66.67 38.09
C
+
1×1013 62.16 18.92
5×1014 74.42 27.91
5×1015 50.00 16.67
N + 1×1013 62.07 31.03
5×1013 66.04 28.30
1×1014 76.67 30.00
5×1014 92.31 53.85
1×1015 63.89 25.00
5×1015 53.33 20.00
1×1016 62.86 28.51
5×1016 63.41 24.39
第 2期 253神经科学与百年诺贝尔奖
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Fig.2 OP H08 primer amplification im age of
the plants g row n f rom low energy C
+
ion im-
planted seeds.1:contro l 2-4:1×1013 ions/cm2 ;
5-8:1×1016 ions/cm2;9-12:5×1016 ions/cm2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Fig.1 OP H08 pr imer amplification image o f the
plants g row n f rom low energy N
+
ion implanted
seeds.1:contro l 2-4:1×1013 ions/cm2;5-8:1×
1016 ions/cm2 ;9-12:5×1016 ions/cm2
Low energy N
+ ions N + (Fig.1) C + (Fig .2)
electrophore tic lanes of
the experiment g roup
4-8 9-10 9-10 9-10 3-10 2-12 2-10 , 12 11-12
molecular w eigh ts o f the
fragments
1800 1300 1100 350 1800 850 600 450
con trol - - - - + - - +
the experiment g roup + + + + - + + -
Table 3 Diffe rences of OP H 08 primer amplifica tion and the molecula r
w eights o f the amplifica tion bands
Doses
(ions/cm2)
Total
numbers
o f bands
Numbers o f
dif ferent
bands
Muta tion
percentages
(%)
1×1013 278 5 1.8
5×1013 281 13 4.6
1×1014 275 18 6.5
5×1014 267 21 7.8
1×1015 255 23 9.0
5×1015 278 24 8.6
1×1016 283 19 6.7
5×1016 270 113 41.9
Table 4 Tests of the mu tagene tic percentages
caused by N
+
ion implantation
根据 RAPD分析结果 , 计算出各个剂量 N +离
子注入引起的突变率 ,见表 4。
可见在 5×1016 ions/cm2 剂量的数值出现异常
偏离 , 但如图 3(根据表 4绘制的变异率与 N +离子
注入剂量的关系)所示 ,在此数值之前呈现单峰值分
布特征[变异率峰值(9.0%)在 1×1015 ions/cm2] 。
比较突变率和发芽指标数据 ,可见 1×1014-5×1015
io ns/cm2的剂量范围包括了突变率和发芽指数的
峰值 , 是研究 N +离子注入诱变效应的最佳范围。
5×1016 ions/cm2 剂量的致突变效应异常高 , 但发
芽指数不高 。值得注意的是 ,在 5×1016 ions/cm2剂
量诱变的种子所种植的结果中 ,有两株特大植株 ,株
高达 60 cm , 茎细长 , 叶片平均大小是对照植株的
1.5倍 ,表现为完全不育 。
2.3 N+、 C+离子注入诱变率比较
对 N +、 C+离子各 3个剂量注入种子的后代基
因组 DNA进行 RAPD分析 ,统计变异率。结果见图
4。可见 ,在同等剂量下 , C +离子注入的诱变率高于
1 2 3 4 5 6 7
1.8
4.6
6.5
7.8
9.0
8.6
6.7
10
8
6
4
2
0
n
o
ita
tu
M
p
a
tn
e
c
re
g
se
)%(
Doses of im planted N
+
io ns
Fig.3 T he re la tionship be tween muta tion
percent ages and the doses (w ithout 5 ×1016
ions/cm2)of implanted N + ions (ions/cm2).
1:1×1013 ;2:5×1013;3:1×1014;4:5×1014;
5:1×1015 ;6:5×1015;7:1×1016
生 物 物 理 学 报254 2002年
Doses of imp lanted ions(×101 4 ions/cm2)
C+
N+
5.4
1.8
8.7
7.8
12.3
8.6
15
10
5
0
n
o
ita
tu
M
p
a
tn
e
cre
g
se
)%(
1 2 3
Fig.4 Comparison o f m utagene tic percent ages
betw een N
+
and C
+
implanted ions
N +离子注入的诱变率 。
3 讨 论
拟南芥基因组小 , 单拷贝多 , 易于进行基因序
列 、 表达和调控的分析。开展拟南芥分子遗传学研
究 , 有利于物种进化 、植物发育 、基因表达调控等规
律的揭示和作物遗传性状的改造[ 18] 。
RAPD(随机扩增多态性 DNA)技术是一种有
许多特性的分子标记技术 。它不易受环境 、 基因表
达产物显隐性等的限制 , 不涉及探针筛选 、克隆 、标
记及分子杂交等操作 , 能以少量材料快速检测基因
组的各种突变 。不过 ,由于 RAPD 技术具有 PCR技
术固有的缺陷 ,会产生非基因组 DNA 扩增假带 。如
图 1和图 2中所示 ,与辐射诱变相似 ,同剂量离子注
入会产生不同的变异 , 这是粒子对基因组作用的随
机性所致 。我们以不含模板 DNA 的实验做参比 ,筛
选了能产生明显可辨的带型和较少异常条带的引物
用于实验;以可重复的扩增结果作为统计依据。为
了避免对照组和实验组原有个体基因组 DNA 的差
异以及外来 DNA的干扰 , 本研究将同株收获的种
子同时用作对照材料和离子注入材料。
离子注入产生诱变的真实性和诱发变异的机理
问题 ,受到了广泛的关注[ 5] 。目前学术界基本认同了
离子注入可以诱发变异的事实 , 然而诱发变异的原
因是离子激发的 X射线 [ 19] 还是导入离子参与了生
物体内遗传物质重组[ 5] ,拟或别的分子作用机理 ,还
在深入探索之中。低能离子引起的生物效应包括离
子质量 、能量和电荷的传递作用 ,也可能涉及到某些
受体的作用;低能离子(如 N +离子)还可能直接取
代或补充到 DNA分子中引起突变 。在遗传和作物
育种方面 , 已经获得了低能离子诱变实验结果 [ 13 ] ;
已有研究表明 ,离子注入可以促进幼苗生长 ,提高作
物的产量 , 促进甜菊优质糖苷 Rebaudioside -A 等
含量增加[ 6] ,获得早熟大果[ 8]等。
本研究以模式物种拟南芥为实验对象 , 结合发
芽指数统计 , 应用 RAPD技术分析不同剂量离子注
入 、特别是 N +离子注入的诱变情况 , 以期揭示低能
离子诱变的确切效果 、 诱变效应与离子注入剂量的
关系 , 为进一步做特异突变的遗传分析打下基础。
结果表明 , 各剂量处理对种的发芽率都产生了一定
的影响 , 合适的离子注入剂量可以促进种子的发芽
率;离子注入处理可能都对种子产生了一定的损
伤 , 影响了种子发芽速度 , 但合适剂量的离子注入
也可以保持一定大小的发芽势;N +离子注入剂量
为 1×1013-1×1016 io ns/cm2时发芽指数和诱变率
数据均呈现单峰值分布。 另外 , 无论是离子激发
的 X 射线还是离子参与遗传物质重组 , 超量的作用
必然有害于生物(如本研究中 5×1016 ions/cm2剂
量表现了超高剂量造成的极端表型)。根据本研究 ,
1×1014-5×1015 io ns/cm2剂量范围包含了突变率
和发芽指数的峰值 , 是研究 N +离子注入诱变效应
的最佳范围 。
本研究还显示 , 在同等剂量下 , C+离子注入的
诱变率高于 N +离子注入的诱变率 , 有关机理需要
进一步研究(事实上 ,作为有机大分子的主要骨架成
分 ,碳元素受到干扰预期应产生较大生物学效应 ,但
这种解释需要探讨)。 这对离子注入手段的选择是
个参考 。
本研究的 RAPD以 11种引物进行扩增 , 其中
4种引物(OP H08 , OP K 15 , OP J6 , OP J11)扩
增出差异片段 , 片段的重复性良好。我们正以此为
基础 , 结合 AFLP 等技术 ,研究特异基因突变 , 为研
究基因功能 、创立新的遗传性状创造条件 。
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第 2期 255神经科学与百年诺贝尔奖
AN ANALYSIS ON THE MUTAGENIC EFFECTS OF LOW ENERGY ION
IMPLANTATION IN Arabidopsis thal iana
LIANG Qian-jin , HU Yu-lian , ZHANG Gen-fa
(Col lege of Li fe Sciences , Beijing Normal U niversity , Beij ing 100088 , China)
Abstract:The seeds of Arabidopsis thaliana implanted w ith low energy N + and C+ ions w ere
used , and germinat ion indices (germ ina tion percentag e and germinat ion impetus)were counted.By
means o f improved RAPD me thod , random fragment polymo rphism amplif ica tion of genome DNAs of
the A rabidopsis thaliana plants g row n from N
+
ion implanted seeds w as done w ith 11 primers , 4 of
w hich ampli fied dif ferential f ragments.The results showed that , w ith a certain appropriate do sage
of N
+
o r C
+
ions , the germinat ion pe rcentage may be increased.Both o f the peak germinat ion
percentage values of the tw o kinds o f ions (92.3% and 74.4% respectively)were at 5×1014 io ns/
cm2 .The analy sis of the N + implanted materials revealed that , w ithin the limi t of implantat ion
f rom 1×1013 -1×10 16 ions/cm2 , the change tendency of g enome DNA variat ion percentages is ba-
sically consistent w i th that of germ ina tion indices , and the peak value of variat ion percentag es
(9.0%)w as at 1×1015 io ns/cm2 .This suggested that the optimum implantation doses fo r analy zing
the mutagenic effects of low energy N
+ ion are in the range of 1×1014 -5×1015 ions/cm2.Acco rding
to the comparison betw een N
+
and C
+
ion implantat ion , the mutagenic pe rcentage of C+ ion , within
a ce rtain range , is higher than that o f N + io n at the same dosage.
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