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第 33卷第 2期 湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.33 No.2
2007年 4月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Apr．2007
文章编号：1007-1032(2007)02-0145-05
拟南芥 AKIN11 基因的过表达及其功能分析
马 毅，唐冬英，赵小英，秦玉芝，郭新红，刘选明*
(湖南大学 生命科学与技术研究院, 湖南 长沙 410082)
摘 要：将蔗糖非发酵基因相关蛋白激酶 AKIN11克隆到植物表达载体 pEGAD的 35S启动子下游与 GFP融
合，基因枪法导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达，发现集中在细胞核内表达．农杆菌介导花序浸泡法转化拟南芥，
Basta筛选和 RT-PCR鉴定得到两个遗传稳定的 T3代转基因株系．突变体和野生型的表型没有明显差异，但突
变体叶片中淀粉含量较野生型增加．RT-PCR分析淀粉合成途径关键酶的 mRNA水平，发现突变体中腺苷二磷
酸葡萄糖焦磷酸化酶表达量增加，而 α-淀粉酶却没有变化．表明 AKIN11基因可能在拟南芥淀粉积累途径中起
着重要的调节作用．
关 键 词：拟南芥；蔗糖非发酵基因相关蛋白激酶；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；α-淀粉酶
中图分类号：Q786 文献标识码：A

Over-expression and function analysis of AKIN11 gene in Arabidopsis
MA Yi，TANG Dong-ying，ZHAO Xiao-ying，QIN Yu-zhi，GUO Xin-hong，LIU Xuan-ming *
(Institute of Life Science and Biotechnology，Hunan University，Changsha 410082，China)
Abstract：The sucrose nonfermenting-1-related protein kinase (SnRK1) AKIN11 was inserted the downstream of the
35S promoter in the plant expression vector pEGAD and then was transformed to Onion Epidermal cell by the particle
bombardment．We found that the green fluorescent was focused on the nucleus．The recombination vector was
introduced into Arabidopsis thaliana by Agrobacterium tumefaciens through the floral dip method．The two independent
homozygous transgenic lines and T3 progenies were obtained by the Basta screening and RT-PCR method. Mutants have
no distinguishable phenotype from that of the wild type. However，the starch content shows an increase in leaves of
transgenic lines．RT-PCR analyses find that the AKIN11 gene affects the expression of the AGPase，which is a key
enzyme in the pathway of the starch synthesis．In contrast，there are no changes in expression of the AMY3．The results
indicate that the AKIN11 gene may play an important role in the regulation of pathway of the starch accumulation in
Arabidopsis thaliana．
Key words：Arabidopsis；SnRK1；ADP-glucose pyrophosphorylase；α-amylase

蔗糖非发酵蛋白激酶(SNF1)首先在酵母中被
发现，其突变体由于snf1不能够在蔗糖作为惟一碳
源的培养基上生长而被分离出来[1]．SNF1在真核生
物中有很强的保守性，植物中已鉴定出大量SNF1
类似物，按照氨基酸保守序列分析，分为3个亚族
(SnRK1，SnRK2，SnRK3)，其中SnRK1与SNF1氨
基酸序列有48%的相似性，在结构和功能上亲缘关
系最近[2]．SnRK1家族基因在模式植物拟南芥和经
济作物甜菜、小麦及烟草中相继被发现．SnRK1通
过直接磷酸化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、
蔗糖磷酸盐合成酶以及硝酸盐还原酶等关键酶对
能量代谢进行调控[2-3]．Halford等推测SnRK1家族是
植物葡萄糖信号传导和碳水化合物代谢途径中的
一个关键开关[4]．拟南芥中SnRK1亚族成员AKIN10
和AKIN11都能与酵母突变体snf1互补，并受蔗糖激
活[5]，表明AKIN11基因的功能与酵母SNF1家族基
因的功能相似．
拟南芥叶片的叶绿体可以在白天以很短的时间
合成并积累大量的淀粉，夜晚转运或降解，为代谢
活动提供碳水化合物[6]．腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化
酶(AGPase)是拟南芥叶片淀粉合成过程中的一个关
收稿日期：2007-01-16
基金项目：国家自然科学基金项目(30600368)；湖南省
自然科学基金项目(05JJ30038)
作者简介：马 毅(1982-)，男，回族，湖南邵阳人，硕
士研究生．*通讯作者：sw_xml@hnu.cn．
DOI:10.13331/j.cnki.jhau.2007.02.005


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键酶[7]，催化1-磷酸葡萄糖和ATP合成ADPG并释放
PPi．在腺苷酸转运器帮助下，ADPG作为葡萄糖基
供体通过质体膜进入质体将糖基加到α(1-4)葡聚糖
的非还原端，形成淀粉小颗粒[8]．拟南芥叶片淀粉主
要被α-淀粉酶AMY3降解[9]，淀粉非还原性末端α-1，
4-葡聚糖苷键水解生成的葡萄糖与麦芽糖混合物由
六碳糖转运器运出，在细胞质中合成蔗糖[10]．笔者
构建了拟南芥AKIN11基因的过表达载体，获得了过
表达的纯合株系，并对其突变体中淀粉含量以及
AGPase，α-淀粉酶的mRNA水平进行了分析．
1 材料与方法
1.1 材 料
哥伦比亚野生型拟南芥Col-4，大肠杆菌DH5α
菌株，农杆菌GV3101菌株由湖南大学植物分子生
物学与生物技术实验室保存；pGEM-T载体从宝生
物工程(大连)有限公司购买，pEGAD质粒由美国加
州大学林辰涛教授提供；各种内切酶、T4连接酶购
自Sigma公司；Minit RNA提取试剂盒、M-MLV逆
转录试剂盒购自Promega公司，DNA回收试剂盒购
自长沙安比奥生物技术有限公司．
1.2 方 法
1.2.1 拟南芥总 RNA 提取
以16 d的野生型拟南芥幼苗为材料，采用RNA
easy Mini Kit提取总RNA，采用Promega M-MLV 逆
转录系统合成cDNA．
1.2.2 AKIN11 cDNA 的克隆
根据Tair中公布的拟南芥基因组序列设计PCR
扩增引物：上游引物：(5′- ccgGAATTCATGGATCA
TTCATCAAATAGATT-3′)(引入EcoRI酶切位点)和
下游引物：(5′- cgcCTCGAGTCAGATCACACGAA
GCTCTGTAAGA-3′)(引入XhoI酶切位点)．以基因
组cDNA为模板，用设计好的引物，按如下条件进行
PCR反应：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，61.7 ℃
退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环，72 ℃延伸
10 min．PCR反应结束后，以2.5 kb DNA Ladder为对
照，取10 µL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析．
1.2.3 植物表达载体的构建
将PCR产物按安比奥生物技术公司回收试剂盒
操作指南回收，将回收产物连接到pGEM-T载体，
重组质粒转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选鉴定
和上海博亚生物技术公司测序，所得序列分别在
TAIR和GenBank进行Blast对比分析，测序正确的质
粒命名为AOT．
将pEGAD载体和AOT载体进行EcoRI和XhoI
双酶切，分别纯化回收PEGAD载体12.5 kb的线性片
段和1.5 kb的AOT基因片段，然后用T4连接酶连接，
构建成由35S启动子驱动的含有AKIN11融合基因
的植物表达载体．产物转化大肠杆菌DH5α，并在
含有卡那霉素固体培养基中筛选，PCR和酶切鉴定
重组质粒，阳性克隆命名为pEGAD-AKIN11．
1.2.4 农杆菌转化
根据BIO-RAD电击转化仪说明书将pEGAD-
AKIN11载体电击转化农杆菌GV3101，细胞悬浮液
涂布于含有卡那霉素50 µg/mL，利福平50 µg/mL的
LB平板上，28 ℃培养2～3 d．扩大培养后提取质粒
进行PCR扩增验证．
1.2.5 基因枪法转化洋葱表皮细胞
采用GJ-1000高压气体基因枪，根据操作说明，
将构建好的pEGAD-AKIN11质粒轰击1.5 cm×1.5 cm
洋葱表皮细胞，每皿轰击 3 次，然后将材料置于28
℃弱光下培养24 h．取洋葱内表皮，用4% 多聚甲醛
固定30 min，加入DAPI (10 g/L)染色30 min，封片，
荧光显微镜下观察．
1.2.6 pEGAD-AKIN11表达载体转化拟南芥以及转
化子筛选
参照Clough等[11]方法，采用花序浸泡法转化拟
南芥，转化2周后收获种子．
种子经表面消毒，放于4 ℃冰箱春化4 d，播种
于培养土中，待长出2片真叶，喷洒1∶1 000的Basta
除草剂进行筛选．设计AKIN11特异性引物，采用
RT-PCR对具有Basta抗性的拟南芥转基因植株进行
鉴定，以获取过表达AKIN11基因的纯合株系．
1.2.7 酶水解法测定淀粉含量
根据Zeeman[9]的方法，从单株叶片(200~600 mg
鲜重)中提取80%(体积分数)乙醇不溶物，然后按照
Hargreaves和Ree[12]的方法用α-淀粉酶和淀粉葡糖苷
酶将其水解成葡萄糖后，再用葡萄糖氧化酶和过氧
化物酶处理，分光光度计法测定叶片中淀粉含量．
1.2.8 RT-PCR 检测基因的表达
通过 RT-PCR分析淀粉合成与降解相关基因的
mRNA水平．分别提取突变体MT-1，MT-2和野生


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型 WT 在 MS 培养基中生长 10 d 左右的幼苗总
RNA，将逆转录的 cDNA 模板稀释 10 倍，分别取
1 µL进行 PCR扩增，作为对照的持家基因 Actin 为
28个循环，其余基因 32～36个循环，取 20 µL PCR
产物凝胶电泳分析 mRNA水平的变化．
2 结果与分析
2.1 AKIN11 基因 cDNA 的克隆与测序结果
拟南芥AKIN11基因的RT-PCR扩增产物与DNA
Marker标准分子量进行对比分析，仅出现1条1.5 kb
特异扩增条带(图1)，条带单一、清晰，并将PCR产
物克隆至pGEM-T中，将得到的重组质粒进行测序，
结果表明编码蛋白序列与GenBank中报道的一致，
说明利用RT-PCR已成功克隆到AKIN11基因．


M DNA Marker；1 对照；2～3 PCR产物
图1 AKIN11 RT-PCR 扩增电泳结果
Fig.1 RT-PCR results of AKIN11 gene
2.2 重组质粒 pEGAD-AKIN11 的构建
将EcoRI，XhoI双酶切pEGAD载体得到的线性
片段与双酶切AOT载体所得到的AKIN11基因片段
连接(载体构建效果如图2)，经转化筛选得到阳性克
隆，随后提取质粒，进行酶切和PCR鉴定，结果如
图3所示，所得片段与预期的一致，说明植物表达
载体pEGAD-AKIN11构建成功．

图2 重组质粒pEGAD-AKIN11
Fig.2 Recombinant plasmid of pEGAD-AKIN11







M Marker；1 双酶切pEGAD；2 双酶切pEGAD-AKIN11；
3 空白对照；4 PCR产物
图3 pEGAD-AKIN11 载体的双酶切和PCR鉴定电泳
Fig.3 Restriction digestion fragment and PCR product from
pEGAD-AKIN11
2.3 GFP融合基因表达鉴定
采用基因枪法，将表达载体pEGAD-AKIN11轰
击洋葱表皮细胞后制片，置荧光显微镜下以488 nm
激发光进行观察，结果如图4．绿色荧光主要集中
在细胞核内，而细胞质内却没有荧光(图4-A)．为进
一步了解AKIN11基因在细胞中的定位，同时用
DAPI染色细胞核，结合图4-B的结果表明GFP-
AKIN11融合蛋白主要在细胞核内表达，说明
AKIN11基因定位在细胞核内．






A 洋葱表皮细胞GFP-AKIN11的荧光定位；B DAPI染色的洋葱表
皮细胞GFP-AKIN11
图4 AKIN11 在洋葱表皮细胞中GFP定位
Fig.4 Localization of GFP in the transgenic onion cells
2.4 突变体纯合子的鉴定
将含有pEGAD-AKIN11表达载体的农杆菌浸
花蕾得到的T0 转化子播在培养盘内，用Basta进行筛
选，得到抗Basta植株110株．单株收种获得T1 种子，
再用Basta筛选，外源基因在与拟南芥基因重组时，
也可能在不同的两条染色体上双位点或多条染色
体上多位点插入，选取经卡方适应性检验为3∶1分
离规律的单一位点插入突变体．将成活幼苗移栽，
成熟后单株收种为T2代种子．同样，将T2代种子进
行播种培养，然后用Basta筛选，结果不再发生分离，
因此它们自交所结的种子为T3代纯合子．Basta筛选
A B
1 500 bp
2 500 bp
1 000 bp
500 bp
M 1 2 3
1 000 bp
1 500 bp
500 bp
2 000 bp
M 1 2 3 4


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得到的阳性植株，不一定就是转基因植株，于是采
用RT-PCR方法对其进行鉴定，结果如图5所示．突
变体中AKIN11的mRNA水平比野生型高出许多，说
明试验中得到的T3代突变体MT-1和MT-2为AKIN11
过表达的纯合株系．



图5 RT- PCR 验证转基因植株
Fig.5 Transgenic plants confirmed by RT-PCR
2.5 淀粉含量的测定
将拟南芥野生型WT，过表达突变体MT-1，MT-2
在12 h白光与12 h暗光周期条件下培养，生长6个星
期后，分别在光照开始和3，6，9，12 h时取材，测
定叶片淀粉含量，结果如图6所示．光照开始时，三
者叶片淀粉含量差异不明显，光照3 h时，MT-2比
WT和MT-1的叶片淀粉含量有所减少，随后MT-1与
MT-2较野生型叶片中淀粉的含量都有不同程度的升
高，当光照12 h后达到最大差异，分别是野生型叶片
淀粉含量的135%与127%，表明AKIN11与拟南芥叶
片中淀粉的积累有密切的关系．






图 6 拟南芥叶片淀粉含量
Fig.6 Starch content in Arabidopsis leaves
2.6 相关基因的 mRNA 水平分析
为进一步探讨AKIN11的过表达与拟南芥叶片
中淀粉含量增加的关系，RT-PCR分析野生型与突变
体AGPase和α-淀粉酶的mRNA水平，结果如图7所
示，淀粉合成途径的关键起始酶AGPase的小亚基
ApS1表达量有所提高，相比之下AGPase的大亚基
ApL1和α淀粉酶AMY3的表达量却无明显变化．这
个发现有助于解释过表达AKIN11基因的拟南芥突
变体MT-1和MT-2叶片中淀粉含量增加的现象．





图7 RT-PCR 检测淀粉合成相关基因的表达量
Fig.7 Expression analyse of genes in starch biosynthesis
3 讨 论
高等植物中，淀粉主要在质体中合成，即卡尔
文循环固定CO2，形成3-磷酸甘油酸(3-PGA)，然后
转化为磷酸丙糖(TP)，其中一部分TP转变为6-磷酸果
糖(F-6-P)，先后转变为6-磷酸葡萄糖(G-6-P)和1-磷
酸葡萄糖(G-1-P)，G-1-P在AGPase作用下形成淀粉合
成直接前体，进而合成直链淀粉和支链淀粉，还有
一部分TP转变为蔗糖，在蔗糖合成酶(SUS)的作用下
分解成果糖和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，UDPG继
而形成G-6-P或G-1-P，在AGPase作用下形成淀粉合
成直接前体，开始合成淀粉[13]．拟南芥叶片中淀粉
的合成遵循第一条反应途径，AGPase是由2个大亚
基和2个小亚基组成的四聚体，其中小亚基(ApS1)
和大亚基(ApL1)对淀粉合成起关键影响[14]，而其他
亚基主要功能是增加小亚基对激活因子的亲和性，
降低小亚基对抑制因子的亲和性 [15-16]．拟南芥有3
个α-淀粉酶(AMY1，AMY2，AMY3) 降解淀粉，其
中AMY3是惟一定位于叶绿体且有N端转运氨基的
淀粉酶[17]，它和AGPase表达量的变化直接关系到拟
南芥叶片中最终的淀粉含量．
本试验表明，过表达 AKIN11基因能提高拟南
芥中 AGPase的 mRNA水平，推测由此导致突变体
叶片中淀粉含量高于野生型．由于 AGPase的调控在
转录水平进行，AGPase 的 mRNA 水平变化与腺苷
二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的变化是一致的[16]，
所以大量生成的 ADPG在质体中形成淀粉小颗粒，
但是降解淀粉的淀粉酶却没有变化．因此，突变体
叶片中的淀粉被暂时性积累在叶绿体中．分析表明
拟南芥的 AKIN11基因可能是淀粉合成起始关键酶
AGPase的功能亚基 ApS1表达的正调控因子．拟南
芥 AKIN基因调控光合作用源中的淀粉含量的功能
具有重要的实践价值，人们可以利用基因工程手段
ApL1
ApS1
AMY3
Actin
WT MT-1 MT-2
AKIN11
Actin
WT MT-1 MT-2
0
6
12
18
0 3 6 9 12
光照时间/h
叶
片
淀
粉
含
量
/(
m
g ·
g－
1 )
WT MT-1 MT-2


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通过 AKIN11基因来调控作物淀粉合成过程关键酶
表达，提高作物的淀粉水平，从而选育出高淀粉品
种，有效提高作物抗逆境的能力．蔗糖非发酵激酶
AKIN11 基因是葡萄糖信号传导途径中重要调控因
子，试验证明 AKIN11编码蛋白主要定位于细胞核
内，这与同源基因 AKIN10表达蛋白的区域相一致．
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责任编辑：罗慧敏
英文编辑：胡东平