全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 4期，第 887-890页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.4, 887-890
研究报告
Research Report
拟南芥未知基因 At018融合蛋白原核表达条件的优化及纯化
孙博 1 卜媛媛 1 高野哲夫 2 柳参奎 1 *
1东北林业大学东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,盐碱地生物资源环境研究中心,哈尔滨, 150040; 2东京大学亚洲生物资源环
境研究中心,东京, 188-0002
*通讯作者, shenkuiliu@nefu.edu.cn
摘 要 本课题组在前期的研究中利用 AlCl3胁迫筛选碱茅全长 cDNAs酵母表达文库获得到一个与铝毒
害相关的未知基因(基因编号为 018,用 put018表示)，该基因与拟南芥中未知基因(基因号为 At5g57345,本
研究中用 At018表示)有较高的同源性。为了获得 At018的纯化蛋白，本研究将拟南芥 At018基因克隆后构
建原核表达载体 pGEX-6p-3-At018，再将其转入大肠杆菌 BL21 (DE3)菌株，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖
苷(IPTG)进行诱导表达。同时运用传统方法优化诱导条件，以提高重组融合蛋白的表达效率。SDS-PAGE分
析结果表明，30℃下 0.1 mmol/L IPTG的条件下诱导 3 h后，GST-At018融合蛋白的表达量最大，蛋白分子质
量与预测值相符，该蛋白主要以可溶性形式存在；接着利用 Glutathione Sepharose4 Fast Flow亲核层析树脂
纯化最终获得 GST-At018融合蛋白。本研究可为进一步进行 At018的功能解析提供基础。
关键词 拟南芥, At018基因,原核表达,蛋白纯化
Purification and Optimization of Prokaryotic Expression of Unknow Gene
(At018) of Arabidopsis
Sun Bo 1 Bu Yuanyuan 1 Takano Tetsuo 2 Liu Shenkui 1*
1 Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field (SAVER), Ministry of Education, Alkali Soil Natural Environmental Sci-
ence Center (ASNESC), Northeast Forestry University, Harbin, 150040; 2 Asian Natural Environmental Science Center (ANESC), University of Tokyo,
Tokyo, 188-0002
* Corresponding author, shenkuiliu@nefu.edu.cn
DOI: 10.13271/j.mpb.013.000887
Abstract In previous studies, we had the Puccinellia tenuifolra cDNA libraries expressing in yeast (Saccharo-
myces cerevisiae) and obtained an unknown gene by being screened on agar plates containing different toxic
concentrations of AlCl3. One unknown gene were isolated that enhanced the aluminum tolerance of yeast. This
unknown gene that may enhance the aluminum tolerance of yeast has high homology with an unknown Arabidopsis
genes (At5g57345). In order to obtain purified protein of At018 gene, we constructed prokaryotic expression vector
pGEX-6p-3-At018, and then it was transferred into E. coli BL21 (DE3) strain The recombinant GST-At018 fusion
protein was over expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) cells in the presence of isopropyl-β-thiogalactopyran-
oside (IPTG). To achieve a high level expression, the optimized induction conditions were identified by using clas-
sical experimental method. SDS-PAGE analysis revealed that inducing the cells, the optimal conditions were at
30℃ in 0.1 mmol/L IPTG for 3 hours for expression of the recombinant GST-At018 fusion protein. The molecular
mass of the expressed product was identical to the predicted protein which was mainly detected in the soluble
fraction of E. coli cell lysates. The recombinant GST-At018 fusion protein was purified by using glutathione
sepharose 4 fast flow affinity column. It was provided preliminary foundation for functional analysis of At018.
收稿日期：2014-09-23 接受日期：2014-12-28 网络出版日期：2015-03-12
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/2557
基金项目：本研究由中国教育部科研创新团队计划(IRT13053)资助
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
Keywords Arabidopsis, At018 gene, Prokaryotic expression, Protein purification
近年来，随着测序技术的不断发展，拟南芥和水
稻等高等植物完成了全基因组测序，但到目前为止，
仍有大量功能未知的基因尚待进一步研究。利用反
向遗传学理论和技术如 cDNA文库、差异显示 PCR
(DDRT-PCR)、基因芯片和蛋白质组学等，来解析这
些未知基因的功能已经成为一种越来越行之有效的
手段。迄今为止，在拟南芥(Kumari et al., 2008)、大豆
(Ermolyev et al., 2003)、水稻(Mao et al., 2004)、玉米
(Maron et al., 2008)、苜蓿(Chen et al., 2011; Chandran
et al., 2008)等植物中已有很多逆境响应基因被鉴定。
这些基因中包含了大量的未知基因，如 Snowden和
Gardner 最先在小麦根尖铝敏感和抗铝型的 cDNA
文库中克隆出 5个受铝诱导的 cDNA，其中 wail2、wail3
和 wail5则为功能未知蛋白(杨建立等, 2005)。Ma等
(2006; 2007)利用水稻硅吸收缺陷突变体 lsi1 (lowsil-
icon rice 1)采用图位克隆法鉴定了 OsLsi1和 OsLsi2
两个水稻中的硅转运蛋白。
在之前的研究中，本课题组以碱茅作为实验材
料，利用 FOX hunting system建立的全长 cDNA酵母
表达文库，且利用 AlCl3胁迫筛选得到一个与铝毒害
相关的未知基因。这个基因与拟南芥中未知基因
At018有较高的同源性，并且此基因在拟南芥中为单
拷贝。为了进一步解析 At018基因，探讨其在逆境下
的功能，本研究对这个未知基因蛋白纯化的诱导条
件进行了优化，并对表达蛋白进行了纯化，为进一步
解析基因功能奠定基础。
1结果与分析
1.1融合蛋白的小量诱导表达及条件的优化
将重组载体 pGEX-6p-3-At018 转化 BL21 菌
株，分别在 20℃和 30℃经 0.1 mmol/L、0.5 mmol/L
和 1 mmol/L IPTG的条件下进行诱导，时间梯度为
0、1 h、3 h和 5 h。分别集菌处理后 12%的分离胶进
行 SDS-PAGE电泳(图 1; 图 2)。研究结果表明，在
20℃和 30℃下诱导后的重组质粒能够表达出约 46 kD
的特异融合蛋白，与预测结果一致，且随着诱导时间
的增加蛋白的表达量增加，在 5 h时达到最大值；但
是，在 30℃下经不同浓度诱导不同时间后蛋白的表
达量均高于 20℃诱导的蛋白表达量，并且 30℃下
0.1 mmol/L IPTG诱导 3 h与其它浓度 IPTG诱导 5 h
获得蛋白量差异不大。由此可见，融合蛋白的最适宜
的诱导条件为：30℃下经 0.1 mmol/L IPTG诱导 3 h。
图 1 SDS-PAGE 分析不同 IPTG 浓度诱导不同时间对 GST-
At018融合蛋白表达的影响
注 : M: PR1600 marker; 1: 未诱导 ; 2~4: 在 30℃ , 0.1 mmol/L
IPTG下诱导 1 h, 3 h, 5 h的 GST-At018蛋白; 5~7: 0.5 mmol/L
IPTG 下(30℃)诱导 1 h, 3 h, 5 h 的 GST-At018 蛋白; 8~10:
1 mmol/L IPTG下(30℃)诱导 1 h, 3 h, 5 h的 GST-At018蛋白
Figure 1 The influence of the different IPTG induction concentra-
tionsat different times on expressionof the GST-At018 fusion pro-
tein identified by SDS-PAGE
Note: M: PR1600 marker; 1: Uninduced; 2~4: The expression of
GST-At018 protein induced for 1 h, 3 h, 5 h by 0.1 mmol/L IPTG
at 30℃; 5~7: The expression of GST-At018 protein induced for
1 h, 3 h, 5 h by 0.5 mmol/L IPTG at 30℃; 8~10: The expression
of GST-At018 protein induced for 1 h, 3 h, 5 h by 1 mmol/L
IPTG at 30℃
图 2 SDS-PAGE 分析不同 IPTG 浓度诱导不同时间对 GST-
At018融合蛋白表达的影响
注 : M: PR1600 marker; 1: 未诱导 ; 2~4: 在 20℃ , 0.1 mmol/L
IPTG下诱导 1 h, 3 h, 5 h的 GST-At018蛋白; 5~7: 0.5 mmol/L
IPTG 下(20℃)诱导 1 h, 3 h, 5 h 的 GST-At018 蛋白 ; 8~10:
1 mmol/L IPTG下(20℃)诱导 1 h, 3 h, 5 h的 GST-At018蛋白
Figure 2 The influence of the different IPTG induction concentra-
tions at different times on expression of the GST-At018 fusion
protein identified by SDS-PAGE
Note: M: PR1600 marker; 1: Uninduced; 2~4: The expression of
GST-At018 protein induced for 1 h, 3 h, 5 h by 0.1 mmol/L IPTG
at 20℃; 5~7: The expression of GST-At018 protein induced for
1 h, 3 h, 5 h by 0.5 mmol/L IPTG at 20℃; 8~10: The expression
of GST-At018 protein induced for 1 h, 3 h, 5 h by 1 mmol/L
IPTG at 20℃
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1.2融合蛋白的大量诱导及纯化
为制作抗体和其它研究大量诱导纯化融合蛋
白，本研究根据已优化的诱导条件，在 200 mL LB培
养基中培养转入重组质粒的 BL21菌液，当 OD600值
为 0.6 时，加入 0.5 mol/L IPTG 40 μL至终浓度为
0.1 mmol/L，在 30℃诱导 3 h后对菌体进行超声破碎，
收集上清。将上清采用 Glutathione Sepharose 4B亲
和吸附的方法过柱对融合蛋白纯化，SDS-PAGE 电
泳分析显示纯化的融合蛋白呈单一条带(图 3)，纯化
GST-At018融合蛋白大小与小量诱导表达的一致，
由此说明纯化获得了 GST-At018融合蛋白。
图 3大量诱导及纯化 GST-At018融合蛋白的 SDS-PAGE分析
注: M: PR1600 marker; 1: 未诱导; 2: GST-At018 融合蛋白大
量诱导后表达情况; 3:大量诱导后转入 pGEX-6p-3-At018重
组质粒的 BL21菌体裂解的上清液; 4:纯化的 GST-At018融
合蛋白
Figure 3 SDS-PAGE analysis of large amount of induced and pu-
rified GST-At018 fusion protein
Note: M: PR1600 marker; 1: Uninduced; 2: The expression of
GST-At018 fusion protein were abundantly induced; 3: Super-
natant lysate of E. coli which transformed pGEX-6p-3-At018
plasmid; 4: Purified GST-At018 fusion protein
综合以上结果可知，转入 pGEX-6p-3-At018重
组质粒的 BL21重组菌株，在温度 30℃时，加入终浓
度为 0.1 mmol/L的 IPTG震荡培养 3 h时，最适宜
GST-At018重组蛋白的表达。
2讨论
2.1表达载体与表达菌株的选择
由于大肠杆菌具有好培养、繁殖速度快、表达量
高、纯化容易、成本低等众多优点，成为原核表达系
统高效表达的首选体系，其中 BL21 (DE3)是应用最
广的表达宿主菌(萨姆布鲁克等, 1992)。pGEX表达
载体在 E. coli中表达重组蛋白最常用的载体之一，
已被广泛应用于不同重组蛋白的表达。在合适的条
件下，诱导表达仅几个小时。由于 pGEX载体的 N端
带有 GST-Tag，有利于可溶性蛋白的表达和纯化，且
不影响重组蛋白的结构和功能，是抗原蛋白表达常
用载体。本研究选用 pGEX-6p-3作为表达载体，将
拟南芥未知基因(At018)构建到该载体上，导入大肠
杆菌 BL21 (DE3)中进行重组融合蛋白表达，表达产
物稳定，分子质量与预期相符。经过 SDS-PAGE分析
融合蛋白经 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲核层
析树脂纯化后条带清晰且单一，说明 pGEX-6p-3载
体适合该蛋白的表达，大肠杆菌 BL21 (DE3)菌株的
选用及其诱导表达是正确的。
2.2表达条件与纯化条件的优化
融合蛋白原核表达时，优化其诱导表达条件是
十分必要的，由于不同的诱导条件对于蛋白的表达
影响很大，所以确定最佳的 IPTG浓度不但可以降低
其对大肠杆菌的毒性作用，还能够降低诱导蛋白表
达的费用。为了能够使蛋白的表达效率提高，本研究
通过对不同的 IPTG浓度、不同温度和不同的诱导时
间进行了优化。本研究中，IPTG浓度为 0.1 mmol/L
时诱导不同时间后 GST-At018融合蛋白的表达效果
更好。IPTG浓度增加后融合蛋白表达并没有明显的
增加，反而有降低的趋势，验证了高浓度 IPTG诱导
会一定程度上阻碍蛋白的表达(Patnaik, 2001)。此
外，不同的诱导温度和时间也会导致蛋白表达量的差
异，本研究中，在 30℃下，IPTG浓度为 0.1 mmol/L
诱导 2 h后融合蛋白就开始表达，并且表达量随着诱
导时间的延长而增加，但是诱导 3 h和 5 h融合蛋白
表达量并没有太大差别，说明长时间的诱导并不能
进一步提高蛋白的表达量。最终确定了 GST-At018
融合蛋白最佳的诱导条件(0.1 mmol/L IPTG, 30℃诱导
3 h)，并获得了 GST-At018纯化后的融合蛋白。这为
接下来 At018的功能解析以及植物耐铝机制的进一
步研究，提供了一定的前期基础。
3材料与方法
3.1菌株和载体及主要试剂
pGEX-6p-3载体(GE Healthcare)，大肠杆菌(Esc-
herichia coli) JM109，BL21 (DE3)感受态细胞为本实
验室制作并保存。高保真 EX-Taq DNA Polymerase，
pMD18-T Vector，反转录试剂盒，异丙基 -β-D- 硫
代半乳糖苷(IPTG)，氨苄青霉素均购自 TaKaRa公司；
T4 DNA Ligase，限制性内切酶，胶回收试剂盒购自
MBI (Fermentas)公司；TRIzol Reagent 购自 Invitro-
gen 公司；质粒提取试剂盒购自 TIANGEN 公司；
低分子量蛋白 Marker (PR1600)购自 solarbio 公司；
拟南芥未知基因 At018融合蛋白原核表达条件的优化及纯化
Purification and Optimization of Prokaryotic Expression of Unknow Gene (At018) of Arabidopsis 889
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
Glu tathione Sepharose 4 Fast Flow 纯化柱购自 GE
Healthcare公司。
3.2原核表达载体 pGEX-6p-3-At018的构建
以 pMD18-T-At018为模板，用增设 BamHⅠ和
SalⅠ位点 At018特异引物(上游引物: 5-GGATCCA
TGTATTTCGCCGCCATAG-3;下游引物: 5-GTCG
ACCTAATAGTCGTCTTCGTCATC-3 )，PCR 扩增
ORF，连接到 pMD18-T Vector上，用 BamHⅠ和 SalⅠ
分别双酶切 pGEX-6p-3载体和 At018 DNA，胶回收
载体和目的片段 DNA，连接，构建 pGEX-6p-3-At018
原核表达载体，转化感受态 E. coli JM109，双酶切鉴
定正确后，热激转化大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细
胞，同时转化空质粒 pGEX-6p-3到 BL21 (DE3)为对
照，接种于含 Amp (100 μg/mL)的 LB平板上培养过
夜，挑取单克隆 37℃振摇培养过夜。
3.3融合蛋白的小量诱导表达及表达条件的优化
取过夜培养的重组表达菌 200 μL，加入到含
Amp (100 μg/mL)的 1.8 mL LB 溶液中 37℃振摇培
养至培养液 OD600达到 0.6，分别加入 0.5 mol/L IPTG
0.4 μL、2 μL 和 4 μL，使其终浓度为 0.1 mmol/L、
0.5 mmol/L 和 1.0 mmol/L，设置时间梯度 1 h、3 h
和 5 h，置于 20℃和 30℃摇床振荡培养后，收集菌体，
12% SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达，确定最佳的
表达诱导条件。
3.4融合蛋白的大量诱导及纯化
根据实验得到的最佳诱导时间 3 h 和 IPTG浓
度 0.1 mmol/L，在 30℃条件下大量诱导表达融合蛋
白，培养体积为 200 mL，收集菌体后，重悬于 20 mL
1× PBS (pH 7.4)中，将菌液用超声破碎仪进行超声，
超声破碎 15 min，超声频率为 30~50 HZ，超声 3 s。停
止 5 s。直到菌液澄清，呈现鸡蛋清色。4℃离心分别
收集上清进行 SDS-PAGE分析，检测融合蛋白表达。
将收集的上清，通过 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow
纯化柱收集纯化的融合蛋白，进行 12% SDS-PAGE
电泳，检测分析。
作者贡献
孙博是本研究的实验设计者和实验研究的执行
人，并完成论文初稿的写作；卜媛媛和高野哲夫参与
实验设计及数据分析；柳参奎教授是项目的构思者
及负责人，指导实验设计，数据分析，论文的写作和
修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由中国教育部科研创新团队计划(IR-T13-
053)资助。
参考文献
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