全 文 ：植物生理与分子生物学学报 , oJ “ rn al of p la nt p hy s ot ot 舒 an d M Ole cu la ; B ot le 舒 20 05 , 31 (1 :) 47 一52
拟南芥 A t, IZ和 A .t I3 基因表达对环境胁迫的响应
李国良 ’ , 李冰 “ , 刘宏涛 “ , 周人纲 ”
(’ 河北省农林科学院遗传生理研究所 ,石家庄 0 5 0 0 51 ; 2 河北师范大学分子细胞研究所 , 石家庄 0 50 0 1 6)
摘要 : 用 P C R 的方法获得 A tZJ 和 A tJ 了基因的 3 ’ 非编
码区的核甘酸片段作为探针 , N o rt he m 杂交结果表明 :
A tZJ 和 A 3tJ 基因在植物的根 、 茎 、 叶 、 花蕾 、 花和长
角果中都有表达 , 并在植物整个生长周期中都有表达 ,
但随着植株的衰老表达量有所下降 。 不 同环境胁迫的
实验结果表明 : 热激使 A tZJ 和 A 3tJ 基因的表达迅速升
高 ; 冷胁迫也能诱导这两个基因表达的明显增加 , 但
需要的时间比热激要长得多 , 达 g ;h 水分胁迫能引起
A tZJ 和 A 3tJ 基因表达量的微弱增加 ; 可盐胁迫对 A tZJ
和 A 3tj 基因的表达没有影响 。 说明 A tZJ 和 A 3tJ 基因可
能参与对除盐胁迫以外多种环境刺激的响应 。
关键词 : 拟南莽 ; 热激蛋白 ; J一蛋白 ; 环境胁迫 ; 基
因表达
中图分类号 : Q 9 4 5
分子伴侣(m o l e e u l a r e h a p e r o n e )参与多种生物
学过程如蛋 白质的折叠 、 组装和在亚细胞水平上
的定位等 。 在蛋 白质合成过程中 , 许多因素影响
肤链的延伸和折叠 , 分子伴侣在避免蛋 白质错误
折叠方面起重要作用 。 在胁迫条件下 , 分子伴侣
起稳定蛋 白质结构的作用 , 防止蛋白质凝聚 、 变
性 , 并具有修复受伤害蛋白的能力 ( G eo r g o p o ul os
和 W e l c h 19 9 3: B o s t o n 等 19 9 6 ; H art l 和 H盯 e r 一H art l
2 0 0 2 )
。
J
一 蛋白是一类重要的分子伴侣 。 最早发现的
J
一 蛋 白为 D n aJ , 它是从大肠杆菌中分离的一种 41
kD 的热激蛋白 (G e o r g o p o u l o s 等 19 8 0 ) 。 以后在真
核生物 (包括人类和其他动物 、 植物 、 酵母等 )中
也发现 了它的同源物 , 它们都包含一个保守的 J -
结构域 , 统称为 J 一 蛋白( J 一d o m a i n p r o t e i n ) 。 大量
研究证实 J 一 蛋白与热激蛋白 7 0 (h e a t s h o c k p r o t e i n
7 0 简称 H S P7 0) 组成有序的分子复合体在细胞中起
分子伴侣机器 (m o l e c u l a r e h a p e r o n e m a e n i n e )的作
用 , 参与蛋 白质的折叠 、 组装和转运等多种重要
生命活动 (M i e r n y k 一9 9 9 ; M o h a nj a e 等 2 0 0 3 ) 。 在
动物细胞中还证明 , J 一 蛋白与热激蛋 白 9 0( S P 9 0)
一起参与幽类激素 、 核激素的受体与配体的结合
与解离过程中构像变化的调节 ( K im ur a 等 1 9 9 5 ;
B o h e n 等 1 9 9 5 ; N o l l e n 和 M o r im o t o 2 0 0 2 ) 。 J一 蛋
白还参与重力信号转导过程 ( S e d br o o k 等 1 9 9 ;9
G au
n 等 2 0 0 3) 等多方面的生理功能 。 另外 , 包
含 H S P g O 、 H S P 7 0 和 J 一 蛋 白等的多伴侣复合体也
可作为热激转录因子 h( e a t s h o e k atr n s e d p it o n 几 e to r ,
H sF )的负调节物抑制热激基因的表达 (M ar ch le r 和
W
u 2 0 0 1 )
。
J
一 蛋 白也可以单独在生命活动中起作
用 ( Z h u 等 1 9 9 3 ) 。
拟南芥基因组序列分析表明 , 拟南芥中有 9 0
种 J一 蛋白基因 (M ie m yk 20 01 ) , 这是一个多基因超
级家族 。 在拟南芥的 9 0 种 J 一 蛋白基因中 , 有 31
个与动物或微生物中的同源 , 5 9 个没有同源物 。
植物中有更多的 J 一 蛋白种类 , 可能是适应固着的
生活方式的结果 。 植物的主要代谢过程是在不稳
定的环境条件下发生的 , 然而 , 植物不能运动以
躲避胁迫 , 也不能调节体温以抵抗冷 、 热胁迫 ,
而是在自然选择中进化出一套不 同于动物的胁迫反
应网 。 J 一 蛋白家族有如此多的成员 , 表明 J 一 蛋 白
在细胞生命活动以及对环境胁迫的反应中可能具有
重要的生理功能 。 但植物中关于 J一 蛋 白的生理功
能的研究还是很少 , 仅有在菜豆中 D an J 一 h ke 蛋白
涉及植物抗重金属的报告 (柴团耀等 2 0 0 0) 。 我们
在 9 0 年代从拟南芥中克隆了 J 一 蛋白基因 A t J Z 和
A tJ 了, 并进行了关于分子伴侣功能的研究 。 序列
分析表明它们是大肠杆菌 D n aJ 的同源物 , A t3J 对
热激有响应 ( Z h o u 等 1 9 9 5 ; 周人纲和 M i e r n y k
1 9 9 9 )
, 有热激蛋白的性质 , 并具有分子伴侣的
功能(Z h o u 等 2 0 0 0) , 因此它们可能参与植物的抗
逆反应 。 但有关这两个基因在环境胁迫下 的作用
还未进行详细研究 , 本文以 A tZJ 和 A t3J 这两个基
因为研究目标 , 通过它们在不同胁迫条件下 (温度
2 0 0 4
一
0 6
一
1 7 收到 , 2 0 0 4 一 1 1一 1 3 接受 。
河北省自然科学基金项目 (N o . e 2 0 0 4 0 0 0 7 2 6 )资助 。
* 通讯作者 ( E一m a i l : z h o u re n g a n g @ 16 3 . e o m ; T e l : 0 3 1 1一7 6 5 2 1 2 7 ) 。
植物生理与分子生物学学报 31卷
胁迫 、 水分胁迫和盐胁迫 )的表达 , 了解它们的
可能功能 , 以便进一步利用该基因为抗逆性育种
服 务 。
1 材料与方法
L l 植物材料
拟南芥 ( A r a b id o尸 5 15 t h a l i a n a L . )生态型为
e o l u m b i a
。 种子经表面 ( 7 5% 乙醇 3 0 5 ; 无菌水
洗 3 次 )和深层 ( 10 % 次氯酸钠 10 而n , 无菌水洗 3
次 )消毒后 , 播种在无菌的 M s 培养基上 l( % 蔗
糖 , 0 . 5% 琼脂粉 , l x M u r a s h i g e 与 S k o o g 盐和
维生素 , p H 5 . 5 ) (M u r a s h ig e 和 S k o o g 19 6 2 ) , 避
光 , 4 aC 春化 3 、 4 d 。 转至温度 2 2 oC / 1 s aC (日 z夜 )
和 1 6 h/ s h 光周期下 , 白炽灯光照培养 。 10 d 左
右移栽到含有被 H o ag lan d 营养液浸透的蛙石的小
花盆中 , 与前面同样条件下生长 , 每 s d 浇一次
H o a g l a n d 营养液 。
L Z 胁迫处理
4 周龄的拟南芥植株随同小花盆一起置于 37 “ C
生长箱中进行热激处理 。 冷胁迫在 2℃的生长箱中
进行 。 水分胁迫按照 Y a m a g u e h i 一 S h i n o z a k i 和
s h i n o z a k i ( 1 9 9 4 )的方法 : 将 3 周龄的拟南芥小苗
小心的从琼脂培养基中拔出 , 放在铺有 3 层干滤
纸的培养皿中进行不同时间 ( 1 至 s h) 的胁迫 。 盐
胁迫按照 X ion g 等(2 0 2) 的方法 : 将 3 周龄的拟南
芥小苗小心的从琼脂培养基中拔 出 , 放在铺有 3
层滤纸的培养皿中进行不同时间 ( l 至 s h) 的盐胁
迫 , 该滤纸事先用含有 N a C I 3 0 0 m m o l / L 的
H o a g l a n d 营养液浸泡至饱和 。
1
.
3 核酸分析和探针标记
总 R N A 的提取用华舜生物工程公司生产的
R N A e z R e a g e n t & s y s t e m s 试剂盒 , 根据该公司
提供的提取步骤操作 。 在含有 甲醛的凝胶上进行
的 R N A 电泳和 N o hrt e m 杂交的方法按 S a m b or o k等
( 1 9 8 9) 方法进行 。 用 P C R 方法获得 A tZJ 和 A t3J 两
个基因的 3’ 端非编码区的核昔酸片段作为 N o rt he m
杂交的探针 。 探针的放射性标记用 rP o m e ga 公司
的随机引物 D N A 标记试剂盒与 [a 一 , Z P] 一 d C T P , 按
该公司的实验指导进行 。 用 2 8 5 的 r R N A 作为
N o r t h e r n 杂交的对照 。
L 4 酶和化学试剂
限制性内切酶为华美生物工程公司 (洛阳 )的产
品 , 总 R N A 分离试剂盒购 自华舜生物工程公司
(上海 ) , 同位素 [a 一 32 P] 一d C T P 购 自北京福瑞生物工
程公司 (北京 ) , 放射性标记试剂盒是 P or m eg a 公司
的产品 , P C R 反应所用引物由赛百盛基因技术有
限公司 (北京 )合成 。
2 结果
2
.
1 A tZJ 和 A t3J 在拟南芥中的表达从 4 周龄的拟南芥各器官 (根 、 成熟叶 、 花
序轴 、 花蕾 、 花 ) 以及幼嫩 的长 角果中分离总
RN A
, 分别用 A tZJ 和 A 3tJ 两个基因的 3’ 端非编码
区的核营酸片段为探针进行 N o r t h er n 杂交分析 ,
均能得到信号带 (图 l) , 但它们在各个不同器官中
的表达程度不 同 , A tJ Z 在根和花中有很强 的表
达 , 在 叶和花 蕾中次之 , 而在其它部位 表达很
弱 。 A tJ 了与 A tJ Z 不同之处是 , A tJ 了在根和叶中
表达量较高 , 而在花中表达较弱 , 说明它们可能
在不 同的器官有不同的功能 。 随着植株的衰老 ,
它们在器官中的表达也减弱 。 图 2 表示在拟南芥
图 1 A tZJ 和 A 3tJ 基因在拟南芥各器官中的表达
F ig
.
1 D is itr b
u it o n o f A tZJ
a dn A 3tJ g
e n e s in d i fe er
n t o r g an s o f
A ar b idop
s is
l : R o o t : 2
:
L e af ; 3 : S t e m : 4 : lF o w e r b u d ; 5 : F lo w e r : 6 : S il iq u e
.
图 2 拟南芥不同时期成熟叶中 A tZJ 的 m RN A 含量变化
F i g
.
2 hT
e e x
erP
s s io n o f A tZJ g
e n e in l e a v e s at d ifl 七r e n t g r o w th
hP a s
e s
1 : S e e d l i n g ( 2 w e e k s ) : 2 : B e fo r e b l o o m i n g (3 w e
e
k s ) : 3 :
B lo o im n g Ph a s e (4 w e ek s ): 4
:
S il iqu
e m a t u ir yt P e ir o d (5 w e
e
k s ) :
5 : S e n e s e in g Ph a s e (7 w e e ks )
.
l期 李国良等 :拟南芥A Z t J和A 乙 l了基因表达对环境胁迫的响应
不同时期成熟叶中的A t JZ的 m RNA 含量的变化 ,
tA 3J 的变化与 A tJ Z 相似 (数据没有显示 ) 。
.2 2 热激对 A 式12 和 A t了3 基因表达的影响
4 周龄的拟南芥植株在 3 7 ℃的生长箱中热激
(h e a t s h o c k
,
H S )处理 , 不 同时间 (一。 至 一2 0 m i n )
后取成熟叶片提取总 R N A , 进行 N or t h er n 分析 。
以 2 2 ℃ 生 长 条件 下 的拟 南芥 叶片为对 照 ,
N o hrt
e
m 杂交的结果 (图 3) 表明 A tZJ 与 A t3J 这两个
基因都是组成型表达的 , 在 2 2 ℃未热激时 , 它们
有很少量的表达 ; 它们在热激过程中表达的时间
进程很相似 , 热激 10 m in 后 , 表达量开始增加 ,
随着热激时间的延长 , 表达快速增加 , 60 m in 达
到最高峰 , 1 2 0 m in 时表达稍有下降 。 说 明 A tJ Z
与 A t3J 具有热激蛋白的特性 , or m in 的热激就能
诱导它们表达 的增加 。
图 4 拟南芥叶在 2℃低温胁迫过程中 A tZJ 和 A t3J 基因表达
的变化
Fi g
.
4 T h e e x P r e s s io n o f A tZJ an d A t3J g
e n e s a fet r e o ld s tr e s s
a t Z℃
l : C o n tr
o
l at 22 oC : 2 : 1 h at Z℃ : 3 : 3 h at Z℃ : 4 : 6 h a t Z oC : 5 :
9 h at Z℃ : 6 : 12 h at Z℃ .
.2 4 水分胁迫对 A tJ Z 和 A tJ 3 基因表达的影响
将 3 周龄 的拟南芥小苗小心地从琼脂培养基
中拔 出 , 放在铺有 3 层干滤纸的培养皿中进行不
同时 间的水分胁迫 , 提取全苗的总 R N A 进行
N o r t h e r n 杂交 , 结果 (图 5 )表明 : A r了2 和 A t了了对
水分胁迫有相似 的微弱反应 : 胁迫 l h 后 , 这两
个基因的 m R N A 含量有微弱的提高 , Z h 胁迫后
其 m RN A 含量明显提高 , 胁迫 4 h 时 A l j Z 和 A口3
的表达表现下 降 , 说 明水分胁迫能引起 A tJ Z 和
A tJ 3 基因表达量的变化 。
图 3 拟南芥叶在 37 ℃热激过程中 A tZJ 和 A t3J 基因表达的
变化
F i g 3 T h e e x Per s s io n ik n e tie s o f A tZJ an d A t3J g
e n e s d u n n g H S
at 37℃
l : C on t
r o ] a t 22 ℃ ; 2 : H S at 37 oC fo r 1 0 un n : 3 : H S a t 37 OC for
20 m in ; 4 : H S a t 3 7℃ fo r 30 而 n : 5 : H S at 37℃ f o r 60 m i n : 6 :
H S a t 3 7
`
C fo r 12 0 m i n
.
.2 3 冷胁迫对 A .t I Z 和 A tJ 3 基因表达的影响
为了了解 A t J Z 与 A t J 3 对冷胁迫的反应 , 将 4
周龄的拟南芥植株在 2 ’ C 的培养箱中进行冷胁迫 ,
提取叶片的总 R N A 进行 N o rt h二 杂交 , 结果见图
4
。
A tJ Z 与 A tJ 了对低温的反应也是相似的 , 短于
6 h 的冷胁迫不能引起基 因表达的改变 , 胁迫 g h
后它们的 m RN A 含量开始提高 , 12 h 的冷胁迫明
显提高了它们的 m R N A 含量 。 冷胁迫也能诱导
A tZJ 或 A tJ 3 基因表达的明显增加 , 但与热胁迫不
同的是 , 冷胁迫需要的时间 比较长 , 10 ~ 2 0 m in
的热胁迫就能引起 它们表达 的增加 , 而冷胁迫需
要 9 、 1 2 h o
图 5 拟南芥幼苗在水分胁迫过程中 A tZJ 和 A t3J 基因表达
的变化
F i g
.
5 T h
e e x P r e s s io n o f A tZJ
a n d A t3J
g e n e s d u ir n g dr o u g h t
S t f C S S
l
:
C o n tr o l ; 2
:
0 5 h 硫 e r dr o u g ht s etr s s : 3: 1 h a ft e r d r o u g h t s etr s s :
4 : Z h a fet r d r o u g h t s tr e s s : 5 : 4 h a f te r dr o u g ht s tr e s s ; 6 : s h a ft e r
dor u g h t s t r e s s
.
.2 5 盐胁迫对 A t了2 和 A t了3 基因表达的影响
将 3 周龄的拟南芥小苗小自地从培养基中拔
出 , 放在铺有 3 层滤纸的培养皿中进行不 同时间
的盐胁迫 , 滤纸事先用含有 N a CI 3 0 0 m m ol L/ 的
植物生理与分子生物学学报 31卷
H oa gln a d营养液浸饱 , 然后将小苗上沾的水分吸
干收集小苗 , 提取全苗的总 R N A 进行 N or th er n 杂
交 , 结果见图 6 : A tJ Z 和 A tJ 了基因的表达随着时
间的延长却没有明显变化 , 说明盐胁迫对 A tJ Z 和
A tJ 了基因的表达没有影响 。
图 6 拟南芥幼苗在盐胁迫过程中 A tZJ 和 A t3J 基因的表达
iF g
.
6 T h e e xP er
s s io n o f A tZJ
a n d A t3J g
e en s d盯 in g s al t s t er s s
l : C o
n tr o l ; 2 : 0
.
5 h at 300 I T u n 0 1/ L N a C I ; 3 : 1 h a t 300 m m o lL/
N aC I: 4
: 2 h a t 30 0 m l刀。 1几 N a C I : 5 : 4 h at 300 1l l ll l o UL N a C I: 6 :
8 h a t 30 0 I n l l l o l / L N a C I
.
3 讨论
A tZJ 和 A t3J 这两个基因的核昔酸序列非常相
近 , 与之对应的氨基酸序列有 95 % 的同源性 (周
人纲和 M ie m y k 1 9 9 9) 。 两个基因在表达上有很多
相近处 : 它们在各个器官中都表达 (图 l) ; 在植株
衰老过程中 , 它们的表达量都逐渐下降 (图 2) ; 在
对几种不同环境胁迫的反应中有相似的时间进程和
表达程度 (图 3一6) 。 二者区别是它们在各器官中的
表达程度不同 : A tJ Z 在根和花中有很强的表达 ,
在叶和花蕾中也有较强的表达 , 而在其它部位表
达很弱 。 而 A 3tJ 在叶中有较强的表达 , 在花中表
达较弱 , 说明它们可 能分别在不同的器官行使功
育旨。
植物在某种逆境下锻炼时 , 不仅对这种逆境
的抗性增 强 , 而且对其它 几种逆境的抗性也增
强 , 这就是交叉适应 ( e r o s s a d a p t a t i o n ) 。 已有研
究表明植物可对爹种逆境如热 、 冷 、 盐等进行交
叉适应 , 交叉适应现象的存在提示着植物各种不
同的抗逆性之间有某些共同的适应机制 。 如植物
在受到热激后 , 不仅可 以提高植物的抗热性 , 也
可 以同时提高植物的抗冷和抗重金属离子的能力
(N e u m a n n 等 1 9 9 4 : 黄上志等 2 0 0 4 ) , 热激 、 冷胁
迫都能诱导热激蛋白 7 0 的合成 (N e v e n 等 19 9 2 ) , 此
外植物对热激的响应和对氧胁迫的响应之间的关系
己有很多报告 (G o n g 等 19 9 7 : L e e 等 2 0 0 0 ; P a n e h u k
等 2 0 0 2) 。 一些分子 生物学的研究表 明 , 高温 、
冷胁迫 、 干旱或盐胁迫等不同的胁迫可 诱导植物
细胞一些相 同的基因表达 。 水分胁迫 、 脱落酸和
伤害都能诱导玉米胚轴中 H SP 7 O m R N A 水平的提
高 , 表 明玉米 h 、 p 7 口基 因能被多种胁 迫激活
(H e i k k i l a 等 19 8 4 ) 。 相同的基因参与不同的应答 ,
这是交叉适应在分子水平上的表现 。 Y a m ag uc hi -
S h i n o z a k i 和 S h i n o z a k i ( 1 9 9 4 )从一个拟南芥基因中
发现一个新的顺式作用元件 , 它对干旱 、 低温 、
高盐肋、迫都有反应 。 通过全长 c D N A 芯片技术对
拟南芥 7 0 0 0 个基因的表达分布检测发现 , 干旱 、
冷和高盐胁迫能诱导 4 种热激蛋白的表达的变化
( S e k i 等 2 0 0 2 ) 。
A jt Z 和 A 3tJ 是最早在拟南芥的细胞质中被发
现的 J 一 蛋 白家族成员 ( Z h o u 等 1 9 9 ;5 周人纲和
M i e r ny k 1 9 9 9)
,
tA ZJ 的重组蛋白能刺激玉米
H s P 7 o 的盯P 酶活性提高 10 倍 (hZ o u 等 2 0 0 0 ) , 表明它具有分子伴侣的功能 , 推测可能在植物的抗
逆性中起重要作用 。 本文中的结果表 明 , 3 7 ℃热
激在很短的时间 ( 10 m in) 就能提高拟南芥叶中 A tJ Z
的 m R N A 水平 , l h 达到最大值 , 其后表达量有
所下 降 。 A tJ 了基因对热激 的反应与 A IJ Z 基因相
似 , 说 明这两个基因都是热激 蛋白 (图 3 ) 。 在冷
胁迫诱导下 , A tZJ 和 A t了3 基因对 2 ℃也都有反应 ,
趋势基本相 同 , 但与热激相比 , 冷胁迫需要 12 h
才能明显提高这两个基因的表达量 (图 4) 。 A tZJ 和
A I了3 基因对水分胁迫也有反应 , 其 m RN A 含量在
l h 的胁迫后开始有微弱提高 , Z h 后其 m R N A 含
量稍微明显提高 , 其后表达量下降 , 说明水分胁
迫诱导 A tZJ 和 A 3tJ 基因表达量的微弱增加 (图 5 ) 。
用 N a CI 3 0 0 m m o比 对拟南芥幼苗进行盐胁迫 , 结
果 A tZJ 和 A t3J 基因的表达没有随着时间的延长表
现明显变化 , 说明盐胁迫对 tA ZJ 和 tA刀 基因的表
达没有影响 (图 6) 。 由此可见 , 3 7 ℃热激 、 2 ℃
冷胁迫和水分胁迫都能引起 A IZJ 和 A tj 3 基因的表
达变化 , 但在表达程度上有所不同 。 多种环境刺
激都能使 A tZJ 和 A t3J 基因的表达量增加 , 为植物
对环境刺激的交叉适应提供了新的证据 , 同时也
提示了 A tZJ 和 A 3tJ 基因在植物抗逆过程中的可能
作用 。 而 N a C I 3 0 0 m m o l几 胁迫对 A tJ Z 和 A 3tJ 基
1期 李国良等 :拟南芥A Z t J和A t J 3基因表达对环境胁迫的响应 5 l
因的表达儿乎没有影响 。 表明A Z t J和A t J 3基因并
不是对任何严重干扰细胞正常生理活动的刺激都产
生 反 应 。
参 考 文 献
B o he nP S
,
K
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