全 文 ：可可西里低温适生拮抗芽孢杆菌的筛选
鉴定及脂肽化合物分析*
谢永丽1,2 摇 高学文2**
( 1青海大学农牧学院高原草地资源与生态省部共建重点实验室, 西宁 810016; 2南京农业大学植物保护学院农作物生物灾害
综合治理农业部重点实验室, 南京 210095)
摘摇 要摇 极端环境特殊微生物资源研究和开发具有广阔的应用前景和研究意义.对分离筛选
自青海可可西里境内植被根围的 8 株在 4 和 10 益条件下生长良好的低温适生芽孢杆菌进行
鉴定分析.结果表明: 通过生理生化特征分析、rep鄄PCR指纹图谱分析、16S rDNA及 gyrB基因
序列分析鉴定,8 株供试菌株分别为莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)3 株,解淀粉芽孢杆
菌(B. amyloliquefaciens)1 株和简单芽孢杆菌(B. simplex)4 株.采用平板对峙试验从中筛选
到 4 株对油菜菌核病原真菌( Sclerotinia sclerotiorum)及水稻白叶枯病原细菌(Xanthomonas
oryzae pv. oryzae)均具有显著拮抗活性的生防菌株;采用 MALDI鄄TOF鄄MS 质谱分析生防菌株
的拮抗活性物质,结果显示菌株 KKD1(B. mojavensis)产生脂肽类化合物泛革素和表面活性
素,菌株 KKD2(B. amyloliquefaciens)产生脂肽类化合物伊枯草菌素 A、泛革素和表面活性素,
推断生防菌株的拮抗活性可能与脂肽化合物的合成及分泌有关.该研究为低温适生性芽孢杆
菌生物肥料和生物农药的研发提供了菌株资源.
关键词摇 低温适生芽孢杆菌摇 rep鄄PCR指纹图谱分析摇 16S rDNA序列分析摇 gyrB 序列分析
脂肽化合物
*国际科技合作项目(2011DFG93160,2011DFA20820)和青海省(应用)基础研究计划项目(2011鄄Z鄄725)资助.
**通讯作者. E鄄mail: gaoxw@ njau. edu. cn
2012鄄03鄄19 收稿,2012鄄10鄄23 接受.
文章编号摇 1001-9332(2013)01-0149-07摇 中图分类号摇 Q93. 3; S476摇 文献标识码摇 A
Screening and identification of low temperature鄄adapted antagonistic Bacillus isolated from
Kekexili region of West China and the analysis of the isolates lipopeptide compounds. XIE
Yong鄄li1,2, GAO Xue鄄wen2 ( 1Qinghai Province and Ministry of Education Co鄄constructing Key La鄄
boratory of Plateau Grassland Resource and Ecology, Qinghai University, Xining 810016, China;
2Ministry of Agriculture Key Laboratory of Monitoring and Management of Crop Diseases and Pest In鄄
sects,College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China) . 鄄Chin.
J. Appl. Ecol. ,2013,24(1): 149-155.
Abstract: The research and exploitation of special microbial resources in extreme environment is of
scientific significance and has broad applied prospect. In this paper, eight Bacillus strains isolated
from the vegetation rhizospheres in Kekexili extreme region of Qinghai Province and presented good
growth status at low temperature 4 and 10 益 were identified. Through physiological and biochemi鄄
cal analysis, rep鄄PCR fingerprinting, and 16S rDNA and gyrB partial sequence analyses, the eight
strains were identified as Bacillus mojavensis (3 isolates), Bacillus amyloliquefaciens (1 isolate),
and Bacillus simplex (4 isolates). The agar plate antagonistic test showed that four of the isolates
presented distinct antagonistic activity to Sclerotinia sclerotiorum and Xanthomonas oryzae pv.
oryzae. The MALDI鄄TOF鄄MS analysis showed that the strain KKD1(B. mojavensis) produced fengy鄄
cin and surfactin, whereas the strain KKD2(B. amyloliquefaciens) produced iturin A, surfactin and
fengycin, suggesting that the bio鄄control efficacy of the Bacillus strains could be related to the syn鄄
thesis and excretion of the antifungal lipopeptide compounds. This study provided the bacterial re鄄
sources for the research and exploitation of low temperature鄄adapted Bacillus bio鄄fertilizers and bio鄄
pesticides.
应 用 生 态 学 报摇 2013 年 1 月摇 第 24 卷摇 第 1 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jan. 2013,24(1): 149-155
Key words: low temperature鄄adapted Bacillus; rep鄄PCR fingerprinting; 16S rDNA sequence analy鄄
sis; gyrB sequence analysis; lipopeptide.
摇 摇 高原极地环境微生物研究对于认识极端环境的
生命本质,了解极端生物的生存机制,以及揭示生物
与环境之间相互适应相互作用的机制和规律具有重
要的意义[1] . 可可西里地域广袤,以其高海拔、低
温、缺氧、强紫外辐射素有“可可西里无人区冶的极
地生境之称,因此可可西里极端环境微生物资源的
研究和开发具有重要意义. 芽孢杆菌作为目前应用
较广的一类微生物资源,因其能产生抗逆芽孢而具
有较强的生存适应能力,被广泛应用到农业、畜牧
业、工业、医学、环境保护等领域[2] . 芽孢杆菌也是
非常理想的生防菌筛选对象,部分芽孢杆菌可通过
非核糖体合成途径产生包括伊枯草菌素( iturin)、表
面活性素(surfactin)和泛革素(fengycin)3 大类的脂
肽类化合物[3-4],在植物病害生物防治过程中发挥
着重要的作用,是生物菌肥和生物农药研发与应用
的重要菌株资源[5] . 目前,对于芽孢杆菌的鉴定多
采用多项分类体系综合鉴定分析,利用表型及生理
生化特征、 rep鄄PCR 指纹图谱分析、16S rDNA 及
gyrB基因序列分析等多种方法相结合的鉴定手段,
可以较为准确地对芽孢杆菌进行分类鉴定[6-7] .
本文对分离筛选自青海可可西里境内稀疏植被
根围的 8 株低温适生芽孢杆菌,采用多项鉴定方法
确定了其种属,通过拮抗活性检测筛选具有显著拮
抗活性的低温适生性生防菌株,采用 MALDI鄄TOF鄄
MS质谱分析生防菌株主要抑菌活性物质的组成成
分,旨在为低温适生芽孢杆菌生物肥料和生物农药
的开发提供菌株资源.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试菌株及培养基
芽孢杆菌菌株分离自青海省可可西里境内点滴
梅(Androsace umbellata)植物根围土壤,菌株分离方
法参考龚国淑等[8]方法.油菜菌核病原真菌(Sclero鄄
tinia sclerotiorum) 及水稻白叶枯病原细菌 ( Xan鄄
thomonas oryzae pv郾 oryzae)由本实验室保存.细菌培
养基:LB培养基和 Landy培养基参考 Wu 等[9]方法
配制;真菌 PDA培养基参考郝士海[10]方法配制;芽
孢杆菌低温筛选 1C 培养基参考刘芳等[1]方法配
制.引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成;PCR
扩增反应试剂购自 TAKARA公司;PCR 产物纯化试
剂盒购自爱思进生物技术公司.
1郾 2摇 低温适生芽孢杆菌筛选
将待测菌株接种到芽孢杆菌低温筛选 1C 培养
液中,37 益条件 200 r·min-1,过夜培养. 取 10 滋L
菌液点到 1C固体培养基平板上,分别于 4、10、14 益
条件下生长,每天观察生长情况,一周后记录生长结
果,筛选低温适生菌株[1] .
1郾 3摇 芽孢杆菌鉴定
1郾 3郾 1 形态学和生理生化鉴定摇 通过革兰氏染色和
芽孢染色进行形态观察. 生理生化试验包括接触酶
反应、V鄄P测定、厌氧性试验、柠檬酸盐利用、丙酸盐
利用、硝酸盐还原、7% NaCl 生长、pH 5郾 7 生长、65
益生长、淀粉水解、酪素水解试验. 具体方法参照文
献[11].
1郾 3郾 2 BOX鄄PCR及 ERIC鄄PCR指纹图谱分析摇 基因
组 DNA提取方法参考 Wu 等[9]方法. BOX鄄PCR 扩
增引物为 BOXA1R (5忆鄄CTACGGCAAGGCGACGCT鄄
GACG 鄄3忆), 扩增条件为:95 益 7 min; 94 益 1 min,
53 益 1 min, 65 益 8 min, 34 个循环; 65 益 16 min.
ERIC鄄PCR 扩增引物为 ERIC1R(5忆鄄ATGTAAGCTC鄄
CTGGGGATTCAC鄄3忆) 和 ERIC2 ( 5忆鄄AAGTAAGT鄄
GACTGGGGTGAGCG鄄3忆),扩增条件为:95 益 7 min;
94 益 1 min, 53 益 1 min, 65 益 8 min, 30 个循环;
65 益 16 min. 对 rep鄄PCR 扩增产物进行电泳检测,
在 2郾 0% (M / V)LE鄄琼脂糖凝胶中,85 V电泳 4 h,检
测扩增效果,获得凝胶成像图谱.对获得的 rep鄄PCR
指纹图谱采用 Cross checker软件进行分析,获得 0、
1 矩阵. 将获得的矩阵通过 NTSYS鄄pc 2郾 10 软件包
采用非加权对数算术平均法(unweighted pair group
method using averages algorithm, UPGMA)进行聚类
分析[12],获得系统发育树.
1郾 3郾 3 16S rDNA 序列分析鉴定摇 16S rDNA 扩增引
物序列为:正向引物 27F(5忆鄄AGAGTTTGATCMTG鄄
GCTCAG鄄3忆),反向引物 1492R: (5忆鄄GGYTACCTT鄄
GTTACGACTT鄄3忆). PCR 扩增条件为:95 益 4 min;
94 益 1 min, 50 益 1 min, 72 益 2 min, 34 个循环;
72 益 10 min[13] .将 16S rDNA扩增产物回收纯化后
测序.测序所得序列通过 NCBI 数据库进行 BLAST
比对,通过 MEGA 3郾 1 软件[14]对分离芽孢杆菌及模
式菌进行系统发育分析.
1郾 3郾 4 gyrB基因序列分析鉴定摇 gyrB基因扩增引物
序列为:正向引物 UP1: (5忆鄄GAAGTCATCATGAC鄄
051 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
CGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA鄄3忆), 反 向
引物 UP2r: ( 5忆鄄AGCAGGGTACGGATGTGCGAGC鄄
CRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT鄄3忆). PCR 扩增条件
为:95 益 4 min; 98 益 10 s, 62 益 1 min, 72 益 2
min, 30 个循环;72 益 8 min[15] .将 gyrB基因扩增产
物纯化后测序,所测序列通过 NCBI 数据库进行
BLAST比对,通过 MEGA 3郾 1 软件[14]对分离芽孢杆
菌及模式菌进行系统发育分析.
1郾 4摇 芽孢杆菌的拮抗活性检测
1郾 4郾 1 对油菜菌核病原真菌的拮抗活性 摇 在 26 益
培养箱中活化的油菜菌核菌 PDA 平板边缘打取直
径为 0郾 7 cm的菌碟,接种在新的 PDA平板中央.在
距离菌块 2郾 5 cm 处,呈“十冶字形分布的 4 个接种
点,放上直径 4 mm的滤纸小圆片,取待测菌液 5 滋L
点在滤纸片中央,每处理重复 3 次,放入 26 益恒温
培养箱中培养 2 ~ 3 d 后,取出观测并记录抑菌结
果[16] .
1郾 4郾 2 对水稻白叶枯病菌的拮抗活性摇 将水稻白叶
枯病菌按比例(1 颐 30)加入冷却到 50 益左右的 NA
培养基中混匀,制成含菌平板,在距离中心 2郾 5 cm
处十字垂直放置 4 个直径为 4 mm 的滤纸片,吸取
待测菌液 5 滋L,接种于滤纸片上,每处理重复 3 次.
置于 28 益培养箱中培养 2 ~ 3 d 后,观察并记录
结果.
1郾 5摇 脂肽化合物粗提及分析
选择供试菌株进行 Landy 培养基发酵,发酵条
件参见王帅等[17]方法.发酵培养结束后, 将培养物
离心取上清液, 在上清液中加入 6 mol·L-1 HCl 调
pH至 2郾 0, 轻微搅动,放置 4 益冰箱过夜.离心收集
沉淀, 加入甲醇后用 1 mol·L-1 NaOH 调节 pH 至
7郾 0,再用甲醇抽提并将抽提液合并, 获得脂肽类化
合物粗提物[18] . 利用基质协助激光解吸附离子化鄄
飞行时间质谱 (MALDI鄄TOF鄄MS),分析分离菌株
Landy发酵产生的脂肽类化合物种类,基质为 琢鄄氰鄄
4鄄羟肉桂酸(琢鄄cyano鄄4鄄hydroxy鄄cinnamic acid) [19] .
2摇 结果与分析
2郾 1摇 形态及生理生化特征
分离筛选自青海可可西里境内植被根围的 8 株
菌株的革兰氏染色阳性,为产孢细菌. 菌株 KKD1、
KKD3、KKD4 生理生化反应相同,除厌氧反应、65 益
生长、酪素水解为阴性外,其余反应为阳性;菌株
KKD2 厌氧反应、65 益生长为阴性,其余反应为阳
性;菌株 KKD5、KKD6、KKD7、KKD8 的生理生化反应
相同,除厌氧反应、丙酸盐利用、65 益生长为阴性
外,其余反应为阳性(表 1). 与 Gordon 等[20]著《芽
孢杆菌属》中芽孢杆菌各属进行比较,8 株菌株表现
为厌氧生长阴性、V鄄P 反应阳性、解淀粉反应阳性,
均属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).
2郾 2摇 BOX鄄PCR及 ERIC鄄PCR指纹图谱分析
对 8 株菌株进行 BOX鄄PCR 及 ERIC鄄PCR 指纹
图谱分析. 以菌株基因组 DNA 为模板进行 BOX鄄
PCR扩增,扩增到大小为 200 ~ 5000 bp 的连续条
带,得到 BOX鄄PCR 指纹图谱(图 1A). BOX鄄PCR 指
纹图谱分析结果显示:菌株 KKD1、KKD3、KKD4 具有
完全相同的 BOX鄄PCR 指纹图谱,为同种芽孢杆菌;
菌株 KKD5、KKD6、KKD7、KKD8 的 BOX鄄PCR指纹图
谱非常相似但个别条带有差异,是否为同种菌需进
一步鉴定分析.同样以 8 株菌株基因组 DNA 为模板
进行ERIC鄄PCR扩增,扩增到大小为200 ~ 5000 bp
表 1摇 芽孢杆菌菌株的生理生化特性
Table 1摇 Physiological and biochemical characteristics of Bacillus strains
特性
Characteristics
菌株 Strain
B郾 subtilis KKD1 KKD2 KKD3 KKD4 KKD5 KKD6 KKD7 KKD8
接触酶 Catalase production + + + + + + + + +
V鄄P测定 V鄄P reaction + + + + + + + + +
厌氧实验 Anaerobic growth - - - - - - - - -
柠檬酸盐利用 Citrate utilization + / - + + + + + + + +
丙酸盐利用 Propionate utilization - / + + + + + - - - -
硝酸盐还原 Nitrate reduction + / - + + + + + + + +
7%NaCl生长 7%NaCl growth + / - + + + + + + + +
pH 5郾 7 生长 pH 5郾 7 growth + / - + + + + + + + +
65 益生长 65 益 growth + / - - - - - - - - -
淀粉水解 Starch hydrolysis + + + + + + + + +
酪素水解 Casein hydrolysis + / - - + - - + + + +
+:阳性反应 Positive reaction;–:阴性反应 Negative reaction; + / -:组群中阳性反应为主 Positive reaction presented dominate status in groups; - / +:
组群中阴性反应为主 Negative reaction presented dominant status in groups郾
1511 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 谢永丽等: 可可西里低温适生拮抗芽孢杆菌的筛选鉴定及脂肽化合物分析摇 摇 摇 摇 摇
图 1摇 芽孢杆菌菌株 rep鄄PCR指纹图谱
Fig. 1摇 rep鄄PCR fingerprint of Bacillus strains.
A:BOX鄄PCR指纹图谱 BOX鄄PCR fingerprint; B:ERIC鄄PCR 指纹图谱
ERIC鄄PCR fingerprint郾
的连续条带,得到 ERIC鄄PCR 指纹图谱 (图 1B).
ERIC鄄PCR 指纹图谱分析结果表明:菌株 KKD1、
KKD3、KKD4 具有相同的 ERIC鄄PCR 指纹图谱,为同
种芽孢杆菌;菌株 KKD5、KKD6、KKD8 的 ERIC鄄PCR
指纹图谱基本相似,为同种芽孢杆菌的可能性较大.
2郾 3摇 gyrB基因序列分析鉴定
排除 rep鄄PCR 指纹图谱相同的菌株,选择指纹
图谱不同或有差异的 6 株菌株 KKD1、KKD2、KKD5、
KKD6、KKD7、KKD8,以菌株基因组 DNA为模板扩增
gyrB基因,扩增到大小约 1300 bp 的 PCR 特征性条
带,与芽孢杆菌 gyrB 基因的理论值基本相符. 将测
序结果在 GenBank中与己知序列进行 BLAST比对,
结果表明:菌株 KKD1与莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus
mojavensis)BCRC 的 gyrB 序列相同(或一致)性为
99% ;菌株 KKD2 与解淀粉芽孢杆菌 ( Bacillus
amyloliquefaciens)FZB42 的 gyrB序列相同(或一致)
性为 99% ;菌株 KKD5、KKD6、KKD7、KKD8 与简单
芽孢杆菌 (Bacillus simplex) Se2 的 gyrB 序列相同
(或一致)性分别为 95% 、95% 、98% 、95% .
2郾 4摇 16S rDNA序列分析鉴定
同上所述,以 6 株菌株的基因组 DNA为模板扩
增 16S rDNA片段.扩增到大小约 1500 bp的 PCR特
征性条带,与芽孢杆菌 16S rDNA 的理论值基本相
符. 将测序结果在 GenBank 中与己知序列进行
BLAST比对,结果表明:菌株 KKD1 与 B郾 mojavensis
BCRC 17531 的 16S rDNA 序列相同(或一致)性为
100% ;菌株 KKD2 与 B郾 amyloliquefaciens Lx鄄11 的
16S rDNA 序列相同 (或一致) 性为 100% ;菌株
KKD5 与 B郾 simplex BLSH95、 KKD6 与 B郾 simplex
Asd13、KKD7 与 B郾 simplex XAS6鄄4、KKD8 与 B郾 sim鄄
plex 2鄄134 的 16S rDNA 序列相同(或一致)性均达
到 99% .以菌株 KKD1、KKD2、KKD6 的 16S rDNA序
列,与 8 株模式菌株及菌株 B郾 simplex Se2 和菌株
B郾 mojavensis BCRC 17531 的 16S rDNA 序列通过
MEGA 3郾 1 软件构建系统进化树,结果显示:菌株
KKD1 与 B郾 mojavensis BCRC 17531 聚类在同一个分
支上;菌株 KKD2 与 B郾 amyloliquefaciens FZB42 聚类
在同一分支上;菌株 KKD6 与 B郾 simplex Se2 聚类在
同一个分支上(图 2).
通过 BOX鄄PCR 及 ERIC鄄PCR 指纹图谱分析、
gyrB基因及 16S rDNA 序列分析鉴定结果:菌株
KKD1、KKD3、KKD4 为同种芽孢杆菌,鉴定为莫哈韦
芽孢杆菌(B郾 mojavensis);菌株 KKD2 鉴定为解淀粉
芽孢杆菌(B郾 amyloliquefaciens);菌株 KKD5、KKD6、
KKD7、KKD8 为同种芽孢杆菌,鉴定为简单芽孢杆菌
(B郾 simplex).
2郾 5摇 低温适生菌筛选及菌株拮抗活性检测
根据低温适生微生物的广义定义,设置了 3 个
温度 4、10 和 14 益来检测 8 株供试菌株的低温生长
特性.结果表明:8 株菌株在 14 益条件下生长 36 h
即可显现明显的菌苔;在 10 益条件下 3 d 后出现淡
淡的菌苔;在 4 益条件下,观察到第 5 天时,8 株菌
株显现明显的菌苔.表明 8 株菌株能在 4 和 10 益下
生长良好,为低温适生芽孢杆菌(表 2).
图 2摇 基于 16S rDNA序列构建的芽孢杆菌系统发育树
Fig. 2摇 Phylogenetic tree of Bacillus strains based on 16S rDNA
gene sequences郾
251 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
表 2摇 芽孢杆菌在低温条件下生长情况及对病原菌的拮抗活性
Table 2摇 Growth status of Bacillus strains at low temperature condition and antagonistic activity
菌株
Strain
温度 Temperature
4 益 10 益 14 益
对油菜菌核菌的拮抗特征
Antagonistic property
to S郾 sclerotiorum
对水稻白叶枯菌的拮抗特征
Antagonistic property
to X郾 oryzae pv郾 oryzae
菌株鉴定结果
Identification
of strain
KKD1 G G G +++ ++ B郾 mojavensis
KKD2 G G G +++ +++ B郾 amyloliquefaciens
KKD3 G G G +++ ++ B郾 mojavensis
KKD4 G G G +++ ++ B郾 mojavensis
KKD5 G G G - - B郾 simplex
KKD6 G G G - - B郾 simplex
KKD7 G G G - - B郾 simplex
KKD8 G G G - - B郾 simplex
G:生长 Growth. +:抑菌圈直径 0 ~ 5 mm Antagonistic diameter 0-5 mm; ++:抑菌圈直径 5 ~ 10 mm Antagonistic diameter 5-10 mm; +++:抑菌圈
直径 10 ~ 15 mm Antagonistic diameter 10-15 mm; -:不抑菌 No antagonistic activity郾
摇 摇 通过平板对峙试验检测 8 株菌株对油菜菌核病
原真菌及水稻白叶枯病原细菌的拮抗活性,结果显
示,其中 4 株菌株 KKD1、KKD2、KKD3、KKD4 对油菜
菌核菌及水稻白叶枯菌具有较强的拮抗活性(图
3),它们对油菜菌核菌的抑菌圈平均直径均 > 10
mm;菌株 KKD2 对水稻白叶枯菌的抑菌圈平均直径
>10 mm,菌株 KKD1、KKD3 及 KKD4 对水稻白叶枯
菌的抑菌圈平均直径为 5 ~ 10 mm,均表现出显著的
拮抗效果(表 2).菌株 KKD5、KKD6、KKD7、KKD8 没
有检测到对油菜菌核菌及水稻白叶枯菌的拮抗效
果,作为低温适生菌,是否具有其他方面的特性有待
进一步探究.
2郾 6摇 脂肽化合物分析
芽孢杆菌的拮抗活性物质主要为非核糖体途径
合成的脂肽类化合物[5] . MALDI鄄TOF鄄MS 质谱分析
广泛应用于芽孢杆菌脂肽类化合物的检测[21-22] .选
择对病原真菌油菜菌核菌及病原细菌水稻白叶枯菌
均具有显著拮抗效果的菌株 KKD1(B郾 mojavensis)
及 KKD2(B郾 amyloliquefaciens),通过 Landy 发酵获
得脂肽化合物,对脂肽化合粗提物进行MALDI 鄄
图 3摇 芽孢杆菌的拮抗活性检测
Fig. 3摇 Detection of antagonistic activity of Bacillus strains郾
A:拮抗油菜菌核菌 Antagonistic activity to S郾 sclerotiorum; B:拮抗水
稻白叶枯菌 Antagonistic activity to X郾 oryzae pv郾 oryzae郾
TOF鄄MS质谱分析,结果显示:菌株 KKD1 在 m / z 值
为 1485郾 79、 1499郾 80 处有离子峰 (簇) 出现 (图
4A),这 2 个离子峰均对应于泛革素的质量;在 m / z
值为 1030郾 83、1044郾 75、1058郾 75 处有离子峰(簇)出
现,这 3 个离子峰均对应于表面活性素的质量.菌株
KKD2 在 m / z 值为 1030郾 64、 1044郾 65、 1058郾 67、
1074郾 65 处有离子峰(簇)出现,这 4 个离子峰均对
应于表面活性素的质量 (图 4B);在 m / z 值为
1106郾 56、1122郾 52 处有离子峰(簇)出现,这 2 个离
子峰均对应于伊枯草菌素 A的质量(图 4B);在 m / z
值为 1449郾 92、1485郾 92 处有离子峰(簇)出现,这 2
个离子峰均对应于泛革素的质量. MALDI鄄TOF鄄MS
质谱图分析表明,菌株KKD1可产生脂肽类化合
图 4摇 菌株 KKD1 产生的泛革素(A)及菌株 KKD2 产生的表
面活性素、伊枯草菌素 A(B)的 MALDI鄄TOF鄄MS检测
Fig. 4摇 MALDI鄄TOF鄄MS analysis of fengycin produced by strain
KKD1(A) and surfactin, iturin A produced by strain KKD2(B).
3511 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 谢永丽等: 可可西里低温适生拮抗芽孢杆菌的筛选鉴定及脂肽化合物分析摇 摇 摇 摇 摇
物泛革素、表面活性素,菌株 KKD2 可产生脂肽类化
合物表面活性素、抑枯草菌素 A 和泛革素;推断分
离筛选的低温适生芽孢杆菌的拮抗活性可能与其脂
肽化合物的合成与分泌有关.
3摇 讨摇 摇 论
低温适生微生物由于具有适宜在低温条件下生
长的特性,受到国内外学者的广泛关注,越来越多地
应用于环境污染治理、食品开发、工业发酵、科学研
究等方面,目前对低温适生芽孢杆菌的研究主要集
中在低温酶的利用[23]、清除低温环境中的污染
物[24]等领域.通常播种时节是在土壤温度较低的早
春或秋季,芽孢杆菌生防菌可作为拌种剂使用以达
到抗病保产的功效,因此低温适生性生防菌株的筛
选鉴定,可为低温适生性生物菌肥及生物农药的研
发提供优质的菌源材料;低温适生性生防芽孢杆菌
在生物防治中具有潜在的研究及开发优势.
本研究对分离自可可西里境内点滴梅植被根围
的 8 株低温适生芽孢杆菌进行鉴定分析并检测菌株
作为生防菌株的潜力. 8 株菌株均可在 4 和 10 益条
件下生长良好,其中 4 株菌株具有显著的拮抗油菜
病原真菌及水稻白叶枯病原细菌的活性,具备低温
适生性生防菌研发的潜力. 对筛选的低温适生拮抗
菌进行 MALDI鄄TOF鄄MS 质谱分析检测其拮抗活性
物质,菌株 KKD1可产生脂肽类化合物泛革素、表面
活性素,菌株 KKD2 可产生脂肽类化合物伊枯草菌
素 A、表面活性素、泛革素;其中脂肽类化合物泛革
素、伊枯草菌素 A 对真菌具有强烈拮抗作用,脂肽
类化合物表面活性素对细菌具有强烈的拮抗作
用[5,25],因此推断这几株低温适生拮抗菌对病原真
菌及病原细菌的拮抗活性可能与其产生的脂肽化合
物泛革素、伊枯草菌素 A 及表面活性素有关. 在可
可西里境内分离鉴定的低温适生拮抗菌株,对于极
端环境微生物资源研究具有重要的意义,为适用于
低温环境的生物菌肥和生物农药的研发提供了优质
的菌株资源.
本研究中对于芽孢杆菌的鉴定,采用了表型及
生理生化特征、rep鄄PCR指纹图谱分析、16S rDNA及
gyrB基因序列分析鉴定相结合的方法. rep鄄PCR 指
纹分析技术在细菌基因组中广泛应用,Rep( repeti鄄
tive extragenic plindromic)、ERIC( enterobacterial re鄄
petitive intergenic consensus)、BOX 等短重复序列分
散存在于细菌染色体基因组的基因间,在不同细菌
中的拷贝数和定位不同,因此根据这些短重复序列
的保守性设计相应的扩增引物对细菌 DNA 进行
PCR 扩增,就可以得到具有种或菌株特异性的 DNA
指纹图谱[26-28];16S rDNA 序列分析是近年来研究
微生物种类和遗传多样性的一种新型分析手段[29],
但在微生物亲缘关系较近时,16S rDNA序列分析会
有一些局限性,而 gyrB 基因序列分析相对于 16S
rDNA 基因具有较高的区分度, 适合亲缘关系较近
菌种的鉴定[30] .本研究在对分离筛选的低温适生菌
株进行多项鉴定分析时发现,生理生化方法只能将
菌株鉴定到属,16S rDNA 和 gyrB 基因序列分析能
对分离菌株进行更准确的鉴定[31] . 在 BOX鄄PCR 及
ERIC鄄PCR 指纹图谱分析的基础上,选择指纹图谱
有差异的菌株,进行 16S rDNA 及 gyrB 基因序列分
析鉴定,综合两种序列分析比对的结果,可以更为快
捷准确地获得供试株的鉴定分类结果. 通过几种鉴
定方法的综合分析,将菌株 KKD1、KKD3、KKD4 鉴定
为莫哈韦芽孢杆菌(B郾 mojavensis),菌株 KKD2 鉴定
为解淀粉芽孢杆菌 ( B郾 amyloliquefaciens);菌株
KKD5、KKD6、KKD7、KKD8 鉴定为简单芽孢杆菌(B郾
simplex).其中,4 株 B郾 simplex虽不具备对病原菌的
拮抗活性,但作为低温适生菌,是否具有其他方面的
应用价值,有待于进一步研究.
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作者简介 摇 谢永丽,女,1971 年生,博士研究生,副教授. 主
要从事分子植物病理学研究. E鄄mail: xieyl01@ hotmail. com
责任编辑摇 肖摇 红
5511 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 谢永丽等: 可可西里低温适生拮抗芽孢杆菌的筛选鉴定及脂肽化合物分析摇 摇 摇 摇 摇