全 文 ：链霉菌 6803 菌株对植物的化感作用*
宋圆圆1,2,3 摇 黄摇 珂3,4 摇 石木标4 摇 陈摇 敏1,2,3 摇 曾任森1,2,3**
( 1华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广州 510642; 2农业部热带环境重点实验室, 广州
510642; 3华南农业大学热带亚热带生态研究所, 广州 510642; 4华南农业大学食品学院, 广州 510642)
摘摇 要摇 链霉菌属是绝大多数已知抗生素和一些重要活性物质的产生菌,它对高等植物是否
具有化感作用尚缺乏研究. 从土壤中分离获得 7 个放线菌菌株,研究其对植物幼苗生长的抑
制作用.结果表明: 链霉菌 6803 菌株在固体和液体发酵培养时均强烈抑制油菜根和稗草根的
生长, 其液体发酵液的 5 倍稀释液对油菜和稗草苗生长的抑制分别达到 60. 7%和 61. 3% .
常规形态与生理生化试验表明,该菌株属于链霉菌属金色类群; 16S rRNA 基因序列分析表
明,该菌株为沙场链霉菌,基因序列相似性达到 99. 28% . 此菌株经过 80 ~ 100 s 紫外线照射
筛选出的正突变菌株 UV8024 和 UV100鄄2 的 10 倍稀释发酵液对油菜幼苗生长的抑制作用比
原始菌株分别提高了 37. 5%和 38. 1% , 经过 1%硫酸二乙酯诱变 50 min 筛选出的正突变菌
株 D507 的 10 倍稀释发酵液对油菜幼苗生长的抑制作用比原始菌株提高了 29. 8% . 链霉菌
6803 菌株对高等植物具有化感作用, 并可通过诱变育种提高其化感潜力.
关键词摇 化感作用摇 链霉菌 6803 菌株摇 沙场链霉菌摇 诱变育种
文章编号摇 1001-9332(2012)10-2728-09摇 中图分类号摇 Q945. 8摇 文献标识码摇 A
Allelopathic effects of Streptomyces sp. 6803 on plants. SONG Yuan鄄yuan1,2,3, HUANG Ke3,4,
SHI Mu鄄biao4, CHEN Min1,2,3, ZENG Ren鄄sen1,2,3 ( 1State Key Laboratory of Conservation and Uti鄄
lization of Subtropical Agro鄄bioresources, Guangzhou 510642, China; 2Ministry of Agriculture Key
Laboratory of Tropical Agro鄄environment, Guangzhou 510642, China; 3 Institute of Tropical & Sub鄄
tropical Ecology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 4College of Food
Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,
2012,23(10): 2728-2736.
Abstract: Streptomyces can produce an overwhelming majority of known antibiotics and several bio鄄
logically active compounds, but whether Streptomyces can display allelopathic effects on higher
plants is largely unknown. In this study, seven actinomyces strains isolated from soils showed inhib鄄
itory effect on plant seedlings growth, among which, Streptomyces sp. 6803 had strong capability in
inhibiting the seedlings growth of Brassica campestris and Echinochloa crusgalli in both solid and liq鄄
uid cultures. The dilute solution ( 伊 5 ) of fermented broth inhibited the seedlings growth of
B. campestris and E. crusgalli by 60. 7% and 61. 3% , respectively. Based on the morphological
and physiological鄄biochemical characteristics and 16S rRNA sequencing, Streptomyces sp. 6803 was
identified as Streptomyces arenae, with the 16S rRNA sequence identity being 99郾 28% . Ultraviolet
radiation and diethyl sulfate (DES) were used to produce mutants to enhance the allelopathic po鄄
tential of this strain. After 80 and 100 seconds of ultraviolet radiation, the dilute solution (伊10) of
fermented broth of obtained mutants UV8024 and UV100鄄2 showed 37. 5% and 38. 1% higher inhi鄄
bition effect on the root growth of B. campestris seedlings, respectively, compared with the control.
The mutant D507 obtained through 1% DES treatment for 50 min showed 29. 8% higher inhibition
effect on the root growth of B. campestris seedlings. This study showed that Streptomyces sp. 6803
had allelopathic effect on higher plants, and it was possible to enhance the allelopathic potential of
the strain via mutation breeding.
Key words: allelopathy; Streptomyces sp. 6803; Streptomyces arenae; mutation breeding.
*国家自然科学基金项目(31100286,31070388)、中国博士后基金项目(201104341,20100480762)和广东省科技计划项目(2009B080701047)
资助.
**通讯作者. E鄄mail: rszeng@ scau. edu. cn
2012鄄02鄄09 收稿,2012鄄08鄄17 接受.
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 10 月摇 第 23 卷摇 第 10 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Oct. 2012,23(10): 2728-2736
摇 摇 化感作用(allelopathy)是指植物或微生物通过
向周围环境释放化学物质从而直接或间接地抑制或
促进邻近其他植物或微生物生长和发育的现象[1] .
微生物对高等植物的化感作用是化感作用研究的一
个重要组成部分[2-5] .虽然早在 1937 年, Molisch[6]
对化感作用的最初定义就是指植物(包括微生物)
之间的生化相互作用, 但是关于微生物对高等植物
的化感作用一直没有深入研究. Rice[4]指出, 微生
物的化感作用应该引起高度重视, 因为它在土壤中
具有非常重要的作用, 影响到土壤的健康[7] . 微生
物对高等植物的化感作用可望通过工业发酵开发出
新型微生物源除草剂[8-10], 这比开发植物源新型除
草剂容易得多.
自然界一些微生物不是植物病原菌, 但其代谢
产物可能影响植物生长[4,11-12] . 很早人们就发现由
放线菌产生的放线菌酮具有很好的除草活性[13] .
由链霉菌产生的茴香霉素能强烈抑制稗草和马唐的
生长, 以此化合物为结构模板开发出了除草剂苯草
酮. 日本明治制果公司从链霉菌 Streptomyces virido鄄
chromogenes中得到的双丙氨膦已被开发成为除草
剂, 广泛用于防除禾本科和阔叶杂草[14] . 从冬小麦
的根际菌落上分离到的 Pseudomonas fluorescens D7
菌株在实验室条件和田间试验下都能抑制杂草雀麦
草(Bromus japonicus)的生长[15] . Mishra 等[16]从土
壤中分离的 906 个微生物菌株中发现有 72 个菌株
的代谢产物抑制独行菜(Lepidium sativum)的种子发
芽. Friedman 等[17]在分析黄杉(Pseudotsuga menz鄄
iesii)林地与附近的裸地(20 年不能生长黄杉)土壤
中的放线菌时发现, 裸地中的放线菌密度是林地 2
倍, 而且能产生次生代谢物质抑制种子发芽的放线
菌的比例要显著高得多, 裸地中放线菌产生毒素的
植物毒性是林地的 5 倍[16] .
本研究的目的是利用化感作用原理从土壤中筛
选对植物有化感活性的放线菌, 对分离获得的链霉
菌 6803 菌株进行分类鉴定, 并通过紫外线物理诱
变和化学诱变提高该菌株的化感潜力.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
1郾 1郾 1 供试菌种 摇 从海南、贵州、新疆、山东、安徽、
江西、江苏、重庆、湖南、广东和内蒙古等地采集土
样. 选择受到人为干扰破坏较少且有机质较为丰富
的土壤, 采集地表约 5 ~ 10 cm深的土样, 置于阴凉
通风处, 自然干燥后装入无菌的牛皮信封中, 标明
采土样的地点、时间、土壤性质以及植被等, 共获得
土样 80 份,用于放线菌的分离. 土样置于阴凉通风
处晾干, 采用吹土法对已经干燥的土样在分离培养
基上进行分离, 然后将培养基倒置在 30 益的恒温
生化培养箱中培养, 从培养的第 3 天起, 开始分批
次连续挑选菌落. 单一菌落分别转接到高氏一号斜
面培养基上, 再培养 7 ~ 10 d, 然后采用液体涂布
平板法或划线分离法进一步分离纯化, 纯化后的菌
株在固体培养基中进行化感活性测定. 本研究所用
的链霉菌 6803 菌株采自湖南省安乡县安丰乡的稻
田土壤.
1郾 1郾 2 供试植物 摇 受体植物稗草(Echinochloa crus鄄
galli)种子从华南农业大学校园内试验农场采集,油
菜(Brassica campestris)种子由广东省农业科学院蔬
菜研究所提供. 所选的受体分别作为单子叶植物和
双子叶植物的代表.
植物种子先用 75%的乙醇杀菌 10 s, 无菌水清
洗 3 次, 再用 0. 1%的氯化汞消毒剂浸泡 10 min,
无菌水清洗 3 次, 沥干备用.
1郾 2摇 研究方法
1郾 2郾 1 菌种分离与保藏培养基摇 分离菌种用高氏一
号培养基:可溶性淀粉 20 g, 硝酸钾 1. 0 g, 磷酸氢
二钾 0. 5 g, 氯化钠 0. 5 g, 硫酸镁(MgSO4·7H2O)
0. 5 g, 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0. 01 g, 琼脂 20 g,
蒸馏水 1000 mL, pH 7. 2 ~ 7. 4.
保藏培养基为酵母淀粉琼脂培养基:可溶性淀
粉 10 g, 酵母膏 2 g, 琼脂 20 g, 碳酸钙 10 g, 蒸馏
水 1000 mL, pH 7. 0.
1郾 2郾 2 生物测定培养基摇 由于常用的微生物培养基
具有较高的渗透压, 植物无法直接在培养基上生
长, 生物测定时用稀释的 2 / 5 高氏一号培养基、1 / 4
黄豆饼粉浸液(0. 75% )培养基和 1 / 4 黄豆饼粉浸
液琼脂培养基, 琼脂则仍按 2%的比例加入. 黄豆
饼粉浸液培养基配方为:3% 黄豆饼粉浸液 1000
mL, 葡萄糖 10 g, 氯化钠 2. 5 g, 蛋白胨 3 g, 琼脂
20 g, 碳酸钙 2 g, pH 7. 2 ~ 7. 4.
1郾 2郾 3 菌种鉴定培养基摇 包括 1)高氏一号培养基.
2)明胶液化培养基:蛋白胨 10 g, 葡萄糖 5 g, 明胶
200 g, 蒸馏水 1000 mL. 3)牛奶凝固胨化培养基:
将奶粉加入 35 益的温水配制成质量浓度为 5%的
溶液,再经转速为 4000 r·min-1的离心机中离心 30
min, 去掉上层油脂, 然后将脱过脂的牛奶分装试
管, 每管 3 ~ 5 mL, 100 益间歇灭菌 3 次, 每次 30
min. 4)淀粉水解琼脂:淀粉 10 g, 磷酸氢二钾
927210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 宋圆圆等: 链霉菌 6803 菌株对植物的化感作用摇 摇 摇 摇 摇
3. 0 g, 硫酸镁 1 g, 硫酸铵 2. 0 g, 氯化钠 0. 5 g, 琼
脂 20 g, pH 7. 2. 5)纤维素生长培养基:硫酸镁 0郾 5
g, 氯化钠 0. 5 g, 磷酸氢二钾 0. 5 g, 硝酸钾 1. 0 g,
滤纸条 5 cm 伊 0. 8 cm, pH 7. 2. 6 ) 柴斯纳
(Tresner)琼脂:蛋白胨 10 g, 琼脂 15 g, 柠檬酸铁
0. 5 g, 蒸馏水 1000 mL, pH 7. 2.
1郾 2郾 4 种子培养基和液体发酵培养基摇 1)种子培养
基:4% 黄豆饼粉浸液, 2% 玉米粉浸液, 葡萄糖
10 g, 氯化钠 2. 5 g, 蛋白胨 3 g, 碳酸钙 2 g, 蒸馏
水 1000 mL, pH 7. 2 ~ 7. 4. 2)液体发酵培养基:4%
黄豆饼粉浸液, 2%玉米粉浸液,淀粉 20 g,蔗糖 20
g, 氯化铵 1 g, 磷酸氢二钾 0. 5 g, 硫酸镁 0. 5 g, 氯
化钠 0. 5 g, 硫酸亚铁 0. 01 g, 碳酸钙 3. 0 g, 蒸馏
水 1000 mL, pH 7郾 2 ~ 7郾 4.
以上所有培养基配好后均在 121 益高压蒸气灭
菌 30 min.
1郾 2郾 5 固体培养法筛选化感活性菌株摇 在固体生物
测定培养基上, 采用划线法将所分离得到的菌种接
入培养皿中,置于 30 益的生化培养箱中培养 5 d后
将消过毒的油菜、稗草种子(每皿 12 粒)置于离菌
落远近不同的位置, 排列整齐, 再在 28 益、每天光
照 9 h的生化培养箱中继续培养. 对照植物生长在
不接种放线菌的固体培养基中. 培养 4 d 后测定种
子发芽率, 培养 7 d后测定幼苗的根长和苗长.
1郾 2郾 6 液体摇瓶发酵法筛选化感活性菌株摇 在固体
培养法筛选的基础上, 将测得能够抑制植物幼苗生
长的菌种接入灭过菌的液体生物测定培养基中, 每
250 mL容量的三角瓶装 50 mL 培养基, 30 益, 180
r·min-1转速, 振荡培养 5 d, 然后对发酵液进行离
心或抽滤, 将菌丝和发酵液分开, 对发酵液进行生
物测定.
将发酵液稀释 5、10、15 倍, 分别吸取 5 mL 的
稀释液加入直径为 9 cm 的铺有定性滤纸的无菌培
养皿中,放入 20 粒消过毒的种子, 整齐排列在滤纸
上. 对照培养皿中加入不接菌种但同样摇床培养 5
d的液体生测培养基的稀释液, 植物的培养条件和
测定方法同上, 以排除培养基本身对植物生长的影
响. 每个稀释浓度 3 个重复.
1郾 2郾 7 菌种形态与生理生化特征鉴定摇 菌落培养特
征观察:将目标菌株转接于高氏一号培养基上 30 益
培养 7 d , 观察其基内菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢
子颜色, 同时观察菌落表面呈现的形状, 菌落大
小, 有无同心环, 有无分泌色素以及生长程度等
状况.
菌种生理生化特征:分别对目标菌株做明胶液
化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、滤纸条纤维素、硫化
氢试验[18] . 以检测 6803 菌株各种酶的活性.
目标菌株孢子形态特征观察:用无菌镊子取数
块无菌盖玻片, 以 45毅角的斜面插在高氏一号平板
培养基上, 用接种环取孢子接种于盖玻片内侧基部
中央位置, 30 益培养 7 d, 用镊子取出盖玻片, 轻
轻擦去外侧下部沾有的培养基, 然后进行染色, 用
光学显微镜和扫描显微镜观察孢子丝的形态, 同时
用电子显微镜观察孢子壁的表面结构.
1郾 2郾 8 菌株 16S rRNA 基因的序列分析 摇 基因组
DNA的提取:将分离得到的目标菌株接种到高氏一
号液体培养基中,于 30 益摇瓶培养 4 d后收集菌丝
体, 用 Omega 公司的基因组提取试剂盒提取基
因组.
16S rDNA的扩增:用引物 F243(5爷鄄GGATGAGC鄄
CCGCGGCCTA鄄3 爷) 和 F3R b ( 5 爷鄄CCAGCCCCACCT
TCGAC鄄3爷)扩增 16S rDNA. PCR扩增条件:94 益预
变性 5 min, 然后 94 益 30 s, 63 益 40 s, 72 益
90 s, 进行 35 个循环, 最后 72 益延伸 10 min.
16S rRNA基因序列的测定:以 F243、F3R b和 R513
[(AAC) TACGTGCCAGCAGCCGCGG ( TAA)]为测
序引物, 将 PCR 产物送上海基康生物技术有限公
司测序.
1郾 2郾 9 目标菌株的紫外线物理诱变摇 1)菌体活化培
养:取保藏目标菌种一环, 转接于高氏一号斜面培
养基上, 30 益培养 5 d, 使菌种活化.
2)细胞悬浮液的制备: 取一环活化菌种充分悬
浮于 10 mL生理盐水中, 备用.
3)诱变处理: a)取 10 mL 菌悬液于直径为 9
cm无菌培养皿中, 将皿放置于诱变箱的磁力搅拌
器上. b)开启紫外灯, 预热 20 min, 开启磁力搅拌
器, 打开皿盖, 分别用 256 nm 紫外灯(40 W)照射
20、40、60、80、100、120 s. c)将不同诱变时间处理的
菌液进行梯度稀释, 取连续 3 个梯度的稀释液各 1
mL, 用稀释平板混合法测定各处理的致死率(每个
梯度作 3 个平行). d)根据致死率及菌落形态特征
挑选出与原始菌株有异的菌落, 并转接于高氏一号
斜面基上, 保存备用.
4)生物测定筛选:将诱变所得的菌株制成菌悬
液, 用最佳液体发酵培养基和最佳发酵条件进行液
体发酵, 用发酵上清液的适当稀释液进行植物种子
生物测定, 以原始菌株的发酵上清液为对照, 挑选
出抑制率大于 10%的菌株作为正突变菌株. 用液体
0372 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
摇瓶发酵法筛选化感活性.
1郾 2郾 10 目标菌株的硫酸二乙酯(DES)化学诱变 摇
1)菌体活化培养:菌种活化与紫外线物理诱变试验
相同.
2)细胞悬浮液的制备:用 5 mL 灭过菌的 0. 1
mol·L-1、pH 7. 2 磷酸缓冲溶液将斜面基上的目标
菌株孢子冲洗下来, 然后转入 10 mL相同的缓冲液
中, 定容至 20 mL.
3)DES处理:分别加入 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、
0. 6 mL 的 DES, 使其终浓度分别为 0. 5% 、1. 0% 、
1. 5% 、 2. 0% 、 2. 5% 、 3. 0% . 然后 37 益、 200
r·min-1恒温振荡 10、20、30、40、50、60 min, 分别于
1 mL处理液中加入 0. 5 mL 25% Na2S2O3无菌溶液
中止反应. 表 1 为 DES诱变的均匀设计表.
摇 摇 4)细胞致死率计算:取不同处理的孢子悬浮液
进行剃度稀释, 将剃度稀释的菌液取 3 个连续剃度
各 1 mL, 用高氏一号培养基混匀后, 30 益培养 4
d, 平板计数, 同时用未经处理的孢子悬浮液经适
当稀释后作对照, 试验平行 3 次, 计算细胞的致
死率.
5)生物测定筛选:方法与紫外线物理诱变试验
相同.
1郾 3摇 数据处理
采用 t检验法比较接种与不接种链霉菌差异的
显著性, 邓肯氏新复极差测验法(DMRT法)测验不
同处理的差异显著性(琢 = 0郾 05). 数据统计分析采
用 SAS 6. 12 和 DPS 3. 2 软件进行.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 化感放线菌的筛选
2郾 1郾 1 固体培养法初筛 摇 将从土样中分离得到的
260 个菌株分别转接到 2 / 5 的高氏一号平板上, 用
稗草和油菜作为受体植物进行生物测定, 发现其中
大部分菌种对植物的根和苗的生长没有显著影响,
或者有微量的促进作用,只有30个菌株对植物种
表 1摇 DES诱变均匀设计试验安排表
Table 1摇 List of factor levels of orthogonal design in DES
induction
项目
Item
试验号 Experiment No.
1 2 3 4 5 6
DES浓度
DES concentration (% )
3 2 2. 5 0. 5 1. 0 1. 5
诱变时间
Induction time (min)
40 60 20 30 50 10
子的生长有抑制作用, 但对种子发芽率的影响不显
著. 在缩小筛选范围的情况下, 试验改用 1 / 4 的黄
豆饼粉浸液琼脂继续对这 30 株菌种进一步筛选.
结果发现有 7 个菌株在该固体培养基上对植物种子
的生长有较强的抑制作用.
2郾 1郾 2 液体发酵液的化感活性摇 对固体培养法筛选
出的 7 个菌株 P001、2804、8008、4205、5902、6803、
4203 进行液体摇瓶发酵,发酵液分别稀释 5、10、15
倍后进行生物测定. 表 2 显示, 6803 菌株对油菜苗
的抑制作用最强, 5、10、15 倍稀释液处理的油菜种
子发芽后, 幼苗倒伏卷曲, 对油菜苗的抑制率分别
为 60. 7% 、53. 3%和 50. 0% , 图 1 是链霉菌 6803 菌
株的发酵上清液经 5、15 倍稀释后对油菜生长的影
响. 而 4205 菌株对油菜根的抑制最明显, 15 倍稀
释液对油菜根的抑制率达到 86. 3% .
表 3 显示, 7 个菌株中 6803 菌株对稗草根和苗
的抑制作用最强, 稀释 5 倍的发酵液对稗草根和苗
的抑制率分别达到 93. 4%和 61. 3% . 稀释 10 倍的
发酵液对根和苗的抑制率分别达到 92. 6% 和
45郾 6% , 稀释 15 倍的发酵液对稗草根和苗的抑制
率分别达到 73. 9%和 45. 8% . 发酵液对两种植物
的抑制作用都随着稀释倍数的升高而降低.
2郾 1郾 3 链霉菌 6803 菌株在固体培养基上的化感活
性摇 图 2 显示, 在黄豆饼粉浸液琼脂培养基上接种
链霉菌 6803 菌株对油菜和稗草幼苗生长有强烈的
抑制作用. 油菜发芽后根和苗均不能生长, 幼苗倒
伏卷曲, 根发黑, 根长只有对照的 2% (图 3). 稗草
根长与苗高只有对照的 5. 8%和 45. 8% , 幼苗生长
4 d 后开始枯黄. 对油菜幼苗生长的抑制作用要比
对稗草的抑制作用强.
2郾 2摇 链霉菌 6803 菌株的鉴定
2郾 2郾 1 菌落培养特征观察 摇 链霉菌 6803 菌株在高
氏一号培养基上培养 7 d 后, 其孢子呈鼠灰色, 气
生菌丝呈乳白色,基内菌丝由白变褐黄色,无可溶
图 1摇 链霉菌 6803 菌株液体发酵液的 5 和 15 倍稀释液培养
的油菜幼苗
Fig. 1摇 Rape seedlings grown on different dilutions of fermented
broth of Streptomyces sp. 6803.
a)对照 Control; b)发酵液 Broth (伊15); c)发酵液 Broth (伊5).
137210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 宋圆圆等: 链霉菌 6803 菌株对植物的化感作用摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 筛选的 7 株放线菌发酵液的稀释液对油菜幼苗生长的影响
Table 2摇 Effects of different dilutions of fermented broths of seven selected strains of actinomyces on seedling growth of Bras鄄
sica campestris
菌株
Strain
5 倍稀释液
Fermented broth (伊5)
根长
Root length
(cm)
苗长
Shoot length
(cm)
10 倍稀释液
Fermented broth (伊10)
根长
Root length
(cm)
苗长
Shoot length
(cm)
15 倍稀释液
Fermented broth (伊15)
根长
Root length
(cm)
苗长
Shoot length
(cm)
CK 5. 05依0. 39d 2. 52依0. 19d 5. 85依0. 39d 3. 62依0. 19d 6. 40依0. 40d 3. 92依0. 19d
P001 0. 21依0. 05a 1. 77依0. 06bc 1. 70依0. 23b 3. 06依0. 17c 2. 38依0. 32b 2. 72依0. 13bc
2804 3. 37依0. 15e 4. 13依0. 26e 4. 69依0. 23c 3. 87依0. 19d 4. 88依0. 33c 3. 88依0. 18e
8008 2. 45依0. 28d 3. 71依0. 18e 4. 68依0. 30c 4. 07依0. 22d 4. 29依0. 33c 3. 14依0. 15c
4205 0. 31依0. 02ab 1. 41依0. 17ab 0. 94依0. 15a 2. 08依0. 13ab 0. 88依0. 16a 2. 39依0. 11b
5902 0. 77依0. 12bc 1. 91依0. 15c 2. 35依0. 20b 2. 96依0. 12c 2. 21依0. 19b 2. 74依0. 15bc
6803 1. 00依0. 06c 0. 99依0. 04a 2. 14依0. 20b 1. 69依0. 15a 1. 85依0. 24b 1. 96依0. 07a
4203 0. 36依0. 03ab 1. 84依0. 15bc 0. 76依0. 09a 2. 44依0. 21b 1. 84依0. 30b 2. 37依0. 18ab
同列不同字母表示差异显著(P<0. 05)Different letters in the same column meant significant difference at 0. 05 level. 下同 The same below.
表 3摇 筛选的 7 株放线菌发酵液的稀释液对稗草幼苗生长的影响
Table 3摇 Effects of different dilutions of fermented broths of seven selected strains of actinomyces on seedling growth of Echi鄄
nochloa crusgalli
菌株
Strain
5 倍稀释液
Fermented broth (伊5)
根长
Root length
(cm)
苗长
Shoot length
(cm)
10 倍稀释液
Fermented broth (伊10)
根长
Root length
(cm)
苗长
Shoot length
(cm)
15 倍稀释液
Fermented broth (伊15)
根长
Root length
(cm)
苗长
Shoot length
(cm)
CK 4. 82依0. 22f 7. 78依0. 25d 5. 92依0. 22d 9. 08依0. 25c 6. 52依0. 22f 9. 49依0. 24c
P001 1. 14依0. 12bc 6. 41依0. 24c 2. 76依0. 33c 8. 99依0. 42c 3. 68依0. 36de 8. 52依0. 42b
2804 2. 55依0. 17e 9. 35依0. 28e 3. 26依0. 54c 8. 85依0. 27c 4. 16依0. 22e 8. 57依0. 36b
8008 1. 65依0. 24d 8. 61依0. 40e 3. 56依0. 33c 8. 56依0. 35c 3. 27依0. 24cde 8. 41依0. 35b
4205 0. 83依0. 14bc 3. 51依0. 25a 1. 32依0. 26ab 5. 60依0. 26b 1. 41依0. 32a 5. 57依0. 14a
5902 1. 25依0. 21cd 3. 43依0. 16a 1. 84依0. 31b 4. 31依0. 24a 2. 85依0. 32cd 5. 56依0. 14a
6803 0. 32依0. 12a 3. 01依0. 23a 0. 44依0. 14a 4. 76依0. 22ab 1. 70依0. 28ab 5. 14依0. 21a
4203 0. 72依0. 10ab 4. 75依0. 25b 1. 01依0. 15ab 4. 96依0. 47ab 2. 55依0. 47bc 5. 73依0. 36a
图 2摇 在固体培养基上接种链霉菌 6803 菌株后油菜(A)和
稗草(B)幼苗生长状况
Fig. 2摇 Seedlings of Brassica campestris (A) and Echinochloa
crusgalli (B) grown on the solid media inoculated with Strepto鄄
myces sp. 6803.
玉:对照 Control; 域:接种 Inoculation. 下同 The same below.
图 3摇 在固体培养基上接种链霉菌 6803 菌株对油菜(A)和
稗草(B)幼苗根长和苗高的影响
Fig. 3摇 Effects of inoculation with Streptomyces sp. 6803 on root
length and shoot height of the seedlings of Brassica campestris
(A) and Echinochloa crusgalli (B) grown in the solid media.
a)根 Root; b)苗 Shoot.
性色素分泌. 菌落圆形, 粉状, 生长速度较快,培养
基上具有很浓的土腥味.
2郾 2郾 2 菌种生理生化特性 摇 链霉菌 6803 菌株能够
2372 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
在明胶培养基中很好地生长, 而且能够使其液化;
也能够使脱脂牛奶培养基先凝固后胨化;向平板上
滴加碘液时, 能够在菌落周围呈现透明圈, 产淀粉
酶;同时还能够在无碳源合成溶液中的滤纸条上生
长良好, 产纤维酶素;但不能够在柴斯纳培养基上
产生黑色素, 说明该菌种不产 H2S.
2郾 2郾 3 孢子丝及孢子形态特征摇 将染色后的盖玻片
用显微镜观察(图 4), 较细的为气生菌丝, 在气生
菌丝的顶端为孢子丝, 呈螺旋型, 孢子丝上形成少
量的孢子.
另外, 对已经制备好的样品用浓度为 1. 5%的
锇酸固定、干燥、黄金镀膜, 再用扫描电子显微镜对
孢子进行观察(图 5), 发现孢子的形状基本一致,
呈椭圆状,表面结构光滑, 孢子大小基本一致, 为
(1. 03 ~ 1. 12) 滋m 伊(0. 57 ~ 0. 71) 滋m.
2郾 2郾 4 链霉菌 6803 菌株的 16S rRNA 基因测序摇 对
链霉菌 6803 菌株进行 16S rRNA基因序列测定获得
了 1311 个碱基[19] . 将其与 GenBank 中的序列比较
后, 发现与试验菌株 16S rRNA 基因序列相似性达
到 99. 20%以上的有 15 个菌种(表 4),它们都属于
链霉属放线菌, 其中,相似性最大是海边链霉菌
( Streptomyces maritimus ) ,同源性达到99 . 8 4 % ,
图 4摇 链霉菌 6803 菌株孢子丝形态
Fig. 4摇 Sporotrichial morphology of Streptomyces sp. 6803.
图 5摇 链霉菌 6803 菌株孢子表面结构
Fig. 5摇 Spore structure of Streptomyces sp. 6803.
表 4摇 链霉菌 6803 菌株经 16S rRNA 基因测序后所得相似
性高于 99. 20%的菌种
Table 4摇 Streptomyces species sharing up to 99. 20% identi鄄
ty in 16S rRNA sequence with Streptomyces sp. 6803
菌种
Streptomyces
species
相似性
Identity
(% )
菌种
Streptomyces
species
相似性
Identity
(% )
海边链霉菌 S. maritimus 99. 84 帕奈链霉菌 S. panayensis 99. 68
非洲链霉菌 S. africanus 99. 60 紫蓝链霉菌 S. tuirus 99. 52
斯特菲斯堡链霉菌 S. ste鄄
ffisburgensis
99. 52 深蓝链霉菌 S. cyaneus 99. 44
链霉菌 Streptomyces sp. 99. 36 阿富汗链霉菌 S. af鄄
ghaniensis
99. 44
浅绛红链霉菌 S. pur鄄
purascens
99. 28 玫瑰紫链霉菌 S. ro鄄
seoviolaceus
99. 28
沙场链霉菌 S. arenae 99. 28 近紫链霉菌 S. violatus 99. 28
紫花链霉菌 S. janthinus 99. 28 略紫链霉菌 S. violarus 99. 28
索马里链霉菌 S. soma鄄
liensis
99. 20
其次为帕奈链霉菌 ( S. panayensis),相似性为
99郾 68% , 最小的为索马里链霉菌(S. somaliensis),
16S rRNA基因序列相似性达到 99. 20% .
2郾 3摇 链霉菌 6803 菌株的菌种改良
2郾 3郾 1 紫外线物理诱变结果摇 1)紫外诱变菌体存活
曲线摇 将链霉菌 6803 菌株制成孢子悬浮液, 用紫
外线照射,时间分别为 20、40、60、80、100、120 s, 以
未经过照射的链霉菌 6803 菌株孢子悬浮液为对照.
图 6 显示,随照射时间的增加,菌体的存活率降低,
照射时间为 60 和 80 s 的存活率分别为 22郾 3%和
11. 6% , 此时的存活率偏低. 根据微生物诱变育种
中致死率和正突变株之间关系的经验值, 大量分离
该诱变剂量下的菌落, 并且结合各菌落形态的不
同, 从其他诱变剂量的平板中挑出少量的菌落转接
至高氏一号斜面基, 分离纯化后共得到 80 个菌株,
其中,照射 60 s的诱变株 40 株, 照射 80 s的 36 株,
分别占平板总菌落数的 21. 5%和 37. 1% .
图 6摇 链霉菌 6803 菌株经紫外线诱变的存活曲线
Fig. 6摇 Survival curve of Streptomyces sp. 6803 exposed to UV
irradiation for different time.
337210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 宋圆圆等: 链霉菌 6803 菌株对植物的化感作用摇 摇 摇 摇 摇
这些诱变株保存后通过生物测定进一步进行筛选.
摇 摇 2)正突变菌株筛选 摇 将经过紫外诱变处理的
菌株进行液体发酵后, 用发酵液的 10、15 倍稀释液
进行生物测定. 结果发现, 菌体诱变有正突变也有
负突变. 与原始菌株 6803 相比, 经紫外线照射 60 s
的菌株中有 5 个菌株对油菜幼苗的抑制率大于
10% , 属于正突变株(表 5), 其中 UV6004 号的抑
制作用最强, 与原始菌株相比, 抑制作用提高了
17. 3% . 正突变株占该诱变剂量下分离所得菌株的
12. 5% .
摇 摇 经紫外线照射 80 s 的菌株中有 14 个菌株对油
菜幼苗的抑制率大于 10% , 属于正突变株(表 6),
其中UV8024的抑制作用最强,与原始菌株6803相
表 5摇 链霉菌 6803 菌株经紫外线照射 60 s后所得正突变株
的 10 倍发酵稀释液对油菜幼苗生长的影响
Table 5 摇 Effects of dilute solution ( 伊 10) of fermented
broths of positive mutant of Streptomyces sp. 6803 exposed
to UV irradiation for 60 s on seedling growth of Brassica
campestris
正突变菌株
Positive
mutant
苗长
Shoot length
(cm)
抑制作用提高率
Inhibition increase
(% )
UV6004 1. 10依0. 04 17. 3
UV6016 1. 11依0. 07 16. 5
UV6018 1. 17依0. 06 12郾 0
UV6019 1. 19依0. 04 10. 5
UV6040 1. 14依0. 04 14. 3
表 6摇 链霉菌 6803 菌株经紫外线照射 80 s后所得正突变株
的 10 倍发酵稀释液对油菜幼苗生长的影响
Table 6 摇 Effects of dilute solution ( 伊 10) of fermented
broths of positive mutants of Streptomyces sp. 6803 exposed
to UV irradiation for 80 s on seedling growth of Brassica
campestris
正突变菌株
Positive mutant
苗长
Shoot length
(cm)
抑制作用提高率
Inhibition increase
(% )
UV8024 1. 05依0. 05 37. 5
UV8019 1. 09依0. 05 35. 1
UV8031 1. 15依0. 04 31. 6
UV8022 1. 20依0. 09 28. 6
UV8007 1. 21依0. 05 28. 0
UV8011 1. 22依0. 03 27. 4
UV8034 1. 27依0. 06 24. 4
UV8017 1. 28依0. 11 23. 8
UV8030 1. 36依0. 09 19. 1
UV8032 1. 36依0. 06 19. 1
UV8018 1. 44依0. 04 14. 3
UV8020 1. 45依0. 12 13. 7
UV8026 1. 48依0. 07 11. 9
UV8035 1. 48依0. 10 11. 9
比, 抑制作用提高了 37. 5% , 正突变株占该诱变剂
量下分离所得菌株的 38. 9% . 与经过紫外线照射
60 s的突变菌株相比较, 照射 80 s的菌株正突变率
高, 而且对油菜幼苗的抑制作用普遍好过经 60 s照
射的突变株.
另外, 通过菌落形态分离出的少量几株其他诱
变剂量的菌株, 其 10 倍发酵稀释液对油菜幼苗的
生长也表现出了不同的抑制作用 (表 7). 其中,
UV100鄄2 表现出了最强的抑制作用, 与原始菌株相
比, 抑制作用提高了 38. 1% . 正突变株占该诱变剂
量下分离所得菌株的 75. 0% .
2郾 3郾 2 硫酸二乙酯(DES)化学诱变结果摇 1)链霉菌
6803 菌株经化学诱变的存活率摇 将链霉菌 6803 菌
株制成孢子悬浮液,用 6 种不同浓度的 DES 和不同
的诱变时间进行化学诱变, 以未经处理的 6803 孢
子悬浮液做参照. 表 8 显示,当 DES 浓度为 1郾 5% 、
诱变 10 min 时, 链霉菌 6803 菌株的存活率最高,
达到 53. 4% . 而当 DES 浓度为 2% , 诱变 60 min
时, 链霉菌 6803 菌株的存活率最低, 只有 2郾 2% .
根据菌落形态的不同, 分别从不同处理平板上挑出
菌落, 转接至高氏一号斜面基上, 分离纯化后保
存,进一步进行生物测定筛选.
表 7摇 链霉菌 6803 菌株经紫外线照射后所得其他正突变株
的 10 倍发酵稀释液对油菜幼苗的影响
Table 7 摇 Effects of dilute solution ( 伊 10) of fermented
broths of the other positive UV mutants of Streptomyces sp.
6803 exposed to UV irradiation on seedling growth of Bras鄄
sica campestris
正突变菌株
Positive
mutant
苗长
Shoot length
(cm)
抑制作用提高率
Inhibition increase
(% )
UV100鄄2 1. 04依0. 02 38. 1
UV120 1. 38依0. 10 17. 9
UV20 1. 45依0. 05 13. 7
表 8摇 链霉菌 6803 菌株经硫酸二乙酯化学诱变的存活率
Table 8摇 Survival rates of mutants of Streptomyces sp. 6803
treated with diethyl sulfate (DES)
试验号
Experiment
No.
DES浓度
Concentration
(% )
诱变时间
Induction time
(min)
菌落数
Colony number
(ind·mL-1)
存活率
Survival rate
(% )
CK 0 0 10100 100. 0
1 3 40 314 31. 1
2 2 60 22 2. 2
3 2. 5 20 164 16. 2
4 0. 5 30 362 35. 9
5 1 50 24 2. 4
6 1. 5 10 539 53. 4
4372 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
摇 摇 2)正突变菌株筛选 摇 用不同剂量的硫酸二乙
酯对链霉菌 6803 菌株进行化学诱变后, 根据菌落
形态的不同,共分离出 48 个菌株,然后用最佳发酵
模型摇床培养, 对所得发酵上清液进行 10 倍稀释
后进行油菜幼苗的生物测定. 图 7 显示,处理 1, 即
用 3%的 DES 诱变 40 min 后, 共挑出 10 个菌株,
其中有两株为正突变株, 占该诱变剂量测试总菌株
的 20. 0% ,命名为 D101 和 D106, 与原始菌株 6803
相比, 其对油菜幼苗的抑制作用分别提高了 11. 3%
和 24. 5% . 处理 2,即用 2%的 DES诱变 60 min后,
共挑出 11 个菌株,其中两株为正突变株,占该诱变
剂量测试总菌株的 18. 2% , 命名为 D205 和 D208,
与原始菌株 6803 相比, 其对油菜幼苗的抑制作用
分别提高了 25. 2%和 16郾 6% . 处理 3, 即用 2. 5%
的 DES诱变 20 min后, 共挑出 14 个菌株, 其中两
株为正突变株, 占该诱变剂量测试总菌株的
14郾 3% , 命名为 D311 和 D312, 与原始菌株 6803 相
比, 其对油菜幼苗的抑制作用分别提高了 10. 6%和
13郾 9% . 处理 5, 即用 1%的 DES 诱变 50 min 后,
共挑出 13 个菌株,其中两株为正突变株,占该诱变
剂量测试总菌株的 15. 4% , 命名为 D501 和 D507,
与原始菌株 6803 相比, 其对油菜幼苗生长的抑制
作用分别提高了 17. 2%和 29. 8% . 处理 6 中没有
筛选到正突变株.
综合比较链霉菌 6803 菌株的硫酸二乙酯化学
诱变结果, 以 D507 号突变菌株对油菜幼苗的抑制
作用最强. 由此确定链霉菌 6803 菌株的最佳化
学诱变剂量为1%的DES诱变50 min. 在此剂量下
图 7摇 链霉菌 6803 菌株经硫酸二乙酯诱变后稀释 10 倍的发
酵液对油菜幼苗地上部生长的影响
Fig. 7摇 Effects of dilute solution ( 伊10) of fermented broths of
the mutants of Streptomyces sp. 6803 treated with diethyl sulfate
(DES) on seedling growth of Brassica campestris.
不同小写字母表示变异菌株间差异显著(P<0. 05) Different small
letters meant significant differences among mutants at 0. 05 level.
筛选出的 D507 菌株即为硫酸二乙酯诱变的最佳正
突变菌株, 其 10 倍稀释的发酵液对油菜苗的抑制
作用较原始菌株提高了 29. 8% .
3摇 讨摇 摇 论
本研究采用吹土法从采集的土壤中分离获得
6803、4205、P001、2804、8008、5902、4203 等 7 株放线
菌对高等植物具有较强的化感作用. 其中,6803 菌
株在固体培养基上对单子叶的稗草抑制作用最强
(表 3), 该菌株对油菜幼苗地上部的抑制作用也最
强(表 2). 6803 菌株液体发酵后去除菌丝体后的滤
液对油菜和稗草幼苗生长具有抑制作用, 说明该链
霉菌产生的活性物质释放到体外进入到周围环境
中. 按照目前公认的化感作用定义[1,20], 无论是高
等植物还是微生物通过向周围环境释放化学物质从
而影响邻近植物的生长发育, 均称为化感作用. 这
表明链霉菌 6803 菌株对高等植物具有化感作用.
本次试验的链霉菌 6803 基丝不断裂, 只有气
丝形成孢子链, 而且孢子丝呈螺旋状, 属于链霉菌
科链霉菌属. 根据链霉菌在高氏一号等合成琼脂上
的培养特征和孢子丝形状, 链霉菌 6803 可能属于
灰褐(Griseofuscus)类群或金色(Aureus)类群. 灰褐
类群的主要特征是在合成琼脂上气丝灰至灰褐, 基
丝褐至褐黑, 可溶性色素或有或无. 孢子丝直、钩
状或螺旋形, 孢子柱形、长圆、椭圆或球形, 表面光
滑或代刺. 金色类群的主要特征是在合成琼脂上气
丝通常由白色变为烬灰、鼠灰或褐灰, 基丝黄色至
金黄或褐黄色, 黄色可溶性色素或有或无, 孢子丝
多种多样, 直、波曲或螺旋型, 长短不等, 孢子表面
也是多种多样. 根据这些形态与生理生化特征确认
6803 菌株属于金色类群.
通过 16S rRNA 编码基因序列与基因库的 16s
rRNA序列进行同源性比较发现, 与本试验链霉菌
6803 菌株脱氧核糖核酸碱基比例和组成相似性达
到 99. 2%以上的有 15 个已知链霉菌种, 再根据菌
种的孢子表面是否带刺、是否产生可溶性色素、孢子
丝形态, 通过排除法确认链霉菌 6803 菌株极有可
能是链霉菌属金色类群中的沙场链霉菌(Streptomy鄄
ces arenae), 该菌株孢子丝螺旋状, 液化明胶慢, 淀
粉水解慢,其 16S rRNA基因序列与试验菌种的 16S
rRNA基因序列相似性达到 99. 28% .
微生物菌种改良的目的就是要人为地使某些产
物过量积累, 把生物合成的代谢途径朝人们所希望
的方向加以引导, 或者促使细胞内发生基因的重新
537210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 宋圆圆等: 链霉菌 6803 菌株对植物的化感作用摇 摇 摇 摇 摇
组合优化遗传性状, 获得所需要的高产优质的菌
种[21] . 在本次试验中采用了紫外线(UV)物理诱变
和硫酸二乙酯(DES)化学诱变两种方式进行链霉菌
6803 的菌种改良.
DNA和 RNA 的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸
收能力, 最大吸收峰在 260 nm. 紫外辐射可使 DNA
分子形成嘧啶二聚体, 即两个相邻的嘧啶共价连
接[22], 进而影响 DNA 的复制和转录, 或引起碱基
转换、颠换、移码突变或缺失[23] .本试验采用了不同
剂量的紫外线照射诱变, 通过测定对植物的化感活
性, 发现经紫外照射 80 和 100 s 的突变株 UV8024
和 UV100鄄2 对高等植物有较强的抑制作用, 其发酵
液稀释 10 倍对油菜苗的抑制作用分别比没有诱变
的对照提高了 37. 5%和 38. 1% .
化学诱变剂是一类能改变 DNA 结构, 引起
DNA变异的物质,其诱变效应与诱变剂理化特性有
很大关系[23] . 李继珩和尚广东[24]用硫酸二乙酯
(DES)处理酵母, 使其将苯甲醛转化为 L鄄苯基乙酰
基甲醇的能力提高了 23. 5% .本试验采用均匀设计
对链霉菌 6803 进行不同剂量的 DES 化学诱变, 发
现 1%的 DES诱变 50 min筛选出的突变株 D507 对
植物幼苗有较强抑制作用, 稀释 10 倍的发酵液对
油菜苗的抑制作用比没有诱变的对照提高了
29郾 8% .
本研究筛选出的链霉菌 6803 菌株对植物有很
强的化感作用, 并对菌株进行了菌种分类鉴定和诱
变育种, 为利用微生物化感特性研制新型除草剂奠
定了基础. 但采用的物理和化学常规诱变所造成的
微生物突变是随机的, 诱变的成效不够高, 工作量
巨大. 今后还需要在快速筛选正突变株的有效方法
和优化培养工艺等方面作进一步的研究.
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作者简介摇 宋圆圆,女,1982 年生,博士. 主要从事化学生态
学研究,发表论文 12 篇. E鄄mail: yyuansong@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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