全 文 ：大叶蛇葡萄乙醇提取物对 2215 细胞 HBsAg、
HBeAg表达抑制作用的实验研究*
陈梅玲1 陈夏静2 李 果1 张秀桥2△
(1 深圳市罗湖区人民医院·深圳 518001 2 湖北中医药大学药学院·武汉 430065)
摘 要 目的:研究大叶蛇葡萄乙醇提取物的抗乙肝病毒(HBV)作用。方法:将大叶蛇葡萄乙醇提取物
作用于乙肝病毒 DNA转染人肝癌细胞系 2215 细胞，以细胞病变(CPE)观察药物对 2215 细胞的毒性，用
酶联免疫测定法(ELISA)检测药物对培养 8 天的 2215 细胞分泌的表面抗原(HBsAg)和 e 抗原(HBeAg)
表达的抑制作用。结果:大叶蛇葡萄乙醇提取物的半数毒性浓度(TC50)为 250μg /ml，最大无毒浓度
(TC0)为 125μg /ml;乙醇提取物对培养 8 天的 2215 细胞 HBsAg、HBeAg 表达抑制作用的半数有效浓度
(IC50)分别为 43. 1μg /ml、54. 8μg /ml，治疗指数(TI)值分别为 5. 8、4. 7。结论:大叶蛇葡萄乙醇提取物具
一定的体外抗乙肝病毒的作用，为有效物质部位。
主题词 大叶蛇葡萄提取物 /药理学 2215 细胞 /药物作用 HBsAg /药物作用 HBeAg /药物作用
* 湖北省教育厅资助课题 No． D200716003
△通讯作者
大叶蛇葡萄 Ampelopsis megalophylla Diels et． Gilg是葡萄
科蛇葡萄属的一种药用植物，曾收载于《湖北中草药志》［1］。
现代药理研究表明葡萄科蛇葡萄属部分药用植物具有降血
压、保肝护肝、降血脂等多种药理作用［2 － 3］，但未见对大叶蛇
葡萄及其提取物体外抗乙肝病毒作用的研究报道。本课题
组曾对大叶蛇葡萄化学成分进行了较系统的提取分离［4］，
本论文在此基础上研究了大叶蛇葡萄乙醇提取物对 2215 细
胞 HBsAg、HBeAg表达的抑制作用，为后期课题组进一步探
讨大叶蛇葡萄抗乙肝病毒物质基础奠定了一定的基础。
1 材料
1． 1 细胞株 乙肝病毒 DNA 转染人肝癌细胞(HepG2)的
2215 细胞:由暨南大学张惠英老师惠赠。
1． 2 药物 大叶蛇葡萄乙醇提取物:由湖北省中药资源与
中药化学重点实验室提供，溶于适量的二甲基亚砜(DMSO)
后再用改良 RPMI － 1640 培养液稀释成不同浓度。
1． 3 试剂与仪器 改良 RPMI － 1640 培养基:美国 Hyclone
公司;G －418:美国 Gibco 公司;L －谷氨酰胺、胰蛋白酶:上
海实生细胞生物技术有限公司分装;胎牛血清:杭州四季青
生物工程材料有限公司;青霉素、链霉素:上海先锋药业有限
公司产品;HBsAg、HBeAg检测试剂盒:上海科华生物工程股
份有限公司;DMSO:Sigma 公司。RT － 2100C 酶标分析仪:
深圳雷杜生命科学股份有限公司;TDL － 40C 低速台式离心
机:上海安亭科学仪器厂。
2 方法
2． 1 改良 RPMI － 1640 培养液的制备
取 RPMI － 1640 干粉 10. 0g，溶于 1000ml 双蒸水中，过
滤除菌，培养细胞前加入灭活的胎牛血清 10%、G －
418200μg /ml、青霉素 100U /ml、链霉素 100U /ml、3%谷氨酰
胺 1%。
2． 2 2215 细胞的培养
在长满 2215 细胞的培养瓶内加 0. 25%胰酶，37℃消化
5 分钟，加 RPMl － 1640 培养液吹散，1∶ 3传代，10 天长满。
2． 3 药物细胞毒性实验
实验分无药物细胞对照组(空白组)和不同浓度药物
组，细胞消化后配制成 2 × 105 /ml，接种于 96 孔板培养板，每
孔 0. 1ml，于 37℃、5%CO2 条件下培养 24 小时，细胞长成单
层后进行实验。药物用改良 RPMI － 1640 培养液配制成溶
液，2 倍稀释，共 8 个稀释度，每浓度 3 孔，4 天换同浓度药物
培养液继续培养，以观察细胞病变(CPE)为指标，第 8 天显
微镜下观察 CPE。破坏 100%为 4;75%为 3;50%为 2;25%
为 1;无病变为 0。计算每浓度药液 3 孔平均 CPE 程度和抑
制百分率(%)。
药物细胞毒性的计算:按 Reed － Meuench法计算半数毒
性浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
TC50 = Antilog{B +(50 － ＜ 50%抑制百分率)/(＞ 50%
抑制百分率 － ＜ 50%抑制百分率)× C}
式中，A = log ＞ 50%药物浓度;B = log ＜ 50%药物浓度;
C = A － B
2． 4 药物对 HBsAg、HBeAg表达抑制作用实验
实验设细胞对照组、HBsAg 阳性和阴性对照组、HBeAg
阳性和阴性对照组及不同浓度药物组。2215 细胞按 1 × 105
个 /ml的浓度接种于 96 孔细胞培养板，每孔 0. 1ml，于 37℃、
5%CO2 条件下培养 24 小时，在实验药液无毒浓度下 2 倍稀
释，共 5 个稀释度，每个浓度 3 孔，于 37℃、5%CO2 条件下培
养 4 天后换原浓度药物培养液继续培养，分别收集第 4、8 天
培养液，－ 20℃冰冻保存。药效计算:用 HBsAg、HBeAg酶联
免疫试剂盒测定 HBsAg、HBeAg，方法按照说明书，用酶标分
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析仪测定每孔 OD值。计算细胞对照及实验药液每浓度 OD
值均值(x)及标准差(s) ，与细胞对照组比较抗原抑制率
(%) ，半数有效浓度(IC50)及治疗指数(TI) ，计算药液各稀
释度 HBsAg、HBeAg和细胞对照组间 OD值的差别。
①抗原抑制百分率(%)=(细胞对照组 OD值 －给药组
OD值)/细胞对照组 OD值 × 100
②IC50 = Antilog{B + (50 － ＜ 50% 抑制百分率)/(＞
50%抑制百分率 － ＜ 50%抑制百分率)× C}
式中，A = log ＞ 50%药物浓度;B = log ＜ 50%药物浓度;
C = A － B
③TI = TC50 / IC50
2． 5 统计方法 采用 SPSS16. 0 版软件进行 t检验。
3 结果
3． 1 大叶蛇葡萄乙醇提取物在 2215 细胞培养中的毒性
药物浓度依次为 1000、500、250、125、62. 5、31. 2、15. 6μg /ml，
第 8 天显微镜下观察 CPE。大叶蛇葡萄乙醇提取物对 2215
细胞的 TC50为 250μg /ml，TC0 为 125μg /ml。
3． 2 大叶蛇葡萄乙醇提取物在 2215 细胞培养中对 HBsAg、
HBeAg表达的抑制作用 结果见表 1。乙醇提取物对培养 8
天的 2215 细胞 HBsAg、HBeAg 表达抑制作用的 IC50分别为
43． 1μg /ml、54． 8μg /ml，TI值分别为 5. 8、4. 7。
表 1 大叶蛇葡萄乙醇提取物不同浓度药物培养 2215 细胞 HBsAg、HBeAg表达的测定(n = 3)
药物
药物浓度
(μg /ml)
HBsAg HBeAg
4d 8d 4d 8d
OD值
(x ± s)
抑制率
(%)
OD值
(x ± s)
抑制率
(%)
OD值
(x ± s)
抑制率
(%)
OD值
(x ± s)
抑制率
(%)
空白对照 0． 6390 ± 0． 0071 0． 1865 ± 0． 0078 0． 3553 ± 0． 0311 0． 1041 ± 0． 0014
125 0． 3670 ± 0． 0057* 42． 5 0． 0400 ± 0． 0043＊＊ 78． 5 0． 2675 ± 0． 0120* 24． 7 0． 0410 ± 0． 0014＊＊ 60． 6
62． 5 0． 3745 ± 0． 0007* 41． 4 0． 0755 ± 0． 0008＊＊ 59． 5 0． 2645 ± 0． 0163* 25． 6 0． 0535 ± 0． 0064＊＊ 51． 4
乙醇提取物 31． 2 0． 5840 ± 0． 0198 8． 6 0． 1090 ± 0． 0078* 41． 6 0． 2455 ± 0． 0134* 30． 9 0． 0585 ± 0． 0035* 43． 8
15． 6 0． 4170 ± 0． 0071* 34． 7 0． 1395 ± 0． 0036* 25． 2 0． 2450 ± 0． 0198* 31． 1 0． 0560 ± 0． 0042* 46． 2
7． 81 0． 3630 ± 0． 0042* 43． 2 0． 1225 ± 0． 0009* 34． 3 0． 2755 ± 0． 0148 22． 4 0． 0775 ± 0． 0035* 26． 0
与空白对照组比较* P ＜0. 05，＊＊P ＜0. 01
4 讨论
HBV － DNA克隆转染的人肝癌细胞(HepG2)的 2215 细
胞系经自行传代培养，细胞存活良好，并分泌大量的 HBsAg、
HBeAg，为评价抗 HBV 药物提供可靠的研究方法。用 TI 值
来判断药物在体外对乙肝病毒的作用，当 TI ＞ 2 时，为低毒
有效;2 ＞ TI ＞ 1 时，为高毒低效;TI ＜ 1 时为毒性作用
强［5 － 7］。本研究结果表明，大叶蛇葡萄乙醇提取物的 TC50为
250μg /ml;培养 8 天时，对 HBsAg的 IC50和 TI分别为 43． 1μ
g /ml、5． 8;对 HBeAg的 IC50和 TI 分别为 54． 8μg /ml、4． 7，提
示大叶蛇葡萄乙醇提取物对乙型肝炎病毒细胞转染的 2215
细胞中的 HBsAg、HBeAg 均有一定的抑制作用，且 125μg /
ml、62． 5μg /ml浓度组与空白对照组比较对 HBsAg、HBeAg
的表达有极显著抑制作用(P ＜ 0． 01) ，证实乙醇提取物为大
叶蛇葡萄体外抗乙肝病毒的有效物质部位。
参考文献
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(收稿:2011 － 09 － 21

)
(上接第 307 页)用［5］。本实验结果显示宣痹汤可在基因和
蛋白水平降低 TGF － β1 在肾脏的表达，提示宣痹汤治疗 IgA
肾病的可能机制与下调 TGF － β1 的表达有关，可能是因此
而减少 ECM的合成，进而延缓 IgAN肾小球硬化的进展。
参考文献
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·033· 中国中医药科技 2012 年 7 月第 19 卷第 4 期 July 2012 Vol. 19 No. 4