全 文 ：长江口低氧区沉积物表层纤毛虫多样性
及其时空变化*
赵摇 峰1,2 摇 徐奎栋1**摇 孟昭翠1
( 1中国科学院海洋研究所海洋生物分类与系统演化实验室, 山东青岛 266071; 2中国科学院大学, 北京 100049)
摘摇 要摇 利用 PCR鄄DGGE(变性梯度凝胶电泳)指纹图谱和测序技术,以及 Ludox鄄QPS(密度
梯度离心鄄定量蛋白银染色)方法,研究了 2011 年 4 月和 8 月长江口低氧区 3 个站位表层沉积
物中纤毛虫多样性及季节变化. 结果表明: 不同站位之间纤毛虫分子多样性存在显著差异
(ANOSIM分析:R=0. 896, P=0. 0001),但季节变化不显著(R=0. 043, P = 0. 207) .序列数最
多的类群为旋唇纲中的寡毛类和舞毛类纤毛虫. Ludox鄄QPS 法研究的纤毛虫活动虫体的种类
数及丰度可维持在较高的水平,且在夏季增高 2 ~ 5 倍. Ludox鄄QPS 法与 DGGE 技术检测到的
不同站位间纤毛虫多样性变化趋势基本一致.但 Ludox鄄QPS 法检测到纤毛虫活动虫种类数及
丰度随季节更替变化显著,该法检获的纤毛虫种类数高于 DGGE 条带数.长江口低氧区的纤
毛虫丰度及多样性较高,可为潜在的水母水螅体提供食物支撑.
关键词摇 纤毛虫多样性摇 长江口低氧区摇 DGGE指纹图谱摇 水母暴发
文章编号摇 1001-9332(2012)12-3441-08摇 中图分类号摇 Q958摇 文献标识码摇 A
Ciliate diversity and spatiotemporal variation in surface sediments of Yangtze River estuary
hypoxic zone. ZHAO Feng1,2, XU Kui鄄dong1, MENG Zhao鄄cui1 ( 1Department of Marine Organism
Taxonomy and Phylogeny, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071,
Shandong, China; 2University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China) . 鄄Chin.
J. Appl. Ecol. ,2012,23(12): 3441-3448.
Abstract: By using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and sequencing as well as Lu鄄
dox鄄QPS method, an investigation was made on the ciliate diversity and its spatiotemporal variation
in the surface sediments at three sites of Yangtze River estuary hypoxic zone in April and August
2011. The ANOSIM analysis indicated that the ciliate diversity had significant difference among the
sites (R=0. 896, P=0. 0001), but less difference among seasons (R = 0. 043, P = 0. 207). The
sequencing of 18S rDNA DGGE bands revealed that the most predominant groups were planktonic
Choreotrichia and Oligotrichia. The detection by Ludox鄄QPS method showed that the species num鄄
ber and abundance of active ciliates were maintained at a higher level, and increased by 2-5 times
in summer, as compared with those in spring. Both the Ludox鄄QPS method and the DGGE tech鄄
nique detected that the ciliate diversity at the three sites had the similar variation trend, and the Lu鄄
dox鄄QPS method detected that there was a significant variation in the ciliate species number and
abundance between different seasons. The species number detected by Ludox鄄QPS method was
higher than that detected by DGGE bands. Our study indicated that the ciliates in Yangtze River es鄄
tuary hypoxic zone had higher diversity and abundance, with the potential to supply food for the pol鄄
yps of jellyfish.
Key words: ciliate diversity; hypoxic zone of Yangtze River estuary; DGGE fingerprinting; jelly鄄
fish bloom.
*国家重点基础研究发展计划项目(2011CB403604)和中国科学院知识创新工程重要方向项目(KSCX2鄄EW鄄Z鄄5)资助.
**通讯作者. E鄄mail: kxu@ qdio. ac. cn
2012鄄02鄄14 收稿,2012鄄09鄄03 接受.
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 12 月摇 第 23 卷摇 第 12 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Dec. 2012,23(12): 3441-3448
摇 摇 全球许多海岸及河口都有季节性水体缺氧现
象,随着沿海营养物质输入的增加及全球气候日益
变暖,河口区域缺氧现象日益加剧[1] . 在我国,自顾
宏堪[2]报道长江口外存在低溶解氧区以来,陆续在
调查中发现了长江口外的低溶解氧现象[3-7] . 缺氧
常伴随着氨、硫化氢和颗粒有机物的增加,直接影响
浮游和底栖生物的分布和生存,最终影响整个海洋
生态系统[8-9] .
已有报道表明,低氧区的存在与日益严重的水
母暴发这一海洋生态灾害有着密切的关系. Shoji
等[10]研究发现,广岛湾底层水溶解氧浓度与海月水
母的丰度显著相关,其丰度最高值出现在低氧区域.
Ishii等[11]通过研究水母水螅体的垂直分布发现,夏
季低氧区形成时,水螅体多聚集于底层低溶解氧区
域,而其他附着生动物由于低溶氧而无法存活和富
集,因而水螅体的被捕食压力及生物间竞争压力变
小.大部分水母水螅体为附着生长、无运动能力,且
个体较小,因此在其栖息区中高密度的微型生物是
其必要的食物来源,是其种群繁殖乃至大规模暴发
的重要限制条件[12] . Kamiyama[12]通过研究海月水
母(Aurelia aurita)水螅体摄食发现,水螅体对直径
小于 20 滋m 的原生生物基本不摄食,对直径 30 滋m
的原生生物摄食率明显低于个体较大的纤毛虫,指
出纤毛虫为其重要的食物来源.因此,研究水母水螅
体潜在栖息区域的水体底层及沉积物表层纤毛虫群
落结构显得尤为重要.
由于纤毛虫个体微小,多样性高,且难于从沉积
物中分离,目前对底栖纤毛虫多样性认识十分不
足[13] .由于此部分背景研究的欠缺,实验室内研究
水螅体摄食以及寻找水螅体潜在栖息区时,缺少基
本的底栖纤毛虫数据作为参考. Xu 等[14]开发了 Lu鄄
dox鄄QPS方法,可以有效地从海洋沉积物中提取原
生动物,并结合蛋白银染色确定纤毛虫活动虫的种
类、丰度及生物量.随着分子生物学技术的不断发展
完善,分子手段已能较为全面地反映自然生境中原
生动物的群落结构. 目前,DGGE(变性梯度凝胶电
泳)图谱应用最为广泛,技术最为成熟,经过此方法
分析的序列可回收并再次扩增,测序确定该序列的
碱基组成,进而探讨其分子系统地位,既可提供研究
区域原生动物多样性基本情况,又可获得原生动物
主要类群的组成[15] .
本研究在长江口低氧区设立了 3 个研究站位,
于 2011 年 4 月及 8 月采集沉积物表层样品,结合
PCR鄄DGGE指纹图谱、测序技术及 Ludox鄄QPS 法研
究该生境中纤毛虫的分子多样性和活动虫体的种类
数、丰度及生物量.本研究结合分子生物技术及形态
学手段,从不同角度探讨长江口低氧区表层沉积物
中纤毛虫的群落结构以及空间和季节变化对其影
响,同时为寻找水母水螅体栖息区及其室内摄食试
验提供自然生境中纤毛虫数据作为参考.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 样品采集
本研究根据已有资料[5-7],在长江口低氧区内
选取 3 个站位,即 L1 (122郾 5毅 N 32. 0毅 E )、 M1
(122郾 5毅 N 31. 5毅 E)及 PN2(123. 0毅 N 30. 8毅 E) (图
1).于 2011 年 4 月及 8 月,搭载中国科学院海洋研
究所 973 水母专项航次,对低氧区选定站位进行调
查.利用 0. 1 m2改造型 Gray鄄Ohara 箱式采泥器在每
一个选定站位采集 3 箱沉积物样品,每箱样品中用
小勺刮取表面 0 ~ 1 cm 沉积物,置于干净的封口袋
中,冻存于-20 益,带回实验室用于 DNA提取.同时
利用内径 2. 3 cm 的注射器改造的采样管采集芯样
6 个(每箱取 2 个),取表层 0 ~ 2 cm 沉积物,其中 3
个芯样分别置于样品瓶中,加入等体积的冷戊二醛
固定(终浓度 2% ),用于纤毛虫活动虫种类数、丰度
及生物量分析;另外 3 个芯样混合后置于封口袋中,
冻存于-20 益,带回实验室用于沉积物粒径、有机质
含量、叶绿素 a 及脱镁叶绿素 a 分析. 水深、底层水
温度及盐度由随船温盐深测定仪(SeaBird)现场测
定;沉积物粒度分析采用 Cilas (940 L)测定;有机碳
采用 Vario TOC Cube (Elementar, Germany)测定,有
机质含量为有机碳含量乘以系数 1. 724;叶绿素及
脱镁叶绿素含量利用 Turner II荧光光度计测定.
图 1摇 调查站位图
Fig. 1摇 Map of three sampling sites.
2443 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
表 1摇 采样站位(M1、L1、PN2)4 月(04)和 8 月(08)的底栖环境因子
Table 1摇 Benthic environmental factors of the sampling sites (M1, L1, PN2) in April (04) and August (08)
处理
Treatment
水深
Depth
(m)
底层水温度
Bottom water
temperature (益)
底层水盐度
Bottom water
salinity
沉积物中有机质
Organic matter
(% )
沉积物叶绿素 a
Chl a
(滋g·g-1)
沉积物脱镁
叶绿素 a Ph a
(滋g·g-1)
沉积物中值粒径
Median grain size
(滋m)
M104 25 11. 38 32. 46 0. 27 0. 68 0. 78 185. 18
M108 25 22. 40 31. 85 0. 23 0. 64 1. 67 27. 53
L104 18 - - 0. 18 0. 11 0. 66 40. 16
L108 18 24. 40 30. 06 0. 31 0. 68 1. 54 34. 10
PN204 42 13. 41 33. 58 0. 30 1. 25 3. 40 8. 60
PN208 42 21. 10 32. 60 0. 29 0. 67 1. 82 45. 91
- 数据缺失 Absent data.
1郾 2摇 DNA提取及 PCR
沉积物环境总 DNA 提取采用 Ultraclean soil
DNA isolation kit (MO鄄BIO,USA),18 个样品(3 个
站位两季节,且各有 3 个重复)各取 0. 6 克用于
DNA提取,具体提取方法参照使用说明(MO鄄BIO,
USA).以总 DNA为模板对纤毛虫的 18S rRNA基因
进行巢式 PCR扩增[16-17],扩增引物参照文献[17]:
CilF、CilF鄄GC、CilDGGE鄄r、 CilR I、 II 和 III (表 2).
PCR 反应体系组成如下:正向反向引物各 0郾 3
滋mol·L-1,1伊 PCR TaqMIX (50 mmol·L-1 KCl;10
mmol·L-1 Tris鄄HCl; 1. 5 mmol · L-1 MgCl2; 200
滋mol·L-1 dNTP mix;0. 05 U·滋L-1 Taq DNA poly鄄
merase) (东胜, 中国),约 40 ng 的模板 DNA,最后
加灭菌双蒸水补齐至 25 滋L. PCR 反应采用巢式
PCR程序,第一轮反应,引物 CilF、CilR 玉、域 和芋:
95 益预变性 5 min;然后 94 益变性 45 s,58 益退火 1
min,72 益延伸 l min,共 35 个循环;最后 72 益延伸
10 min 终止于 4 益 . 第 2 轮反应, CilF鄄GC 和
CilDGGE鄄r:94 益预变性 5 min;然后 94 益变性 1
min,52 益退火 1 min,72 益延伸 l min,共 26 个循
环;最后 72 益延伸 10 min终止于 4 益 .
1郾 3摇 DGGE分析及测序
DGGE在 Bio鄄Rad DCode中进行,所用胶为 6%
表 2摇 纤毛虫特异性引物及碱基序列列表
Table 2摇 Oligonucleotide sequences of ciliate鄄specific prim鄄
ers used for the ciliate nested鄄PCR
引物
Primer
碱基序列
Sequence (5忆鄄3忆)
CilF TGGTAGTGTATTGGACWACCA
CilF鄄GC [GC clamp] TGGTAGTGTATTGGACWACCA
CilR I TCTGATCGTCTTTGATCCCTTA
CilR II TCTRATCGTCTTTGATCCCCTA
CilR III TCTGATTGTCTTTGATCCCCTA
CilDGGE鄄r TGAAAACATCCTTGGCAAATG
GC clamp CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGC
GGGGCGGGGGCACGGGGGG
(W / V)的聚丙烯酰胺(丙烯酰胺 颐 双丙烯酰胺 =
37郾 5 颐 1),电泳在 1伊TAE缓冲液中进行.电泳时,具
有相同分子量的 PCR 产物会因变性剂甲酰胺和尿
素的存在具有不同的解链行为,从而得以分离.变性
剂梯度范围为 32% ~ 42% ,以 80 V 的恒定电压在
58 益电泳 16 h[17] . 电泳结束后,凝胶用 1 伊SYBR
Gold染色 30 min,最后用 1伊TAE 缓冲液漂洗一次.
在成像系统中观察电泳结果并拍照.
将回收的条带置于 20 滋L无菌水中于 4 益过夜
洗脱其中 DNA,从中取 2 滋L作模板用不含 GC夹的
CilF和 CilDGGE鄄r引物重新 PCR. 扩增产物经凝胶
电泳后切胶回收纯化. 将纯化的 DNA 片段连接到
PCR鄄2. 1 载体( Invitrogen, USA),转化至大肠杆菌
(Escherichia coli)感受态细胞.利用 PCR检测是否为
阳性克隆,再以阳性克隆的 PCR 产物再次进行
DGGE,与原来的条带在同一位置的克隆用于测序.
测序获得的纤毛虫 18S rRNA 基因序列与 NCBI 数
据库序列 BLAST比对,获得与每条序列相似性最高
的序列.所得序列全部上传至 GenBank 数据库,序
列号为: JQ291364鄄JQ291381.
1郾 4摇 纤毛虫活动虫体种类数、丰度及生物量分析
纤毛虫活动虫种类数、丰度及生物量的分析采
用 Ludox鄄QPS方法,主要步骤包括:样品淘洗降盐,
沉降浓缩,密度梯度离心提取,琼脂包埋,滤膜固化,
定量蛋白银染色,镜检分析纤毛虫活动虫体的物种
组成和丰度等[14] .纤毛虫生物量通过生物体积换算
法及转换系数计算[18] .
1郾 5摇 数据处理
DGGE指纹图谱用 Quantity鄄One(Bio鄄Rad,USA)
软件将带型转化成 1 / 0 矩阵 (1、0 分别代表条带的
有、无),进而计算 Dice 相似系数 S(S = 2nAB / (nA +
nB),nAB为 A和 B 两站点共有谱带数;nA和 nB分别
表示站点 A和 B 特有谱带数). 不同站位及不同季
节沉积物表层纤毛虫群落结构相似性通过 Dice 相
344312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 赵摇 峰等: 长江口低氧区沉积物表层纤毛虫多样性及其时空变化摇 摇 摇 摇 摇 摇
似性系数来比较,进而针对 Dice 相似性系数进行非
加权配对算术平均法聚类(UPGMA).利用 ANOSIM
分析检测纤毛虫分子指纹图谱模式在不同站位及不
同季节之间的差异. 同时针对纤毛虫活动虫体的物
种组成及丰度进行 UPGMA 聚类分析. 以上统计分
析均通过 PRMER 6v( Plymouth Marine Laboratory,
UK)软件完成. 方差分析用于检测 Ludox鄄QPS 法所
获得的纤毛虫种类数、丰度和生物量以及 DGGE 条
带数在季节上变化是否显著,纤毛虫丰度和生物量
不符合正态分布,故进行 log 转化用于统计分析.方
差分析通过 SAS 6. 12(SAS Institute Inc. , USA)软
件完成.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 纤毛虫 DGGE指纹图谱分析
针对 3 个站位两个季节的纤毛虫 18S rRNA 基
因得到了 DGGE 指纹图谱,各站位同季节的 3 个重
复基本一致. 各站位检测到的总条带数分别为 11
(M104)、15(M108)、15(L104)、16(L108)、18(PN2
04)和 20(PN208)条带(图 2). 方差分析显示,季节
变化对 DGGE 条带数影响并不显著(P = 0. 1181).
依据 DGGE指纹图谱转化而来的 1 / 0 矩阵,对上述
18 个样品的矩阵相似性进行比较.基于 Dice相似系
数的 UPGMA聚类分析显示各站位的 3 个重复均可
分别聚合.同一站位不同季节样品可分别聚在一起.
L1 和 PN2 两站位聚在一起,形成一大支,M1 站与其
他站位相似性最低,单独聚合(图3). ANOSIM分析显
示,不同站位之间存在显著差异 (R = 0郾 896,P =
0郾 0001),而季节差异不显著(R=0. 043,P=0. 207).
2郾 2摇 长江口低氧区纤毛虫分子多样性构成
对长江口低氧区纤毛虫群落的DGGE图谱中
图 2摇 纤毛虫 18S rRNA基因 DGGE指纹图谱.
Fig. 2摇 DGGE fingerprinting profile of ciliate 18S rRNA gene.
标有数字的条带用于回收测序 Bands marked with a number were se鄄
quenced.
图 3摇 基于纤毛虫 18S rRNA基因 DGGE指纹图谱的聚类分析
Fig. 3摇 Cluster analysis of samples on the basis of ciliate 18S
rRNA gene DGGE profile.
主要条带回收测序,所得序列 BLAST 比较分析的结
果表明,所有序列与数据库中纤毛虫 18S rRNA 基
因序列的相似性范围为 88% ~ 100% . 在所有相似
序列中,有 10 条属旋唇纲,占所有序列的 55郾 6% ,3
条属裂口纲,占 16郾 7% ,寡膜纲和前口纲各 2 条,分
别占 11. 1% ,还有 1 条属于未培养环境样品(表 3).
与旋唇纲相似的序列最多,尤以寡毛类和舞毛类纤
毛虫占绝对优势,且随着夏季低氧区形成,此类纤毛
虫多样性呈增加趋势,如条带 6、7、8、11、12、17 均属
舞毛类及寡毛类纤毛虫,仅出现于夏季(图 2 和表
3).其中序列 5、7、8、11、12 和 17 与已知浮游纤毛虫
序列极为相似,相似度 98% ~ 100% ,此类浮游纤毛
虫可能以包囊形式存在于沉积物表层. 值得注意的
是,其中一半序列与已知种类序列相似度较低
(<95% ),如条带 2、4、6、9、10、13、14 和 16(表 3).
2郾 3摇 纤毛虫活动虫体种类数、丰度及生物量
在调查的 3 个站位表层 2 cm 沉积物中,通过
Ludox鄄QPS法检获的不同站位之间纤毛虫形态种多
样性变化趋势与 DGGE 检测到分子多样性变化趋
势基本一致,多样性最高的站位均出现在 PN2 站
位,M1 站多样性最低,而且夏季检获的纤毛虫物种
数高于春季(表 4,图 2).通过 Ludox鄄QPS 法检获到
的纤毛虫种类数(共检获 66 种)高于 DGGE 检获
OTU数(共检获 47 个 OTU). 春季纤毛虫平均丰度
为(22. 58 依20. 24) cells·cm-3,生物量平均值为
(0郾 07依0. 052) 滋g C·cm-3,夏季纤毛虫平均丰度为
(105. 42 依 122. 55) cells·cm-3,生物量平均值为
(0郾 29依0. 30) 滋g C·cm-3 .夏季,纤毛虫活动虫体的
丰度及生物量显著增加(表 4).方差分析显示,季节
变化对纤毛虫种类数和丰度有显著影响. 基于纤毛
虫活动虫体的物种组成及丰度的聚类分析显示,L1
04 和 M104 聚合为一支,3 站位夏季样品和 PN204
聚合为一支,不同样品基本可以根据季节差异划分
为两支(图 4).
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表 3摇 DGGE分离获得的纤毛虫 18S rRNA 基因序列比对结果
Table 3摇 Phylogenetic affiliation and BLAST hit of sequenced DGGE bands of 18S rRNA gene in ciliates
序号
No.
相似序列
Best match
序列号
Accession
number
相似度
Similarity
(% )
分类地位
Taxonomic affiliation
1 未培养纤毛虫 Uncultured ciliate FJ431675 100 未知 Unknown
2 刚毛胃纤虫 Homalogastra setosa GU590870 89 寡膜纲 Oligohymenophorea
3 迷你侧盗虫 Parastrombidinopsis minima DQ393786 98 旋唇纲 舞毛亚纲 Spirotrichea Choreotrichia
4 紧缩全列虫 Holosticha diademata DQ059583 94 旋唇纲 排毛亚纲 Spirotrichea Stichotrichia
5 赤潮拟盗虫 Strombidinopsis jeokjo AJ628250 100 旋唇纲 舞毛亚纲 Spirotrichea Choreotrichia
6 斯密拟盗虫 Parastrombidinopsis shimi AJ786648 92 旋唇纲 舞毛亚纲 Spirotrichea Choreotrichia
7 黏粘筒壳虫 Tintinnidium mucicola AY143563 99 旋唇纲 寡毛亚纲 Spirotrichea Oligotrichia
8 赤潮拟盗虫 Strombidinopsis jeokjo AJ628250 98 旋唇纲 舞毛亚纲 Spirotrichea Choreotrichia
9 斜齿虫属一种 Enchelyodon sp. JF263446 94 裂口纲 钩刺亚纲 Litostomatea Haptoria
10 纺锤披巾虫 Tiarina fusa FJ858217 89 前口纲 Prostomatea
11 半球林恩虫 Lynnella semiglobulosa FJ876965 99 旋唇纲 舞毛亚纲 Spirotrichea Choreotrichia
12 急游虫属一种 Strombidium sp. AY143564 98 旋唇纲 寡毛亚纲 Spirotrichea Oligotrichia
13 刺激隐核虫 Cryptocaryon irritans AF351579 90 前口纲 Prostomatea
14 查皮克帆口虫 Pleuronema czapikae EF486863 90 寡膜纲 Oligohymenophorea
15 斯氏刀口虫 Spathidium stammeri DQ411862 98 裂口纲 钩刺亚纲 Litostomatea Haptoria
16 苔藓原刀口虫 Protospathidium muscicola JF263449 88 裂口纲 钩刺亚纲 Litostomatea Haptoria
17 急游虫属一种 Strombidium sp. AY143564 99 旋唇纲 寡毛亚纲 Spirotrichea Oligotrichia
18 尖毛虫科一种 Oxytrichidae sp. EF024961 95 旋唇纲 排毛亚纲 Spirotrichea Stichotrichia
表 4摇 3 站位两个季节底栖纤毛虫的种类数、丰度及生物量
Table 4 摇 Number of species, abundance and biomass of
benthic ciliates at three sites in two seasons
处理
Treatment
种类数
Species
number
丰度
Abundance
(cells·cm-3)
生物量
Biomass
(滋g C·cm-3)
M104 10 13. 39 0. 04
M108 19 43. 37 0. 15
L104 10 8. 57 0. 04
L108 24 26. 31 0. 09
PN204 27 45. 78 0. 13
PN208 37 246. 59 0. 63
图 4摇 基于纤毛虫物种组成和丰度的聚类分析
Fig. 4摇 Cluster analysis of samples on the basis of ciliate species
composition and abundance.
3摇 讨摇 摇 论
3郾 1摇 方法学对沉积物中纤毛虫多样性研究的影响
海洋沉积物中有十分丰富的原生动物,其单位
密度比水体浮游的高出一个甚至几个数量级[19] .
Hamels等[20]研究表明,底栖原生动物在潮间带的
代谢率约占总的原生动物和小型动物消费者的
29% ~96% .但是底栖原生动物,尤其是纤毛虫,其
个体微小且极其脆弱,多样性高,如何将其从泥沙中
有效分离、提取并进行定量分析是研究的基础[13] .
研究技术上的滞后制约着海洋底栖微型生物生态学
的开展及深入研究[21] . Xu 等[14]开发了 Ludox鄄QPS
方法,可以有效地从海洋沉积物中提取原生动物,结
合蛋白银染色可以鉴定大部分类群的种属地位. 采
用该方法首次开展了青岛湾潮间带及黄海陆架区底
栖纤毛虫等原生动物的种类组成、现存量及变动研
究[22-23] .但该技术需要良好的分类学基础,以完成
对纤毛虫等原生动物的种类鉴定. 而且该技术无法
评价原生动物包囊的种属地位,而包囊则是潜在多
样性的重要组成部分.
DGGE技术可结合测序技术确定相应条带的种
属地位,避免形态鉴定的困难[15] . 用于 DGGE 分析
的环境总 DNA 既来源于活动虫体也可从包囊中获
取,理论上可从整体上评价纤毛虫群落结构,并结合
RNA技术研究活动虫体的类群构成,进而区分活动
虫体与包囊[24] . DGGE可以根据不同条带的变性临
界点将其有效地分开,如本研究中相似度极高的序
列分布于不同条带(条带 12 和 17;5 和 8).此外,设
计类群专一性的引物,可增强该技术的分辨率.本研
究采用纤毛虫特异性引物,获得了较为丰富的条带.
544312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 赵摇 峰等: 长江口低氧区沉积物表层纤毛虫多样性及其时空变化摇 摇 摇 摇 摇 摇
但是 DGGE技术存在局限,由于不同序列存在共迁
移现象,导致对多样性的低估[25] . 本研究通过
DGGE技术获得的条带数少于 Ludox鄄QPS 方法检测
到的种类数. 而且由于不同生物个体的 18S rRNA
基因的拷贝数不同,以及 PCR 扩增的偏好性,通过
DGGE技术不能定量描述生物的群落结构[24] .
本研究结合分子手段(DGGE技术)和形态学手
段(Ludox鄄QPS法)从不同角度探讨沉积物中纤毛虫
群落结构及其季节变化. DGGE 技术和 Ludox鄄QPS
法检测到不同站位之间纤毛虫多样性变化趋势基本
一致,最高多样性均出现在 PN2 站位,而 M1 站多样
性最低. Ludox鄄QPS 法检测到纤毛虫活动虫种类数
及丰度受季节变化影响显著,表明此区域沉积物表
层纤毛虫的活动虫体多样性随季节发生明显变化.
而对 DGGE条带的 ANOVA 分析显示,其受季节变
化影响并不显著. 聚类分析也显示,同样结果:基于
DGGE 图谱的聚类分析显示,同一站位不同季节样
品可分别聚在一起,季节变化不明显;而基于纤毛虫
活动虫体的物种组成及丰度的聚类分析结果则显
示,不同样品基本可以根据季节差异划分为两支.造
成结果差异的主要原因是:DGGE 图谱不仅包含活
动虫体形式存在的纤毛虫群落的信息,还涵盖物种
的休眠包囊信息,但由于该技术自身的局限性导致
部分类群的信息缺失;且 DGGE 技术无法评价纤毛
虫丰度变化.综上所述,经典形态学研究手段与分子
生物学方法各有利弊,欲全面理解自然生境中原生
动物群落结构及其变动特点,仍需结合分子手段和
形态学手段,从不同角度深入探讨.
3郾 2摇 长江口低氧区形成与底栖纤毛虫分子多样性
及水母暴发的关系
河口区沉积物作为海洋生态系统的重要组成部
分,不仅是多种经济动物的生活场所,还是陆源污染
物入海的主要环境反应器.近几十年来,由于人为排
污活动加剧,进入长江河口地区的营养物质造成该
海区富营养化,极大地促进了这些海域的初级生产.
6—8 月长江口水温升高,有机物在底层水域的化学
和生物氧化作用导致营养盐在底层再生并消耗大量
的底层氧,此时该区域的海水稳定程度逐渐增大,阻
止表层水和底层水中溶解氧的垂直交换,从而导致
底层低氧现象,并且近些年该区的溶解氧含量呈现
明显下降趋势[5] .
低氧区的存在必然影响长江口区域的生源物质
的生物地球化学循环,同时影响该海域的生物多样
性. Breitburg等[26]指出,在低氧区,由于氧含量低且
硫化氢含量增高,使得鱼类游走并对大部分大型底
栖生物造成致命性的伤害形成“死亡区冶.而水母从
水螅体、碟状体至水母体,均可耐低氧[27] . Shoji
等[28]指出,低氧环境下,水母捕食能力明显增强.并
且在氧浓度低于 2 mg·L-1时,水母水螅体可正常存
活、增长及无性繁殖;低氧现象还可直接提高第 2 年
春季水母碟状体的生产力[29-30] . 以上研究表明,水
母具有适应低氧环境的生理基础及独特的种群增长
机制,因此水母水螅体可能在长江口低氧区存活并
繁殖.大部分水母水螅体栖息于底栖环境中,因此自
然环境中是否有支持其生长繁殖的稳定的食物来
源,是水母水螅体种群繁殖及大规模暴发的前提
条件.
目前有关长江口低氧区生物多样性研究已有一
些零星报道,涉及浮游植物、大型底栖生物、底栖细
菌及渔业资源等[31-34] . 而有关纤毛虫(水母水螅体
重要的食物来源之一)却缺少最基本的背景资料.
本研究在长江口低氧区发现较高的纤毛虫多样性,
且纤毛虫丰度及生物量较高,尤其是夏季其丰度及
生物量均明显增高,其夏季丰度平均值 ( 105
cells·cm-3) 是 南 黄 海 6 月 底 栖 纤 毛 虫 ( 26
cells·cm-3) 的 4 倍 之 多, 平 均 生 物 量 ( 0郾 29
滋g C·cm-3)也明显高于南黄海沉积物中纤毛虫平
均生物量 0郾 08 滋g C·cm-3 [23] . 与已有长江口低氧
区夏季水体中纤毛虫丰度及生物量数据相比,表层
2 cm沉积物中纤毛虫丰度较上层 40 m 水体(724
cells·L-1)高 2 个数量级,生物量也明显高于水体
纤毛虫(2. 08 滋g C·L-1)2 个数量级以上[35] .沉积
物表层纤毛虫丰度及生物量在低氧区可维持在较高
水平,且低氧层出现时反而增高,其原因可能是微型
底栖生物可以改变代谢途径而在低氧区存活,而后
生动物由于低氧而出现数量减少,进而对微型底栖
生物的捕食压力减小[26],且 8 月底层水温度升高,
促进了纤毛虫生长.
对长江口低氧区纤毛虫群落的 DGGE 图谱中
主要条带进行回收测序,所得序列 BLAST 比较分析
结果表明,寡毛类及舞毛类纤毛虫占绝对优势. Do鄄
herty等[36]指出,表层沉积物中寡毛类及舞毛类纤
毛虫包括潮间带种类、浅水底栖种类以及可在沉积
物和水体中自由游动的种类. 本研究获得的该类群
的大部分序列与水体中已发现的浮游种类极为相
似,可能是长江口区域低氧形成等造成水体恶化,导
致部分浮游纤毛虫形成包囊并栖息于沉积物表层.
此类以包囊状态存在浮游纤毛虫待水体质量好转后
6443 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
可脱包囊成活动虫体,进而参与到海洋生态系统的
物质循环及能量流动,这也表明此区域沉积物的表
层不仅蕴藏极为丰富的底栖纤毛虫,同时还可以作
为浮游纤毛虫的重要“物种储备库冶.
综上所述,长江口低氧区表层沉积物中纤毛虫
多样性较高,其活动虫丰度及生物量可维持在较高
的水平,高密度的纤毛虫活动虫体可作为支撑水母
水螅体的食物来源之一. 一些浮游寡毛类及舞毛类
纤毛虫在环境条件恶化(如缺氧)时,可形成包囊储
存于沉积物中,成为区域内纤毛虫多样性的潜在物
种储备库.分子手段和形态学手段的结合,有助于从
不同角度探讨并理解自然生境中纤毛虫的群落结构
与变动特点.
致谢摇 李承春、丁军军、王璐、中国科学院海洋所李新正研究
员课题组及“科学三号冶科学考察船的船员在采样时给予大
力帮助,天津科技大学魏浩教授课题组提供 CTD数据,谨致
谢忱.
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作者简介摇 赵摇 峰,男,1987 年生,博士研究生.主要从事盐
碱地及近海沉积物中纤毛虫群落结构及分子多样性研究.
E鄄mail: zhaofeng198710@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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