全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2008,16 (3):543~544
*基金项目:国家重点基础研究规划(973)项目(No.G1999011704)资助。
**通讯作者。Authorforcorespondence.Email:.
收稿日期:2007-03-09 接受日期:2007-04-17
·研究简报·
拟南芥AtEXPA1基因启动子的克隆及转录调控元件分析*
李 宏,魏鹏程,龚喜明,王学臣**
(中国农业大学生物学院植物生理生化国家重点实验室,北京100094)
关键词:拟南芥AtEXPA1启动子;顺式作用元件;转录调控
中图分类号:S188 文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2008)03-0543-02
CloningandAnalysisofTranscriptionalRegulatoryModuleofAtEXPA1Promoter
LIHong,WEIPeng-cheng,GONGXi-ming,WANGXue-chen**
(StateLaboratoryofPlantPhysiologyandBiochemistry,ColegeofBiologicalScience,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)
Keywords:AtEXPA1promoter;cis-elements;transcriptionalregulatory
扩张蛋白(expansin)是一类特异定位在细胞壁上具有酸
生长活性的蛋白 (LeeandKende,2001;ChenandBradford,
2000),调控很多重要的生理过程(ChoandCosgrove,2000),
在时间和空间上的表达受到严格调控。本研究克隆了一个拟
南芥 expansin基因 AtEXPA1的启动子,通过数种逆境胁迫
诱导表达,对可能的活性响应部位进行了分析。
1 材料和方法
1.1 启动子的克隆和活性检测
以拟南芥(Arabidopsisthaliana)基因组 cDNA为模板,设
计上下游引物,扩增897bp长的片段,插入已连接 GUS基因
的质粒中,构建重组质粒pUC19-P12。将CaMV35S启动子作
为对照(pUC19-35S)。用基因枪轰击拟南芥叶片,之后 GUS
染色检测启动子活性。
1.2 启动子顺式作用元件的构建
构建一系列含有不同长度启动子的表达载体,分别命名
为 pUC-P12、pUC-P32、pUC-P42、pUC-P52、pUC-P56和
pUC-P86。
1.3 基于原生质体瞬时表达的启动子活性分析
制备烟草(Nicotianatabacum)原生质体,PEG介导转化。
正常培养 36h后进行不同处理。光处理:光强为 120～130
μmol/m2/s,培养 8h。冷处理:4℃冰箱中培养 8h。ABA处
理:培养缓冲液内加入 100μmol/LABA溶液培养 3h。盐处
理:培养缓冲液内加入200mmol/LNaCl溶液培养 3h。对照
为转化相应载体,正常条件下培养的原生质体。提取GUS蛋
白,计算GUS活性。
2 结果和讨论
2.1 AtEXPA1基因上游片段具有启动子活性
通过 GUS组织化学染色检测,证明所扩增的片段具有
启动子活性(图1)。
图1.基因枪轰击拟南芥叶片的GUS组织化学染色
Fig.1.HistochemicalstainingofGUSexpressioninA.thalianaleaves
afterpaticalbombardment
A.负对照;B.pUC19-35S;C.pUC19-P12。圈显示GUS染色。
A.negativecontrol;B.pUC19-35S;C.pUC19-P12.
CircularitiesshowingGUSstain.
2.2 AtEXPA1基因启动子的切除分析
根据 AtEXPA1基因启动子中可能的转录因子结合元件
分布,对其进行截短分析,结果表明,不同位置和长度的
AtEXPA1启动子活性不同,其中 282bp长的 P52启动子片
段连接的gus基因,表达活性最高(图2)。P52和P42区间中
可能存在一个转录抑制子。TATAbox及转录起始位点的下
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
游序列对RNA聚合酶有效的转录同样起到重要的作用。
2.3 AtEXPA1基因启动子响应环境信号的活性位置分析
不同处理后,不同长度的启动子片段的活性发生了变
化。可以得出以下结论,AtEXPA1基因启动子受光抑制(图3,
A),存在大量与光响应有关的元件,因为存在大量与 Dof转
录因子结合的元件,不排除 Dof类转录因子参于调节
AtEXPA1启动子响应光信号过程。AtEXPA1基因启动子受
冷胁迫负调控(图 3,B),在-897bp到-626bp之间存在某
些冷负调控响应元件,而且可能只存在于这 271bp之间。
AtEXPA1受 ABA和 NaCl负调控(图 3,C、D),结果有相似
之处,推测P32和P42之间存在 ABA负调控因子结合元件,
P32到P52之间存在NaCl负调控因子结合元件。
图2.缺失启动子片段GUS活性
Fig.2.QuantificationanalysisofGUSactivityindiferentdeletionpromoters
图3.光(A)、4℃(B)、ABA(C)和NaCl(D)处理后启动子GUS活性分析
Fig.3.QuantificationanalysisofGUSactivityofpromotersaftertreatmentsoflight(A),4℃(B),ABA(C)andNaCl(D),respectively
参 考 文 献
ChenFandBradfordK J.Expressionofanexpansinis
associated with endosperm weakening during tomato seed
germination(J).PlantPhysiology,2000,124(3):1265～1274
ChoH-TandCosgroveDJ.Fromthecover:Alteredexpressionof
expansin modulates leafgrowth and pedicelabscission in
Arabidopsisthaliana(J).PNAS,2000,97(17):9783～9788
LeeYandKendeH.Expressionofbeta-expansinsiscorelatedwith
internodalelongationindeepwaterrice(J).PlantPhysiology,2001,
127(2):645～654
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