全 文 ：微生物甲烷氧化反硝化耦合反应研究进展*
朱摇 静1 摇 袁梦冬1 摇 刘晶静2 摇 黄孝肖1 摇 吴伟祥**
( 1 浙江大学环境工程系, 杭州 310058; 2 江西理工大学建筑与资源工程系, 南昌 330013)
摘摇 要摇 甲烷氧化反硝化耦合过程是连接碳循环和氮循环的重要桥梁.该过程的深入研究有
助于完善人们对全球碳氮生物化学循环的认识.甲烷作为反硝化外加气体碳源,既能调控大
气甲烷平衡,有效减缓由甲烷引起的温室效应,又能降低反硝化工艺中因投入外加碳源带来
的成本.因此近年来甲烷氧化反硝化耦合反应及其机理研究倍受关注.本文主要讨论了好氧
和厌氧两种类型的甲烷氧化反硝化过程,重点对其微生物耦合反应机理及其影响因素进行了
综述,同时指出了其工程化应用存在的问题,并对其应用前景提出展望.
关键词摇 好氧甲烷氧化反硝化摇 厌氧甲烷氧化反硝化摇 微生物机理摇 影响因素
文章编号摇 1001-9332(2013)12-3617-08摇 中图分类号摇 X52摇 文献标识码摇 A
Research progress in microbial methane oxidation coupled to denitrification. ZHU Jing1,
YUAN Meng鄄dong1, LIU Jing鄄jing2, HUANG Xiao鄄xiao1, WU Wei鄄xiang1 ( 1Department of Envi鄄
ronmental Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2Department of Architectur鄄
al and Resources Engineering, Jiangxi University of Science and Technology, Nanchang 330013,
China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2013,24(12): 3617-3624.
Abstract: Methane oxidation coupled to denitrification is an essential bond to connect carbon鄄 and
nitrogen cycling. To deeply research this process will improve our understanding on the biochemical
cycling of global carbon and nitrogen. As an exogenous gaseous carbon source of denitrification,
methane can both regulate the balance of atmospheric methane to effectively mitigate the greenhouse
effect caused by methane, and reduce the cost of exogenous carbon source input in traditional
wastewater denitrification treatment process. As a result, great attention has being paid to the me鄄
chanical study of the process. This paper mainly discussed the two types of methane oxidation cou鄄
pled to denitrification, i. e. , aerobic methane oxidation coupled to denitrification (AME鄄D) and
anaerobic methane oxidation coupled to denitrification (ANME鄄D), with the focus on the microbio鄄
logical coupling mechanisms and related affecting factors. The existing problems in the engineering
application of methane oxidation coupled to denitrification were pointed out, and the application
prospects were approached.
Key words: aerobic methane oxidation coupled to denitrification (AME鄄D); anaerobic methane
oxidation coupled to denitrification (ANME鄄D); microbial mechanism; affecting factor.
*公益性行业(农业)科研专项(201303091)和国家水体污染控制与
治理科技重大专项(2012ZX07101012,2008ZX07101鄄006)资助.
**通讯作者. E鄄mail: weixiang@ zju. edu. cn
2013鄄02鄄01 收稿,2013鄄09鄄10 接受.
摇 摇 甲烷是一种重要的温室气体,对全球温室效应
影响显著,因此受到了研究者的广泛关注. 据统计,
全球所有排放源每年向大气排放 430 ~ 600 Tg 甲
烷,其中约 70%来自于垃圾填埋场、污水处理厂、石
油燃烧等人为排放源[1-4] . 尽管海洋、湿地、土壤等
自然生境也会产生大量甲烷,但是由于生境中甲烷
氧化菌的广泛存在,使得最终进入大气的甲烷量远
远小于产生量[3-8] .因此,甲烷氧化菌是甲烷进入大
气的重要屏障,利用它降低人为源向大气排放的甲
烷量,对于缓解全球温室效应具有潜在价值.研究发
现,在氮素丰富的生境中,甲烷氧化往往伴随着硝态
氮和亚硝态氮的还原.这一现象于 20 世纪 70 年代
在实验室条件下首次得到证实[9-10] .甲烷氧化反硝
化耦合反应使得人为源产生的甲烷可用于废水脱氮
处理,也为大气甲烷浓度控制和废水氮素脱除提供
了新思路.实现甲烷氧化与反硝化脱氮反应的耦合,
不仅能够显著降低污水处理过程中温室气体甲烷的
排放,而且大大降低了反硝化处理工艺中因投入外
应 用 生 态 学 报摇 2013 年 12 月摇 第 24 卷摇 第 12 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Dec. 2013,24(12): 3617-3624
加碳源带来的成本,尤其对低碳氮比废水的反硝化
脱氮过程具有重要意义. 由于具有潜在的显著环保
优势与经济优势,甲烷氧化反硝化过程及其机理研
究成为近年来废水处理新工艺与技术研究的热点.
不仅如此,甲烷氧化反硝化过程是连接碳循环和氮
循环的重要桥梁,该过程的发现与研究有助于完善
人们对全球碳氮元素生物地球化学循环的认识.
目前为止,研究者普遍认为,甲烷氧化反硝化耦
合过程可分为好氧甲烷氧化反硝化( aerobic meth鄄
ane oxidation coupled to denitrification,AME鄄D)和厌
氧甲烷氧化反硝化(anaerobic methane oxidation cou鄄
pled to denitrification,ANME鄄D)两种类型.其中好氧
甲烷氧化反硝化过程于 1978 年被 Rhee等[10]和Me鄄
schner等[11]证实.而厌氧甲烷氧化反硝化现象虽早
有预言,但直到 2006 年才由 Raghoebarsing 等[12]在
实验室条件下首次证实,并由 Ettwig 等[13]发现厌氧
环境中存在同时具有甲烷氧化与反硝化两种功能的
微生物.自此,微生物甲烷氧化反硝化耦合反应受到
了更为广泛的关注并取得了一系列的进展,也为推
进其工程化应用研究奠定了良好的基础. 本文主要
讨论了 AME鄄D 和 ANME鄄D 两个过程,重点综述了
这两个过程的微生物耦合反应机理及其影响因素的
研究进展,并对其今后的研究以及工程化应用前景
提出了展望.
1摇 甲烷氧化与反硝化微生物及其特性
1郾 1摇 好氧甲烷氧化菌
好氧甲烷氧化菌是在有氧条件下,以甲烷作为
唯一碳源和能源的微生物.它们广泛存在于湖泊、河
流、稻田、海洋、泥炭地[7]、泥沼[14]、湿地[15]和其他
一些极端环境等自然或人工环境中[5] . 根据(G +
C)% 、细胞结构、胞质内膜精细结构、甲醛代谢途径
和其他一些生理特征的不同,可将好氧甲烷氧化菌
分成玉型、域型以及 X 型,主要分布于 琢鄄变形杆菌
门和 酌鄄变形杆菌门[16-19] . 但是后续的研究表明,以
上分类并不能囊括所有已知的甲烷氧化菌. 研究发
现,环境中存在同时具有玉型和域型特征磷脂脂肪
酸的甲烷氧化菌,如 Methylocystis heyeri[20]、Methylo鄄
thermus subterraneus[21]和 Methylothermus thermalis[22]
等.最近又有研究发现了一些新种,比如疣微菌门
(Verrucomicrobia)甲基嗜酸菌科甲烷氧化菌,以及
Methylokorus infernorum 和 Acidimethylosilex fumaroli鄄
cum[23-24] .因此,好氧甲烷氧化菌的分类以及分类标
准将会随着新种的不断发现而日臻完善.
1郾 2摇 厌氧甲烷氧化菌
厌氧甲烷氧化( anaerobic oxidation of methane)
是在厌氧情况下进行的甲烷氧化过程. 20 世纪 60
年代人们就发现自然环境中存在厌氧甲烷氧化的现
象.海底沉积物是该过程最早的研究对象,同时也是
目前研究最多的生境.随着研究范围的不断扩大,研
究者发现厌氧甲烷氧化现象广泛存在于各种环境
中,包括海底沉积物、土壤、地下水和河底沉积物
等[6,25-26] .
根据电子受体的不同,厌氧甲烷氧化过程可分
为 3 类:硫酸盐还原型厌氧甲烷氧化( sulphate鄄de鄄
pendent anaerobic methane oxidation,SAMO)、反硝化
型厌氧甲烷氧化( denitrification鄄dependent anaerobic
methane oxidation,DAMO)和最近由 Beal 等[27]发现
以 Fe3+ / Mn4+作为最终电子受体的厌氧甲烷氧化.
SAMO主要存在于海洋中,由厌氧甲烷氧化古菌
(anaerobic methanotrophic archaea,ANME)和硫酸盐
还原细菌(sulphate鄄reducing bacteria,SRB)共同完成
甲烷厌氧氧化. 根据系统发育地位,可将 ANME 分
为 3 个类群:ANME鄄1、ANME鄄2 和 ANME鄄3. 然而,
Milucka等[28]的研究指出,ANME鄄2 具有还原硫酸盐
的功能,S0是其还原路径中的中间产物,但该理论还
需进一步研究证实. DAMO主要发生于淡水环境,如
淡水沉积物和人工污水处理系统,DAMO 过程最初
被认为由细菌与古菌联合完成,后来被证明可以由
细菌单独完成[12,29] . 本文的讨论以 DAMO 为主,若
无特别说明,厌氧甲烷氧化菌均指反硝化型厌氧甲
烷氧化菌.
Smith等[30]最先在自然环境中发现 DAMO 的
存在,但是由于厌氧条件难以控制,其功能微生物富
集培养研究进展比较缓慢. 因此,关于 DAMO 过程
微生物的生理生化特性研究也一度处于停滞状态.
直到 2006 年, Raghoebarsing 等[12] 才成功地采用
SBR反应器富集到 DAMO 微生物. 试验结果表明,
反应器中的菌群由两类微生物组成:占主导地位却
难于培养的细菌和另一类被称为 AAA[AOM(anae鄄
robic oxidation of methane)鄄associated archaea]的古
菌,它们与 ANME鄄2 和产甲烷菌具有较远的亲缘关
系.但 Ettwig等[29,31]在进一步富集 DAMO培养物的
过程中发现,厌氧甲烷氧化反硝化过程可以由属于
NC10 门的细菌单独完成,并成功富集到不包含古菌
的 DAMO细菌培养物. Ettwig等[13]将该类细菌命名
为‘Candidatus Methylomirabilis oxyfera爷. Wu 等[32]分
析了 M. oxyfera的细胞结构,发现该微生物的细胞
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形状呈多边形,没有胞内膜结构,胞外具有由蛋白质
构成的外鞘.这与已发现的好氧甲烷氧化菌有明显
的区别.
近年来,越来越多的研究开始关注 NC10 门的
细菌,特别是 M. oxyfera. Hu 等[33]用淡水湖底沉积
物、厌氧消化污泥和污水处理厂回流污泥的混合物
成功富集到 DAMO 微生物. Luesken 等[34]采用分子
生物技术对来自 10 个不同污水处理厂的污泥样品
进行鉴定,发现其中 9 个样品都含有与 M. oxyfera
高度相似的 NC10 门细菌. Kojima 等[35]在河流表层
沉积物中也检测到了与 M. oxyfera相关的细菌的存
在.此外,Zhu 等[36]以矿养型泥炭沼泽样品为接种
物,成功富集到一种与 M. oxyfera 的 16S rRNA 和
pmoA基因序列相似度分别小于 96%和 88%的细
菌.它构成了 NC10 门的一个新的分支,是一种新的
厌氧甲烷氧化反硝化细菌. 不同生境下和不同种类
的厌氧甲烷氧化反硝化菌的发现和成功富集,表明
该类菌在自然生境中具有潜在的分布广泛性和遗传
多样性,同时也为 ANME鄄D 的机理研究奠定了
基础.
1郾 3摇 反硝化菌
反硝化作用是以 NO3 -或 NO2 -作为最终电子受
体生成 N2O或 N2的生物学过程,在全球氮循环和废
水生物脱氮过程中起着重要作用. 传统的反硝化一
直被认为是厌氧或缺氧过程,主要包括硝酸盐还原、
亚硝酸盐还原、一氧化氮还原以及氧化亚氮还原等
生化反应[37-39] . 20 世纪 80 年代,自然生境中好氧反
硝化菌的发现[37]对于人们正确认识反硝化过程以
及该过程的工程化产生了重大影响.
好氧反硝化菌是在有氧条件下,利用好氧反硝
化酶———周质硝酸盐还原酶(periplasmic nitrate re鄄
ductase, NAP) [40-41],催化进行反硝化作用的一类微
生物,即 O2和 NO3 -均可作为该过程的电子受体,例
如 Thiosphaera pantotropha、Alcaligenes faecalis、Pseud鄄
omonas putida、Pseudomonas stutzeri[42] .研究发现,好
氧反硝化菌广泛存在于土壤、池塘、沉积物、污水处
理厂中的废水处理系统等环境中[40,42-44] . 尽管如
此,目前仅在细菌中发现存在有好氧反硝化现象,在
放线菌和真菌中尚未见报道. 好氧反硝化细菌主要
包括假单胞菌属(Pseudomonas spp. )、产碱杆菌属
(Alcaligenes spp. )、副球菌属(Paracoccus spp. )和芽
孢杆菌(Bacillus spp. )等,属于好氧或兼性好氧异养
微生物[45] .
2摇 微生物好氧甲烷氧化反硝化耦合反应机理及其
影响因素
2郾 1摇 AME鄄D反应机理
目前,绝大部分学者都认为好氧甲烷氧化反硝
化作用由两类微生物共同完成:甲烷氧化菌氧化甲
烷并释放可溶性有机物,反硝化菌利用这些有机物
作为电子供体进行反硝化. Rhe 和 Fuhs[10]在 1978
年首先提出甲烷氧化与反硝化之间的耦合关系,并
且分离出了好氧甲烷氧化菌(Methylomons sp.)、好
氧甲醇氧化菌(Vibrio extorquens)以及一株以琥珀酸
盐为碳源的反硝化菌 Pseudomonas stutzeri.研究者分
别以分离出的甲烷氧化菌和甲醇氧化菌的培养沥出
液(主要成分是柠檬酸盐)作为基质进行反硝化菌
的培养,结果发现,两种情况下都能检测到硝酸盐的
去除和氮气的产生.因此得出结论:反硝化菌能够利
用甲烷和甲醇氧化菌释放出的柠檬酸盐进行反硝化
作用.但是文中没有对反硝化过程是好氧还是厌氧 /
缺氧进行探究,也缺少对好氧条件下甲烷及氮素的
代谢路径的清晰阐释.
此后,研究者在各种不同的体系或环境中都观
察到了好氧甲烷氧化和反硝化耦合的现象[46-49] .
Costa等[46]分析了限制氧浓度情况下反硝化固定床
反应器中甲烷氧化反硝化现象. 反应器中富集了大
量好氧甲烷氧化菌和乙酸盐降解反硝化菌以及少量
甲醇降解反硝化菌,且大部分甲烷氧化菌属于域型.
随后,研究者利用13C鄄NMR(核磁共振)研究了富集
培养得到的甲烷氧化菌菌株的代谢机制,结果在低
氧浓度下检测到了含有13C 标记的乙酸的生成. 据
此推测,域型甲烷氧化菌在限制氧浓度下氧化甲烷
经丝氨酸途径同化甲醛释放出乙酸,作为反硝化菌
的直接电子供体. Knowles[49]认为,在好氧情况下,
甲烷氧化菌除了给反硝化菌提供电子供体和能量以
外,甲烷氧化过程中氧气的消耗为反硝化菌提供了
一个更适合其生长的缺氧微环境. 由于体系中氧气
的存在,其中的反硝化过程究竟是好氧还是厌氧,至
今尚未有明确定论.目前,关于其中的反硝化机理存
在两种假设[9,50]:
1)反硝化由传统的厌氧反硝化菌完成,发生于
AME鄄D 反 应 器 中 的 厌 氧 /缺 氧 微 环 境. 例 如
Knowles[49]的研究中对反硝化现象的解释:微生物
絮体中心厌氧 /缺氧区域或生物膜内部的缺氧区进
行反硝化,絮体周围包裹着好氧甲烷氧化菌进行甲
烷氧化.
916312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 朱摇 静等: 微生物甲烷氧化反硝化耦合反应研究进展摇 摇 摇 摇 摇
2)反硝化由好氧反硝化菌完成,例如 Pseudo鄄
monas aeruginosa 和 Pseudomonas stutzeri 等. 刘晶
静[51]在较高溶解氧浓度(3. 96 mg·L-1)下接种好
氧甲烷氧化反硝化污泥,观察到明显的反硝化现象,
推测其中存在较高氧耐受性的好氧反硝化菌,但还
需进一步验证.
目前,好氧甲烷氧化反硝化耦合现象研究相对
较多.多数研究者认为,甲烷在反硝化过程中充当间
接电子供体,即先被好氧甲烷氧化菌氧化,释放出的
可溶性简单有机物充当反硝化菌的直接电子供体.
释放出的可溶性有机物种类因环境样品和培养条件
的不同而有所差异,如甲醇、乙酸、柠檬酸盐、蛋白质
等[10,46,48] .后续研究工作可以围绕碳氮元素在甲烷
氧化反硝化微生物体内的具体代谢路径和反硝化类
型展开,为甲烷氧化反硝化耦合反应提供更多理论
依据.另外,好氧甲烷氧化菌是否同时具有反硝化作
用也值得深入探究.
2郾 2摇 AME鄄D的影响因素
好氧甲烷氧化菌和反硝化菌是 AME鄄D 过程的
重要功能微生物,其代谢活性直接影响到 AME鄄D的
甲烷利用速率和氮素去除速率. 该过程的影响因素
包括温度、pH、甲烷和氧气的传质效率、溶解氧浓度
(dissolved oxygen, DO)、亚硝态氮或硝态氮浓度、金
属离子浓度等. 其中,DO 是影响 AME鄄D 过程的最
重要因素[9],但是溶解氧对 AME鄄D 过程的影响趋
势尚无定论. Modin 等[52]探究了 DO 对序批式半连
续反应器中甲烷氧化反硝化作用的影响,结果发现,
随着 DO 的上升,硝酸盐去除率下降. 刘晶静[51]在
利用血清瓶批次试验进行甲烷氧化反硝化富集培养
污泥的甲烷氧化活性与反硝化活性测定试验中,观
察到了相反的现象———DO 较高时的硝态氮去除速
率高于 DO较低时的硝态氮去除速率.经推测,该现
象可能是由于污泥中存在较高溶解氧耐受性的好氧
反硝化功能细菌,但这一推测还需对该种细菌进行
分离、纯化以及生理生化特性鉴定来进一步验证.另
外,Cu2+浓度会对甲烷氧化活性产生重要影响.它主
要通过调控甲烷单加氧酶(methane monooxygenase,
MMO)的表达而表现出不同的甲烷氧化活性[53-54] .
一般地,Cu2+浓度较低时,域型甲烷氧化菌表达可溶
性的甲烷单加氧酶(soluble methane monooxygenase,
sMMO);Cu2+浓度较高时,玉型甲烷氧化菌表达颗粒
状甲烷单加氧酶 ( particulate methane monooxygen鄄
ase, pMMO). Graham 等[55]认为,不同的 Cu2+浓度
会影响培养物中的甲烷氧化菌优势菌群的种类,从
而导致不同的甲烷氧化活性. van der Ha 等[56]的批
次试验表明,适量铜(0. 64 mg·L-1)的添加可以促
进 pMMO 表达,从而提高甲烷氧化活性. 从实际应
用角度来说,反应器中微生物的附着面积和甲烷的
传质效率及其利用率也会对 AME鄄D过程产生影响.
对 AME鄄D过程影响因素的深入研究,有助于创造适
合好氧甲烷氧化反硝化耦合微生物类群的生存环
境,进而使其发挥出最佳的污水脱氮处理效能.
3摇 微生物厌氧甲烷氧化反硝化耦合反应机理及其
影响因素
3郾 1摇 ANME鄄D反应机理
Islas鄄Lima等[57]在实验室条件下首次证实了
ANME鄄D过程的存在,但是该研究没有分析反应器
中的微生物菌群以提供该过程微观方面的数据支
持,机理研究更是缺乏. 近几年来,实验室条件下
DAMO培养物富集成功的案例明显增加.但由于缺
少 DAMO纯培养物,关于 ANME鄄D机理的研究尚处
于起步阶段. 目前,有两种理论可以解释 ANME鄄D
现象.其中一种是反产甲烷理论. 所谓反产甲烷理
论,就是沿着甲烷产生的逆过程进行甲烷氧化,氧化
过程中释放的电子用于硝态氮或亚硝态氮的还原.
甲烷是除苯以外最稳定的碳氢化合物.因此,在反产
甲烷机制中,甲烷的活化是最具挑战性的一步.而这
个步骤由一个被修饰过的 M 甲基辅酶还原酶
(methyl鄄coenzyme M reductase,MCR)调控,即 MCR
是一种甲烷活化酶[29] . 研究表明,厌氧甲烷氧化古
菌的基因组中含有较多的与产甲烷过程相关的酶
类[29,58],即该古菌中的甲烷氧化酶基因与产甲烷酶
基因类似.这为反产甲烷机制提供了一定的依据.但
这些酶是否在甲烷氧化过程中发挥作用尚不清楚.
Raghoebarsing等[12]用反产甲烷理论来解释试验中
观察到的厌氧甲烷氧化反硝化现象:厌氧甲烷氧化
古菌中的 MCR酶活化甲烷,将其氧化,释放出的电
子通过某种载体传递给 NC10 门细菌进行反硝化.
但 Ettwig等[29]通过试验反驳了上述观点.他们在培
养基中加入产甲烷酶活性抑制剂———溴乙烷磺酸
(bromoethane sulfonate,BES).当 BES的浓度上升至
20 mmol·L-1时,ANME鄄D 并没有受到抑制;但是当
以相同剂量的 BES 处理甲烷八叠球菌(Methanosar鄄
cina barkeri)培养物时,其产甲烷活性完全受到抑
制,几乎没有甲烷产生. 据此,他们认为反产甲烷机
制不能够很好地解释 ANME鄄D过程.
另一种理论由 Ettwig 团队提出,称为 NO 歧化
0263 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
产氧甲烷氧化途径[13,53] .这是 ANME鄄D 机理研究上
取得的突破性进展. Ettwig 团队通过 454 高通量测
序,发现所得序列中仅有 0. 02%的序列与 M. oxy鄄
fera的 16S或 23S rRNA基因序列同源性不同,并且
未发现与古菌相匹配的序列,因此推断细菌可以单
独完成厌氧甲烷氧化反硝化. 另外,基因组学、转录
组学以及蛋白质组学的研究表明,M. oxyfera 培养
物中未检测到 MCR同系物,但成功表达了好氧甲烷
氧化过程所需的所有氧化酶以及除氧化亚氮还原酶
以外的所有反硝化酶.由此,他们排除了反产甲烷途
径的可能,并推测,NO2 -被还原为 NO,2 分子 NO 受
一种未知歧化酶的催化生成 N2和 O2,生成的 O2一
部分用于甲烷氧化,另一部分用于正常的有氧呼吸
(图 1). 这个过程被称为 NO 歧化产氧甲烷氧化途
径,参与这个过程的主要细菌为 M. oxyfera.这个发
现不仅较好地解释了 ANME鄄D 机理,而且也发现了
地球上还存在一种新的生物产氧途径. 此后,Wu
等[59]利用免疫荧光定位技术检测到 M. oxyfera 中
同时存在好氧甲烷氧化过程的关键酶———pMMO和
含有细胞色素 cd1的亚硝态氮还原酶,从而证明了厌
氧情况下确实存在一种同时具有甲烷氧化和反硝化
两种功能的细菌.然而,催化 NO 生成 N2和 O2过程
发生的歧化酶至今尚未找到,这种新途径没有得到
完全验证.因此,有关该种歧化酶的探究工作亟需
开展.
3郾 2摇 ANME鄄D的影响因素
由于厌氧甲烷氧化反硝化培养物富集相对困
难,关于 ANME鄄D 过程的影响因素研究也较为缺
乏.目前,只有两个团队进行了这方面的研究.首先,
温度和氮源会影响最终富集到的厌氧甲烷氧化反硝
化微生物种类. Hu等[33]用淡水湖底沉积物、厌氧消
化污泥和污水处理厂回流污泥的混合物分别在 25
益和 35 益条件下富集 DAMO 培养物,以探究温度
对 ANME鄄D的影响. 结果发现,不同温度条件下富
集得到的细菌群落以NC10门细菌为主,但古菌
图 1摇 NO歧化产氧甲烷氧化途径[13]
Fig. 1 摇 Pathway of NO disproportionation to generate O2 and
methane oxidation[13] .
群落结构有所不同:35 益条件下能检测到古菌,而
25 益时则无法检出.他们又分别以 NO2 -和 NO3 -为
氮源,进行 DAMO 微生物的富集培养. 当基质中的
氮源为 NO2 -时,培养物以 NC10 门细菌为主;当氮
源为 NO3 -时,培养物中古菌数量明显增多. 因而推
测,古菌存在的作用是将 NO3 -转化成 NO2 -,继而
NC10 门细菌再将 NO2 -进一步还原,同时对古菌及
其自身起到解毒作用(过高的 NO2 -浓度会抑制微生
物生长及其活性) [60],古菌和细菌在生态系统的氮
循环中发挥着各自不同的作用.其次,氧气也是影响
ANME鄄D的重要因素. Luesken 等[61]探究了氧气对
M. oxyfera的影响,并利用 cDNA Illumina 测序及转
录组学技术从基因及其表达角度分析了其中的机
理.他们将 M. oxyfera分别暴露于 2%和 8% O2的环
境中,结果发现,甲烷和亚硝态氮的转化率均立即降
低,说明微量氧对该细菌的甲烷氧化反硝化功能具
有抑制作用.转录组学研究发现,暴露于氧气的 M.
oxyfera与缺氧对照相比,与甲烷氧化反硝化有关的
基因在转录过程中有 50%发生了显著变化,导致相
关酶的表达水平降低,从而使甲烷和亚硝态氮的转
化率下降.该研究表明,虽然厌氧甲烷氧化反硝化中
存在着完整的好氧甲烷氧化途径,但是 M. oxyfera
的氧耐受限很低,仅限于自身产氧水平,外加氧气还
是会对其细胞产生毒害作用[34] .
4摇 甲烷氧化反硝化耦合反应在工程化应用上存在
的问题
摇 摇 目前,甲烷氧化反硝化废水处理工艺主要集中
在理论研究和实验室规模的废水处理阶段. 甲烷传
质效率以及微生物生长速率等其他方面的问题限制
了该工艺在工程上的应用与推广. 对于 AME鄄D,实
现其工程化应用还存在以下一些亟待解决的问题:
1)降低 C / N,提高脱氮效率;2)改善供气方式以避
免可燃气体混合存在的安全隐患;3)优化反应器设
计,以提高甲烷和氧气利用速率. Modin 等[62]通过
改进生物膜反应器———中空纤维生物膜反应器,不
仅为微生物大量附着生长提供了空间,也显著提升
了甲烷的传质效率,具有潜在的应用前景. 相对于
AME鄄D的高 C / N,ANME鄄D 的 C / N 较低,甲烷的利
用效率较高.然而,厌氧菌生长速率缓慢,倍增时间
长,限制了该过程的工程化应用.随着科技的发展和
对甲烷氧化反硝化耦合反应机理认识的加深,工程
化应用的瓶颈问题将逐步被攻克,该工艺在厌氧消
化出水、受“三氮冶严重污染的地下水、畜禽养殖废
126312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 朱摇 静等: 微生物甲烷氧化反硝化耦合反应研究进展摇 摇 摇 摇 摇
水等其他一些低 C / N 水体的氮素去除上将发挥出
显著优势.
5摇 结语与展望
甲烷氧化与反硝化的耦合反应类型主要包括好
氧甲烷氧化反硝化(AME鄄D)和厌氧甲烷氧化反硝
化(ANME鄄D). 与 ANME鄄D 相比,AME鄄D 的研究相
对较多,目前公认的机理是它由两类微生物共同完
成,即由好氧甲烷氧化菌氧化甲烷,释放出有机物,
然后供反硝化菌利用,将 NO3 - / NO2 -还原为 N2O 或
N2,但是 C / N(CH4 消耗量 /无机氮去除量)较高.近
年来,ANME鄄D 研究也取得了很大的突破. Ettwig
等[13]提出了 NO 歧化产氧甲烷氧化途径,并找到同
时具有甲烷氧化单加氧酶和 NirS 的细菌 M. oxy鄄
fera,较好地阐明了厌氧状态下甲烷氧化反硝化耦合
机理,但 NO歧化生成 N2和 O2这一关键步骤还需进
一步研究证实.
关于 AME鄄D,今后可以开展以下研究:1)不同
条件下反硝化菌的最适底物以及甲烷氧化菌大量合
成释放这种底物的生长环境的研究;2)分离好氧甲
烷氧化菌以探究其是否同时具有反硝化功能,结合
稳定态同位素示踪技术、宏基因组、转录组学等现代
分子生物学技术研究揭示甲烷氧化反硝化过程中碳
氮代谢途径,利用免疫荧光定位等技术研究甲烷单
加氧酶及反硝化酶的结构及其在细胞体内的分布,
为甲烷氧化反硝化耦合机理提供更多的理论依据,
也为提高甲烷利用效率提供理论基础;3)结合实际
废水特点,利用物理、化学、生物等跨学科综合知识,
设计同时具有充足的微生物附着生长面积和高效甲
烷利用效率的最佳反应器,实现高效深度脱氮并将
其推向工程化应用.
关于 ANME鄄D 过程的研究重点可以包括以下
方面:1)不同的厌氧生境中 M. oxyfera 细菌的分离
及其他种属的厌氧甲烷氧化反硝化菌的分离鉴定;
2)厌氧甲烷氧化反硝化菌的分离纯化及其生理生
化特性鉴定;3)NO 歧化产氧甲烷氧化途径的深入
研究,通过找到催化 NO 歧化反应的催化酶来进一
步证实该途径;4)减少厌氧甲烷氧化反硝化菌的富
集培养时间,并通过优化反应器结构和提高甲烷传
质效率及氧化效率,推进 ANME鄄D的工程化应用.
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作者简介摇 朱摇 静,女,1990 年生,硕士研究生.主要从事固
体废弃物处理处置研究. E鄄mail: gnijuhz6250991@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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