全 文 ：福建农林大学学报(自然科学版) 第 39卷 第 3期
JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition) 2010年 5月
收稿日期:2009-11-25 修回日期:2010-02-26
基金项目:广东省农业攻关计划资助项目(2006B20201036).
作者简介:范学翠(1984-),女 ,硕士研究生.研究方向:果树种质资源改良及遗传育种.通讯作者胡桂兵(1969-),男,博士 ,教授 ,博士生导
师.研究方向:果树遗传育种和生物技术.Email:guibing@scau.edu.cn.
无籽八月橘花粉育性观察
范学翠 , 秦永华 , 叶自行 , 吴筱颖 , 胡桂兵
(华南农业大学园艺学院 ,广东 广州 510642)
摘要:运用酸解及改良卡宝品红染色压片相结合的方法 , 对无籽八月橘及其有籽原种的花粉母细胞减数分裂过程 、花粉粒
形态 、生活力 、发芽率和畸形率等指标进行了观察.结果表明 , 无籽八月橘花粉母细胞减数分裂正常 ,能形成正常的四分孢
子 , 且花粉的育性较强 ,与其有籽原种的育性无显著差异 ,表明无籽八月橘无籽与花粉育性无关.
关键词:无籽八月橘;宽皮橘;花粉育性;雄配子体
中图分类号:S666.2 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2010)03-0246-05
PollenfertilityofthenewmandarincultivarWuzibayueju(CitrusreticulataBlanco)
FANXue-cui, QINYong-hua, YEZi-xing, WUXiao-ying, HUGui-bing
(ColegeofHorticulture, SouthChinaAgriculturalUniversity, Guangzhou, Guangdong510642, China)
Abstract:Meiosisprocessesofpolenmothercelsofnewseedlessmutation-Wuzibayueju(CitrusreticulataBlanco)anditsoriginal
cultivar-Bayueju(C.reticulataBlanco)wereobservedusingacidolysisandmodifiedCarbolfuchsinstainingtechnique.Pollenmor-
phology, polenviability, germinatingpercentageanddeformityratewerealsoinvestigatedindetail.Theresultsindicatedthatthe
malegameteofWuzibayuejuwasnormal, andnormaltetradswereobserved.Therewasnosignificantdiferenceinfertilitybetween
thetwocultivars.Therefore, thepolensterilitywasnottheseedlessreasonofthenewcultivar.
Keywords:Wuzibayueju;mandarin;pollenfertility;malegamete
柑橘的无籽性(也称无核性)是一个优良的经济性状 ,对于鲜食和加工都具有重要意义.目前 ,国际柑
橘市场上一流的名牌品种几乎都是无核的 [ 1] .因此 ,研究无核柑橘的成因 、机制及其选育途径 ,是育种工
作的一项重要任务.八月橘(CitrusreticulataBlancocv.`Bayueju )是我国特有的 、比较早熟的宽皮橘品种
之一 , 10月下旬开始成熟 ,果肉清甜 ,早结丰产性好 ,因其早熟及优良的品质而深受消费者的喜爱 ,但原有
的八月橘由于种子太多(平均单果种子数在 16.6粒左右)而限制了其进一步发展 [ 2] .本课题组通过芽变
选种途径选育出了一个优良的无籽芽变株系 ,连续观察 2 a其平均单果种子数均为 1.9粒 ,符合无籽的标
准.因此 ,对其无籽机理进行深入研究在理论和实践上均有重要的意义.
柑橘无籽的原因有许多 ,包括雄性不育 [ 3-4] 、胚囊育性下降或败育[ 5-6] 、自交不亲和 [ 7-8] 、胚胎败
育 [ 9] 、多倍体造成不育 [ 10]以及外在因素影响 [ 11-12] .其中 ,柑橘的雄性不育主要指花粉败育 ,是产生无籽柑
橘最重要 、最普遍的原因 ,绝大部分的无核或少核柑橘品种都与花粉败育有关.因此 ,我们对无籽八月橘雄
配子体的育性等进行了系统研究.
1 材料与方法
1.1 材料
以华南农业大学果园内 2a生无性繁殖株系无籽八月橘和有籽八月橘(CK)为材料.
1.2 方法
1.2.1 花粉生活力及发芽率检测 (1)分别采用 KI-I2和醋酸洋红染色法测定花粉生活力.采集即将开放
的新鲜花蕾 ,收集花药中的花粉 ,用镊子蘸取花粉 ,轻轻涂在载玻片上 ,用 1%KI-I2染色 5 min后 ,观察被
染成黑色的花粉占整个花粉数的百分率;0.5%醋酸洋红染色 5 min后 ,观察被染成红色的花粉占整个花
DOI :10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2010.03.011
粉数的百分率.每个材料至少观察 1000个以上的花粉粒 , 4次重复.(2)采用悬滴培养法测定花粉发芽率.
萌发培养基为 1%琼脂 +10%蔗糖 +0.01%硼酸 ,用玻璃棒或者吸管取培养液 ,滴在双凹载玻片上 ,形成
直径约 1 cm的液滴.制备花粉悬浮液滴在固体培养基上 ,使花粉分散均匀 ,倾去多余的水分 ,将播有花粉
的载玻片放在铺有吸水纸的培养皿中 ,盖住保湿 , 28 ℃暗培养 18 h左右 ,统计花粉发芽率.以花粉管超过
花粉直径为花粉发芽的直观标志.
1.2.2 花粉粒形态观察 以无籽八月橘 、有籽八月橘的花粉为材料 ,采集树冠外围新鲜的 、含苞待放的花
蕾分别装于信封内带回 ,置于干燥器内让其自然散粉.干燥的花粉过 80目筛以筛取花粉 ,花粉置于 4℃干
燥保存.用甘油冻胶制片以供光学显微镜观察 ,同时取该处理后的花粉进行扫描电子显微镜观察.在光学
显微镜(OLYMPUSBH-2)及环境扫描电子显微镜(FEI-XL30,工作电压 15 kV)下观察花粉群体形态 、整
体的畸形率及花粉极面 、赤道面 、萌发孔(沟)和外壁结构特征.花粉形态的描述基本按埃尔特曼[ 13]的术
语.在扫描电镜下 ,以 500倍观察花粉总体形态及整体的畸形率 , 3000倍观察花粉极面观 、赤道面观以及
萌发孔(沟)的特点 , 7000倍观察花粉外壁结构特征.
花粉畸形率测定采用涂布法制片.取少量花药于清洁载玻片上 ,将花粉粒压出 ,使之均匀展布在载玻
片上 ,重复制片 ,置光学显微镜下观测 10个视野 ,取其平均值.
1.2.3 花粉母细胞减数分裂观察 于植株现蕾期的晴天上午 8:30-11:00采集无籽八月橘和有籽八月
橘花蕾发育正常 、不同直径大小的单顶花或有叶花 ,置于对二氯苯饱和水溶液预处理 3-4 h(10-16 ℃)
后 ,用改良 Carnoy固定液 Ⅱ(95%乙醇∶冰醋酸∶氯仿 =5∶3∶2)固定 12-24 h,再用梯度酒精 (95%※90%
※85%※80%※75%※70%)处理 ,每次 10min,最后置于 70%乙醇中 ,并保存在 4℃冰箱内备用.采用高
娟等[ 14]酸解结合改良卡宝品红染色压片法观察花粉母细胞减数分裂过程.选择不同时期分裂相典型的花
粉母细胞在光学显微镜下观察 ,并在 100倍油镜下用 OLYMPUSDP70数码显微照相系统进行拍照.
1.2.4 田间人工授粉试验 以春甜橘为母本 ,分别以无籽八月橘 、有籽八月橘为父本进行人工授粉 ,以鉴
定无籽八月橘花粉育性.7-8d后雌蕊枯萎时及时拆袋 ,统计坐果率.第 2次生理落果后 ,再次检查杂交果
实的坐果率.在果实即将成熟时统计授粉组合的坐果率 ,分析杂交果实的种子数.
2 结果与分析
2.1 花粉生活力及发芽率
表 1 无籽八月橘和有籽八月橘花粉活力观察 1)
Table1 FertilityofthepolenfromWuzibayuejuandBayueju(CK)
材料 花粉生活力 /%KI-I2 染色 醋酸洋红染色
花粉发芽率 /%
无籽八月橘 95.93±0.002a 88.92±0.013a 41.25±0.019a
有籽八月橘(CK) 93.45±0.009a 86.00±0.012a 46.80±0.016b
1)同列数字后附不同小写字母者表示差异达 0.05显著水平.
从花粉生活力和发芽率的测定结果(表 1
和图 1-1-6)可以看出 ,无籽八月橘 、有籽八月
橘的生活力和发芽率无显著差异 ,生活力均达
到 85%以上 ,发芽率也均达到 40%以上.花粉
育性指标的初步测定结果表明 ,无籽八月橘的
雄配子(花粉)发育是正常的.
2.2 花粉粒形态
利用光学显微镜及扫描电镜对花粉粒进行形态观察表明 ,无籽八月橘和有籽八月橘(CK)的花粉粒形
态无显著差异(表 2和图 1-7-22).极面观为四裂圆形 , 4条萌发沟(孔),沟孔相交呈十字形(图 1-14, 15,
20 , 21);赤道面观为椭圆形至圆形(图 1-12, 13 , 18, 19),花粉粒表面均为光滑波浪形的网状雕纹(图 1-16,
22),畸形花粉粒很少(表 2和图 1-11, 17).
表 2 无籽八月橘和有籽八月橘花粉粒形态观察 1)
Table2 TheequatorialaxesandpolaraxesofpolenbetweenWuzibayuejuandBayueju(CK)
材料 赤道轴长 /μm 极轴长 /μm 赤道轴长 /极轴长 花粉畸形率 /%
无籽八月橘 24.92±0.16a 25.56±0.24a 0.97a 4.59±0.004a
有籽八月橘(CK) 24.90±0.23a 25.24+0.22a 0.99a 5.44±0.014a
1)同列数字后附不同小写字母者表示差异达 0.05显著水平.
247 第 3期 范学翠等:无籽八月橘花粉育性观察
1.无籽八月橘花粉生活力 KI-I2染色;2.无籽八月橘花粉生活力醋酸洋红染色;3.无籽八月橘花粉发芽率;4.有籽八月橘花粉生活力 KI-I2
染色;5.有籽八月橘花粉生活力醋酸洋红染色;6.有籽八月橘花粉发芽率;7-8.无籽八月橘花粉群体形态(甘油冻胶封片);9-10.有籽八
月橘花粉群体形态(甘油冻胶封片);11.无籽八月橘花粉群体形态(500×);12-13.无籽八月橘花粉粒赤道面观(3000×)示正常萌发孔;
14-15.无籽八月橘花粉极面观(3000×)示四裂沟;16.无籽八月橘花粉表面纹饰及萌发孔(7000×);17.有籽八月橘花粉群体形态(500
×);18-19.有籽八月橘花粉赤道面观(3000×)示萌发孔;20-21.有籽八月橘花粉极面观(3000×)示四裂沟;22.有籽八月橘花粉表面纹
饰及萌发孔(7000×);23-32.无籽八月橘花粉母细胞减数分裂间期 、前期Ⅰ 、中期Ⅰ 、后期 Ⅰ 、末期Ⅰ 、前期Ⅱ 、中期Ⅱ 、后期Ⅱ 、末期 Ⅱ(四
分孢子期)染色体形态;33-42.有籽八月橘花粉母细胞减数分裂间期 、前期Ⅰ 、中期Ⅰ 、后期Ⅰ 、末期Ⅰ 、前期Ⅱ 、中期Ⅱ 、后期Ⅱ 、末期Ⅱ(四
分孢子期)染色体形态;43-44.无籽八月橘花粉母细胞减数分裂后期 Ⅰ染色体桥;45-47.有籽八月橘花粉母细胞减数分裂后期Ⅰ中染色
体桥和落后染色体;48.春甜橘×无籽八月橘杂交果实;49.春甜橘 ×有籽八月橘杂交果实.标尺:2, 3, 6=70μm;7, 9, 11, 17=50 μm;1, 4, 5
=40μm;8, 10, 24, 29, 33=20μm;12-15, 18-21, 25-28, 30-32, 34-47=10μm;16, 22=5μm.
图 1 无籽八月橘和有籽八月橘花粉试验结果图
Fig.1 TheresultsofpolenexperimentbetweenWuzibayuejuandBayueju
248 福建农林大学学报(自然科学版) 第 39卷
2.3 花粉母细胞减数分裂
对不同大小的八月橘花蕾进行观察 ,可观察到八月橘花粉母细胞减数分裂各个时期的分裂相.多数无
籽八月橘和有籽八月橘花粉母细胞经过 2次减数分裂即前期 Ⅰ (图 1-24, 25, 34, 35)、中期 Ⅰ (图 1-26,
36)、后期Ⅰ(图 1-27, 37)、末期 Ⅰ(图 1-28, 38)、前期 Ⅱ(图 1-29, 39)、中期 Ⅱ(图 1-30, 40)、后期 Ⅱ(图 1-
31 , 41)和末期 Ⅱ(图 1-32, 42)后 ,均能形成 4个正常的小孢子.
少数八月橘花粉母细胞减数分裂过程中出现了染色体行为异常现象.即少数无籽八月橘花粉母细胞
在减数分裂后期 Ⅰ时 ,因纺锤丝牵引 ,二价体彼此分离并移向细胞两极 ,可观察到染色体桥 (图 1-43-
44);而有籽八月橘花粉母细胞减数分裂过程中 ,在后期 Ⅰ同样出现了染色行为的异常现象 ,可观察到染
色体桥及落后染色体(图 1-45-47).
无籽八月橘和有籽八月橘多数花粉母细胞减数分裂正常 ,可形成多数可育的花粉 ,少数花粉母细胞减
数分裂的异常不影响花粉的整体育性 ,同时也解释花粉活力未达到 100%的原因.这与花粉活力测定结果
相一致.
2.4 田间人工授粉试验
分别对 2个杂交组合统计 3次坐果率后 ,于 11月初采果统计杂交果实种子数(表 3及图 1-48, 49).结
果表明 ,无籽八月橘为父本的杂交组合平均单果种子数显著多于有籽八月橘的授粉组合 ,说明无籽八月橘
花粉的育性较有籽八月橘的花粉强 ,这可能与花粉取样差异有关.无籽八月橘的花粉具有较强的育性 ,与
上述试验结果相吻合.
表 3 各杂交组合的坐果率及平均单果种子数 1)
Table3 Fruitsetingrateofdiferentcrossingcombinationsandaverageseednumberofeachfruitindiferentcrossingcombinations
杂交组合 授粉花数朵
坐果率 /%
第 1次检查 第 2次检查 第 3次检查
平均单果种
子数 /粒
春甜橘 ×无籽八月橘 76 73.68 58.43 44.74 8.4±0.9a
春甜橘 ×有籽八月橘(CK) 119 73.95 68.07 32.77 6.1±0.6b
1)同列数字后附不同小写字母者表示差异达 0.05显著水平.
3 讨论
3.1 不同染色方法对八月橘花粉生活力的影响
Kl-I2染色法是根据淀粉遇碘变蓝的特性确定花粉活性.其局限性如下:一是测定值偏高 ,失去活力的
花粉(存在淀粉)仍可显色;二是不适宜淀粉含量少的种类.已有报道表明 ,淀粉在花粉中的积累与其育性
是高度相关的[ 15] .因此 ,本研究采用 2种不同染色方法测定花粉生活力 ,探究其对花粉生活力测定结果的
影响.KI-I2染色后 ,无籽八月橘和有籽八月橘的花粉生活力均达到 90%以上;醋酸洋红染色后 ,两者的花
粉生活力也均达到 85%以上.2种测定方法均可较好地测定八月橘花粉生活力 ,且花粉经 KI-I2染色比醋
酸洋红染色更灵敏.以上表明八月橘花粉内含物中可能存在大量的淀粉 ,这与花粉的高育性相一致.
3.2 八月橘花粉母细胞减数分裂观察
柑橘花粉母细胞减数分裂时期的花蕾大小随品种而异.一般宽皮柑橘类 3.0 mm左右 、橙类 4.0 mm
左右 、柚类 5.0mm左右 ,采样时间大多在晴天上午 8:30-11:00[ 16] .本研究发现 ,采摘花萼已破绽 、花冠微
露而紧裹的花蕾 ,可以较好地观察到八月橘花粉母细胞减数分裂各个时期的分裂相 ,且采样时间也在晴天
上午 8:30-11:00为宜 ,与前人的研究 [ 16 -17]相符.经对二氯苯饱和水溶液预处理的花蕾比未经处理直接
固定的花蕾 ,可观察到更为清晰的染色体行为 ,更利于花粉母细胞减数分裂相的观察.
3.3 无籽八月橘的雄配子体育性
柑橘花粉不育或低育的主要原因是花粉母细胞不发育 、退化 、减数分裂异常或小孢子早期退化等.俞
长河等 [ 18]对蕉柑染色体核型研究发现 ,育性不正常的焦柑可能发生了某些染色体节段的易位 ,导致减数
分裂不正常.梁国鲁等 [ 19]观察红橘小孢子母细胞减数分裂染色体行为发现 ,在红橘小孢子母细胞减数分
裂过程中出现了单价体 、双核 、落后染色体 、三分体等异常现象 ,导致了红橘无籽果的产生.胡志勇等 [ 3]对
249 第 3期 范学翠等:无籽八月橘花粉育性观察
无核瓯柑研究发现 ,无核瓯柑几乎全部的四分体都表现出异常 ,导致无核瓯柑花粉败育.伊华林等 [ 20]研究
伏令夏橙及 Page橘柚花粉母细胞减数分裂染色体行为发现 ,染色体后期 Ⅰ出现染色体桥和落后染色体 ,
同时出现多分体 ,导致花粉的育性低.张青闪等 [ 4]对 9个红江橙无核(少核)选系的花粉母细胞减数分裂
行为观察发现 , 7个选系存在较高频率的染色体异常配对和异常分离现象 ,导致花粉败育.Medeiraetal[ 21]
认为雄性不育是因为花粉在末期 I胞质分裂异常 ,绒毡层退化不合时宜 ,没能溶解花粉母细胞的细胞壁和
绒毡层 ,使酶或孢粉质的前体不能到达小孢子 ,阻碍蛋白质合成 ,导致花粉母细胞减数分裂不正常和雄性
不育.本研究表明 ,无籽八月橘多数花粉母细胞减数分裂正常 ,可形成正常大小均匀的四分孢子 ,少数花粉
母细胞减数分裂出现了染色体桥或落后的染色体 ,但与有籽八月橘花粉母细胞减数分裂无显著差异 ,不影
响花粉的整体育性.陈力耕等[ 22]将柑橘花粉的育性分为 4类:发芽率超过 20%者为高育型;5.0% -
19.9%者为中育型;0.6%-4.9%者为低育型;0.5%以下者为不育型.根据此分类 ,本研究中无籽八月橘和
有籽八月橘的花粉均属于高育型 ,花粉育性较强.
4 结论
本研究对八月橘花粉生活力 、发芽率 、畸形率 、花粉形态 、花粉母细胞减数分裂与花粉育性关系进行了
综合分析.结果表明 ,无籽芽变八月橘的雄性可育且育性较强.由此确定 ,雄性不育不是无籽八月橘无籽的
原因 ,其无籽原因可能是自交不亲和 、胚囊败育或胚胎中途败育等 ,具体原因有待进一步研究.
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(责任编辑:陈幼玉)
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