全 文 ：CO2浓度增加对长白山森林土壤甲烷氧化影响
*
关摇 键1,2 摇 张摇 颖1**摇 史荣久1 摇 李摇 慧1 摇 韩斯琴1 摇 徐摇 慧1
( 1中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室, 沈阳 110016; 2中国科学院研究生院, 北京 100049)
摘摇 要摇 大气 CO2浓度升高可能对森林土壤的甲烷(CH4)氧化速率产生影响.本文采用开顶
箱技术,对连续 6 年高浓度 CO2(500 滋mol·mol-1)处理的长白山森林典型树种蒙古栎树下土
壤 CH4氧化速率进行研究,并利用 CH4氧化菌的 16S rRNA特异性引物以及 CH4单加氧酶功能
基因引物分析了土壤中 CH4氧化菌的群落结构与数量.结果表明: CO2浓度增高后,生长季土
壤甲烷氧化量与对照和裸地相比分别降低了 4%和 22% ;基于 16S rRNA特异性引物的 DGGE
分析表明,CO2浓度增高导致两类甲烷氧化菌的多样性指数降低;CO2浓度增高对土壤中玉类
甲烷氧化菌数量无显著影响,而使土壤中域类甲烷氧化菌数量显著减少,功能基因 pmoA拷贝
数与对照和裸地相比分别降低了 15%和 46% . CO2浓度增高导致森林土壤甲烷氧化菌数量与
活性降低,土壤含水量的增加可能是导致这一现象的主要原因.
关键词摇 温带森林土壤摇 CO2浓度升高摇 CH4 摇 CH4氧化菌
文章编号摇 1001-9332(2012)02-0328-07摇 中图分类号摇 Q938. 1摇 文献标识码摇 A
Effects of elevated CO2 on forest soil CH4 consumption in Changbai Mountains. GUAN
Jian1,2, ZHANG Ying1, SHI Rong鄄jiu1, LI Hui1, HAN Si鄄qin1, XU Hui1 ( 1Key Laboratory of Pol鄄
lution Ecology and Environmental Engineering, Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of
Sciences, Shenyang 110016, China; 2Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing
100049, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23(2): 328-334.
Abstract: Elevated atmospheric CO2 concentration may affect the oxidation rate of methane (CH4)
in forest soil. In this study, the effects of a 6鄄year exposure to elevated CO2 concentration (500
滋mol·mol-1) on the soil microbial process of CH4 oxidation under Quercus mongolica seedlings
were investigated with open top chamber (OTC), and specific 16S rRNA and pmoA gene fragment
primers were adopted to analyze the diversity and abundance of soil methanotrophs. Comparing with
that under ambient CO2 and open鄄air, the soil methane consumption under elevated atmospheric
CO2 during growth season was reduced by 4% and 22% , respectively. The specific 16S rRNA
PCR鄄DGGE analysis showed that under elevated CO2, the community structure of methane鄄oxidizing
bacteria (MOB) changed, and the diversity index decreased. Elevated CO2 concentration had no
distinct effects on the abundance of Type玉 MOB, but decreased the amount of Type域 MOB signif鄄
icantly. The pmoA gene copy number under elevated CO2 concentration decreased by 15% and
46% , respectively, as compared with that under ambient CO2 and open鄄air. Our results suggested
that elevated atmospheric CO2 decreased the abundance and activity of soil methanotrophs, and the
main cause could be the increase of soil moisture content.
Key words: temperate forest soil; elevated CO2 concentration; methane; methanotrophs.
*国家自然科学基金重点项目(40930107)、国家重点基础研究发
展规划项目 ( 2011CB403205 ) 和国家自然科学基金面上项目
(30670390)资助.
**通讯作者. E鄄mail: yzhang@ iae. ac. cn
2011鄄04鄄19 收稿,2011鄄11鄄29 接受.
摇 摇 由于人类活动特别是工业活动的增加,大气
CO2浓度正在逐年增加. CH4是另一种重要的温室气
体,其单分子的温室效应效率(即 1 分子气体吸收
红外辐射的热量)比 CO2更强,对全球温室效应的贡
献率达到了 20% [1] .由于 CH4排放源的增强和汇的
减弱,近 200 年来,CH4在大气中的含量以每年 1%
的速度急剧增加[2] .
土壤 CH4氧化细菌(methane鄄oxidizing bacteria,
MOB)的氧化作用是大气 CH4的生物汇,约占大气
CH4汇的 10% [3] . CH4氧化菌广泛分布于土壤、沉积
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 2 月摇 第 23 卷摇 第 2 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Feb. 2012,23(2): 328-334
物和水环境中,主要分成两大类,一种是对 CH4亲和
力相对较高的利用磷酸核酮糖途径氧化 CH4的玉类
甲烷氧化菌(Type玉MOB),另一种是亲和力相对较
低的利用丝氨酸途径氧化 CH4的域类甲烷氧化菌
(Type域MOB) [4] . 有研究表明,大气 CO2浓度持续
增加,通过促进植物的生长发育及植物根系分泌,可
以间接影响土壤微生物生物量、群落结构及代谢功
能,包括土壤的 CH4氧化速率[5-8] .美国学者 McLain
等[9]以及 Dubbs和 Whalen[10]在北卡罗莱纳州的杜
克森林(Duke forest)发现,在 CO2浓度增加(高于大
气浓度 200 滋mol·mol-1 )的情况下,森林土壤的
CH4氧化能力受到明显抑制.
长白山位于中国吉林省的东南部 (41毅 35忆—
42毅25忆 N,127毅 40忆—128毅16忆 E),是典型的温带森
林,对研究全球变化的响应与调控具有重要意义.本
文选取利用开顶箱技术(open鄄top chambers, OTC)对
连续 6年进行 CO2熏蒸处理的蒙古栎(Quercus mon鄄
golica)幼苗下土壤为研究对象,研究生长季(5—10
月)大气 CO2浓度增加对温带森林土壤 CH4氧化速
率、CH4氧化菌数量与多样性的影响,为了解温带森
林土壤对全球变化的响应与反馈提供基础数据.
1摇 研究地区与研究方法
1郾 1摇 研究区概况
试验地设在中国科学院长白山森林生态系统开
放研究站(42毅24忆 N,128毅28忆 E),土壤类型为在火
山灰母质上发育的暗棕壤. 开放站内建立了一套模
拟 CO2浓度升高的开顶箱系统,其内原位种植典型
树种蒙古栎,从 2006 年开始连续进行高浓度 CO2
(500 滋mol·mol-1)熏蒸,同时设大气 CO2浓度(约
350 滋mol·mol-1)的对照开顶箱和无箱种树裸地作
为对照,每处理 3 个重复,在生长季 5—10 月昼夜进
行 CO2熏蒸处理.
1郾 2摇 土壤样品采集及理化性质分析
生长季后期(2010 年 10 月)采集土壤样品,进
行甲烷氧化菌群落结构分析和土壤基本理化性质分
析.从林下随机选取 5 个点,采集 0 ~ 10 cm土壤,混
合均匀过 1 mm 筛,测定土壤 pH 和含水量. -20 益
冰箱保存一部分土壤样品用于土壤总 DNA提取,其
余样品风干备用. 土壤有机碳含量采用 K2Cr2O7容
量法测定,土壤全氮含量采用凯氏定氮法测定[11] .
1郾 3摇 CH4通量的原位测定
采用密闭式箱法. 将直径 15 cm、高 20 cm 的
PVC无底圆筒插入土壤 4 cm深,分别在圆筒刚插入
土壤和插入后 1 h用针管抽取筒内气体样品 50 mL,
利用气相色谱仪 HP鄄5890 分析 CH4气体浓度,由筒
内气体浓度随时间的增加计算出气体交换通量
(F):
F = 驻mA驻C =
籽V驻C
A驻t = 籽h
驻C
驻t
式中:籽为气体密度;驻m 和 驻C 分别为 驻t 时间内采
集筒内增加的气体质量和混合比浓度;h、A 和 V 分
别为筒内有效空间的高、底面积和体积.测定频度为
每周 2 次,每次测定时用温度计测量 5 cm深处土壤
温度.
1郾 4摇 土壤总 DNA的提取
采用美国 MOBIO 公司土壤 DNA 提取试剂盒
PowerSoilTMDNA Isolaton Kit 进行土壤总 DNA提取,
具体步骤参见产品说明书.
1郾 5摇 采用 PCR鄄DGGE分析 CH4氧化菌的群落结构
1郾 5郾 1 PCR扩增摇 以所提土壤样品总 DNA 为模板,
选取 533f鄄MethT1bR 和与 533f鄄Am976 两对甲烷氧
化菌 16S rRNA 引物分别对 Type I MOB 和 Type II
MOB进行扩增,并在下游引物的 5爷端连接 GC鄄clamp
用于 DGGE 分析[12] . 引物序列 533f:5爷鄄GTGCCAG鄄
CAGCCGCGGTAA鄄3 爷, MethT1bR: 5 爷鄄GATTCYMTG鄄
SATGTCAAGG鄄3爷, Am976: 5 爷鄄GTCAAAAGCTGGTA鄄
AGGTYC鄄3爷,引物由上海生物工程技术服务有限公
司合成,采用 PTC鄄100TM PCR 仪 ( Waltham, MA,
USA)进行扩增.最终反应体系为:50 ng DNA 模板,
10伊PCR 缓冲液 5 滋L,2郾 5 mmol·L-1 dNTP 混合溶
液 4 滋L,20 滋mol·L-1引物各 1 滋L,Taq 酶(TakaRa
TaqTM)0郾 25 滋L,加灭菌去离子水至总体积 50滋L.
533f鄄MethT1bRgc反应程序:94 益预变性 5 min,94
益变性 1 min,60 益退火 1 min,72 益延伸 1 min,前
10 个循环退火温度每个循环降低 1 益,后 20 个循
环退火温度保持在 50 益,总计 30 个循环,最后 72
益延伸 5 min. 533f鄄Am976gc 反应程序: 94 益预变
性 5 min,94 益变性 1 min,58 益退火 1 min,72 益延
伸 1 min,共 30 个循环,72 益延伸 5 min[12] .
1郾 5郾 2 DGGE 分析 摇 采用 DCode Universal Detection
Mutation system ( Bio鄄Rad,Hercules, CA,USA)进行
DGGE分析.变性梯度为 30% ~ 60% (6%丙烯酰胺
凝胶),缓冲液为 1伊TAE缓冲液(20 mmol·L-1 Tris,
10 mmol·L-1 acetate, 0郾 5 mmol·L-1 EDTA , pH
7郾 4).将上述 PCR产物点样 20 滋L,60 益100 V进行
电泳 16 h.电泳结束后,取下凝胶,放入装有 SYBR
9232 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 关摇 键等: CO2浓度增加对长白山森林土壤甲烷氧化影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
Green玉(1 颐 10000 稀释)的 1伊TAE 缓冲液中染色
30 min. 染色胶立即采用凝胶成像系统 ( Gel Doc
2000TMChemi DocTM Gel Documentation Systems,
Bio鄄Rad)进行数据采集[12] .
采用香农指数(H忆)表征 CH4氧化菌的多样性.
H忆 = - 移
S
i = 1
P i·lnP i
式中:P i为 DGGE 图谱中第 i 条带的峰密度与所有
条带(S)总峰密度的比值.
1郾 6摇 Real鄄Time PCR定量分析 CH4氧化菌的丰度
采用 Real鄄Time PCR 技术对 MOB 的 16S rRNA
基因和 CH4氧化功能基因数量进行定量分析.
16S rRNA引物同上(不加 GC鄄clamp),CH4氧化
菌功能基因 pmoA(编码 CH4单加氧酶 A 基因)引物
选取 A189f ( 5 爷鄄GGNGACGGGACTTCTGG鄄3 爷) 和
Mb661r(5爷鄄GGTAARGACGTTGCNCCGG鄄3爷) [13] .
标准曲线的建立:分别用 3 对引物扩增所有样
品 ( 533f鄄MethT1bR, 533f鄄Am976, A189f鄄Mb661r,
Roche 480 Real鄄Time PCR 仪),每个基因的混合物
约 160 滋L,混合均匀,平均分成 3 份(50 滋L)进行纯
化,纯化产物稀释 4 倍后测定 OD值(UNICO2800 紫
外分光光度仪),并计算拷贝数.将产物梯度稀释后
进行 real鄄time PCR 扩增,3 次重复,构建标准曲线.
每个标准曲线 R2均大于 0郾 995.
Real鄄Time PCR反应体系:DNA 模板 1 滋L,引物
0郾 8 滋L (终浓度 0郾 2 滋mol·L-1 ),Master mix(2 伊)
(SYBRR Premix Ex TaqTM域, Takara)10 滋L,加超纯水
(ddH2O)补足至20 滋L.反应程序:94 益预变性1 min;
94 益变性15 s,55 益退火30 s,72 益延伸1 min,共35
个循环.每个样品 3次重复,结果取平均值.
1郾 7摇 数据处理
采用 Origin7郾 5 和 Excel 软件进行数据分析,采
用 Quantity One对 DGGE图谱进行分析.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 CO2浓度升高对土壤基本理化性质的影响
生长季土壤温度在 4 ~ 30 益之间,3 种处理生
长季平均温度均在 22 益左右,无显著性差异.由表
1 可以看出,CO2熏蒸处理土壤的总有机碳与对照相
比增加了 13% ,与裸地相比增加了 57% . CO2熏蒸
处理土壤全 N 含量最低,与对照相比降低了
15郾 6% ,与裸地相比降低了 36郾 6% .
对采集的土壤样品进行含水量的测定,发现
CO2熏蒸处理土壤平均含水量为12郾 0% ,对照的含
表 1摇 试验样地土壤基本性质
Table 1摇 Basic characteristics of the soil in sampling site
处理
Treatment
pH 总有机碳
Total organic
carbon
(% )
全氮
Total N
(mg·kg-1)
无箱种树裸地
Open鄄air control
6郾 8依0郾 1a 3郾 1依0郾 5a 6郾 32依0郾 25a
高浓度 CO2熏蒸箱
OTC under elevated CO2
7郾 0依0郾 2a 4郾 9依0郾 4b 4郾 01依0郾 33b
对照开顶箱
OTC under ambient CO2
6郾 8依0郾 1a 4郾 4依0郾 6b 4郾 75依0郾 28b
同列不同字母表示差异显著(P<0郾 05) Different letters in the same
column indicated significant difference at 0郾 05 level郾
水量为 10郾 6% ,裸地的含水量为 10郾 2% ,CO2熏蒸处
理导致土壤含水量增加,与对照和裸地处理相比分
别增加 1郾 4%和 1郾 8% . 3 种处理的土壤 pH为 6郾 8 ~
7郾 0,无显著差异.
2郾 2摇 CO2浓度升高对土壤 CH4氧化能力的影响
通过对开顶箱内土壤 CH4氧化速率的原位测定
估算生长季(5—10 月)土壤 CH4氧化量. 从图 1 可
以看出,森林土壤的 CH4氧化速率存在较大的季节
性变化,春季 CH4氧化速率高于其他季节.裸地土壤
CH4氧化速率为 0郾 01 ~ 0郾 075 mg·m-2·h-1,CO2熏
蒸处理的 CH4氧化速率明显低于对照和裸地处理,
且差异显著(P<0郾 05).对照与裸地之间也存在显著
差异(P<0郾 05),说明对照箱即使未人为补加 CO2,
CH4氧化速率也会受到明显抑制. 根据所得数据对
生长季 CH4氧化量进行估算,CO2熏蒸后蒙古栎生
长季土壤 CH4氧化量为 129郾 5 mg·m-2·a-1,与对
照处理的氧化量 135郾 3 mg·m-2·a-1相比降低了
4% ,与裸地的氧化量 165郾 8 mg·m-2·a-1相比,降
低了 22% .
图 1摇 蒙古栎样地土壤 CH4氧化速率
Fig. 1 摇 CH4 oxidation rate of soils under Quercus mongolica
seedlings郾
玉:无箱种树裸地 Open鄄air control; 域:高浓度 CO2熏蒸箱 OTC under
elevated CO2; 芋:对照开顶箱 OTC under ambient CO2 . 下同 The same
below.
033 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
图 2摇 甲烷氧化速率与温度的关系
Fig. 2摇 Relationships of temperature and the rate of methane ox鄄
idation.
2郾 3摇 土壤温度与甲烷氧化速率的关系
对土壤温度与甲烷氧化速率进行线性关系分析
(图 2 ),线性方程为: y = 0郾 01848 + 0郾 0006x, r =
0郾 259,P>0郾 05,因此,甲烷氧化速率的季节变化与
土壤温度无显著相关关系.
2郾 4摇 甲烷氧化菌群落结构的变化
两类甲烷氧化菌的 DGGE 图(图 3)显示,玉类
甲烷氧化菌(Type玉MOB)和域类甲烷氧化菌(Type
域MOB)分别有 8 条和 5 条可辨条带,不同处理条带
总数相同,但不同条带的峰密度不同,因此高浓度
CO2处理后甲烷氧化菌群落的多样性指数低于对照
和裸地(表 2). Type域MOB与 Type玉MOB相比种类
相对较少,带型也因高浓度 CO2处理而发生了改变,
原有一个条带消失,并出现一个新条带.
2郾 5摇 甲烷氧化菌数量的变化
图 4 表明,长白山森林土壤甲烷氧化菌 16S
rRNA基因拷贝数是每克 109数量级,且 Type域MOB
数量大于 Type玉MOB. 而功能基因 pmoA 拷贝数是
每克 106数量级,比 16S rRNA 拷贝数低 3 个数量
级 . CO2熏蒸对Type玉MOB基因拷贝数无显著影
图 3摇 甲烷氧化菌的 DGGE指纹图谱
Fig. 3摇 DGGE profile of MOB.
A:Type I MOB; B:Type II MOB; 1,4:高浓度 CO2箱 OTC under ele鄄
vated CO2; 2,5:对照箱 OTC under ambient CO2; 3,6:裸地 Open鄄air
control.
表 2摇 玉、域类甲烷氧化菌基因香农指数
Table 2摇 Shannon index of genes of Type玉,域 MOB
处理
Treatment
Type玉MOB
带型总数
Total band
type
(S)
多样性指数
Shannon
index
(H忆)
Type域 MOB
带型总数
Total band
type
(S)
多样性指数
Shannon
index
(H忆)
裸地
Open鄄air control
8 1郾 78 5 1郾 35
高浓度 CO2箱
OTC under elevated CO2
8 1郾 53 5 1郾 29
对照箱
OTC under ambient CO2
8 1郾 62 5 1郾 32
图 4摇 CO2浓度升高对甲烷氧化菌基因拷贝数的影响
Fig. 4摇 Effects of elevated CO2 on MOB gene copies.
响,各处理间差异不显著,而对 Type域MOB 数量影
响较大. CO2熏蒸处理使 Type域MOB 基因拷贝数显
著降低(P<0郾 05),与对照箱相比降低了 10% ,与裸
地相比降低了 15% .
摇 摇 CO2熏蒸对功能基因 pmoA的影响与 Type域16S
rRNA基因相似. CO2熏蒸后,pmoA 基因拷贝数与对
照箱和裸地相比差异显著(P<0郾 05),分别降低了
15%和 46% .
1332 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 关摇 键等: CO2浓度增加对长白山森林土壤甲烷氧化影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
3摇 讨摇 摇 论
3郾 1摇 CO2浓度升高对甲烷氧化速率的影响
2006 年,冯倩妮[14]在长白山对已进行一年 CO2
熏蒸的同一样地的蒙古栎林下土壤 CH4氧化能力进
行了研究,发现裸地生长季的甲烷氧化量为 182郾 5
mg·m-2·a-1,CO2熏蒸的土壤 CH4氧化能力(167郾 0
mg·m-2·a-1)与对照箱(173郾 8 mg·m-2·a-1)相
比降低了 4% ,与裸地相比降低了 8% . 而本文在
2010 年对已经连续 6 年 CO2 熏蒸的长白山蒙古栎
土壤 CH4氧化能力进行再次研究. 结果显示,2010
年同一裸地土壤甲烷氧化量为 165郾 8 mg·m-2 ·
a-1,与 2006 年相比,存在一定的年际变化. 经过 6
年 CO2熏蒸后,土壤 CH4年氧化能力与对照箱相比
仍然只降低了 4% ,但与裸地相比,却降低了 22% .
表明短期的 CO2浓度升高未能显著降低土壤 CH4的
氧化速率,但长期的 CO2浓度升高会显著降低森林
土壤 CH4的氧化功能.从对照箱看,CO2浓度升高对
甲烷氧化能力的影响无显著变化,对照箱和裸地虽
然都接受大气 CO2浓度,但由于开顶箱四周是封闭
的, 只在箱顶部开放, 所以箱底部土壤表面的 CO2扩
散速率要比裸地慢.而且箱底部光强较低,植物叶片
通过光合作用吸收固定的 CO2相对较少,所以,对照
箱底部 CO2浓度要高于裸地,但低于 CO2熏蒸处理,
前期研究已发现这一现象[15] . Mach佗觬ov佗[16]认为,开
顶箱创造了一个人工微气候环境,导致温度、湿度、
光合作用和降雨都发生了改变,甚至阻断了动植物
区系的相互作用,因此 OTC试验结果必须与对照箱
和裸地进行比对.
Dubbs 和 Whalen[10]采用 FACE 方法在 2004—
2006 年对已进行多年 CO2熏蒸(580 滋L·L-1)处理
的温带火炬松森林土壤进行了研究,各年对照箱
CH4氧化量分别为 184、196 和 197 mg·m-2·a-1,而
高浓度 CO2处理后的氧化量分别为 150、175 和 181
mg·m-2·a-1,分别降低了 19% 、10%和 8% ,氧化
量的改变呈逐年下降趋势. 我国对长白山温带森林
土壤甲烷氧化能力及其对 CO2浓度增加的响应还缺
乏长期的定位研究,采用开顶箱方法预测未来全球
变化 CO2浓度增加情景下森林土壤的甲烷氧化能力
还需谨慎估算.
3郾 2摇 CO2浓度升高后土壤含水量与温度对甲烷氧
化速率的影响
长期高浓度 CO2处理可导致土壤含水量增加.
研究表明,随着大气 CO2水平在过去 150 年中不断
增加,植物呼吸的气孔导度减少了 34% ,限制了通
过植物蒸腾作用释放到大气中的水汽,导致了土壤
水分含量的增加[17-18] . 土壤含水量的增加影响了
CH4和 O2的扩散,导致了 CH4氧化菌对 CH4和 O2消
耗的减少[19],甲烷氧化速率降低.
温度也是影响微生物代谢的一个重要因素.目
前,国内外关于土壤温度对土壤甲烷氧化的影响存
在不同观点.一种认为,温度对土壤氧化 CH4的影响
很小.徐慧等[20]对长白山阔叶红松林的研究表明,
CH4氧化与温度无相关关系. 丁维新和蔡祖聪[21]认
为,温度对甲烷氧化作用的影响较产 CH4作用弱,甲
烷氧化菌不易受温度变化的影响,即便在低温条件
下土壤也具有一定的甲烷氧化能力. 另一种观点认
为,温度对土壤甲烷氧化影响很大,因为绝大多数
CH4氧化细菌都是中温型微生物,因而土壤甲烷氧
化能力与温度密切相关,过高或过低的温度条件都
会抑制甲烷氧化. Nesbit 和 Breitenbeck[22]在实验室
对森林土壤样品进行研究发现,最理想的甲烷氧化
发生温度为 20 ~ 30 益,当温度达到 40 益,甲烷吸收
剧烈下降. Shigehiro等[23]发现在较低的土壤温度条
件下(<10 益),温度与甲烷氧化速率呈显著正相
关.本研究中,生长季甲烷氧化速率与温度无显著相
关关系,而且不同处理间土壤温度无显著差异. CO2
浓度升高引起土壤含水量增加,降低了 CH4和 O2的
扩散速率,这可能是导致 CH4氧化速率降低的一个
因素.
3郾 3摇 CO2浓度升高对土壤中 CH4氧化菌群落结构
及数量的影响
森林土壤具有较高的甲烷氧化能力,甲烷氧化
菌数量相对丰富. CO2浓度增加导致 CH4氧化菌的
多样性降低,由于本研究没有对 DGGE 变化条带进
行测序分析,因此很难判断哪类甲烷氧化菌对 CO2
浓度变化敏感. CO2浓度升高对 Type玉MOB 数量的
影响不显著,但显著降低了 Type域MOB 的数量. 这
是由于两类甲烷氧化菌具有不同的生态和代谢特
点,Type玉MOB仅在高浓度甲烷底物条件下具有较
高的代谢活性,而 Type域MOB在贫营养环境下存活
得更好,并有较广泛的生态分布. 从本研究结果来
看,Type域MOB数量降低与 CO2浓度升高导致的甲
烷氧化速率降低结果一致. 从森林生态系统环境特
性上看,更利于 Type域MOB 生长,所以可以推测
Type域MOB对森林土壤的甲烷氧化起着主导作用.
Bull等[24]利用 SIP鄄PLFA技术对温带森林的甲烷氧
233 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
化菌进行了分析,表明13 C 标记的 PLFA 与 Type域
MOB相似,说明 Type域MOB 是温带森林土壤参与
大气甲烷氧化作用的主要微生物类群.用 16S rRNA
基因作为研究对象,最主要的影响就是引物导致的
非特异性扩增.尽管这两对引物是目前报道的扩增
甲烷氧化菌种类最多的引物,但非特异扩增广泛存
在[25-26],其究竟在森林土壤甲烷氧化菌定量研究中
占多大比例还不能确定. 本研究同时选取了甲烷氧
化菌的功能基因 pmoA 进行基因拷贝数定量研究.
该基因编码的甲烷单加氧酶 A,几乎存在于所有甲
烷氧化菌中.结果显示,pmoA 在温带森林土壤中的
基因拷贝数为每克 106数量级,高浓度 CO2熏蒸处理
的土壤甲烷氧化菌数量与对照箱和裸地相比显著降
低,与土壤甲烷氧化能力的降低相一致.德国几处温
带森林土壤的甲烷氧化速率为 0郾 03 ~ 0郾 13
mg·m-2·h-1 [27-28],略高于本研究中测定的长白山
土壤的 CH4氧化速率(0郾 01 ~ 0郾 07 mg·m-2·h-1),
而其 CH4氧化菌功能基因 pmoA 的数量级也为 106,
说明在 CH4氧化菌数量级相同的情况下,不同土壤
的 CH4氧化速率的变化不大.不同森林土壤的甲烷
氧化速率是否与土壤甲烷氧化菌的生物量相关还需
进一步研究.功能基因 pmoA的定量分析结果比 16S
rRNA结果低约 3 个数量级.一方面原因可能是 16S
rRNA引物的非特异性扩增,另一方面,可能由于本
研究选取的 pmoA引物 A189鄄mb661 涵盖面不够,尽
管这对引物是目前报道的检测到甲烷氧化菌多样性
最多的引物,但不能检测到森林土壤特有的甲烷氧
化菌 RA14[13],而且在每个 CH4氧化菌细胞中,至少
有两个 pmoA基因,所以针对 pmoA 基因的 RT鄄PCR
结果会比实际 CH4氧化菌数量少[29],这也可能是造
成两类基因拷贝数差异较大的原因. 针对森林土壤
甲烷氧化菌的引物设计和多对引物的互补研究,对
于开展森林土壤甲烷氧化和甲烷氧化菌研究十分必
要.
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作者简介摇 关摇 键,男,1985 生,硕士研究生.主要从事微生
物生态学研究. E鄄mail: raul_fowler@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
433 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷