全 文 ：中国农学通报 2010,26(15):32-37
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
野罂粟既是特殊的中药材，也是价值极高的庭园
观赏植物，但是高感霜霉病。对于霜霉病常采用化学
方法防治，对环境污染严重。为此，利用现代生物技术
基金项目：甘肃省科技厅项目“特色农作物生物技术育种创新团队”（O98TTCH002）、“用RNAi技术创新特种药材新品种研究”（0708NKCH076）；甘
肃农垦集团有限责任公司资助项目“选用抗逆基因培育特种药材抗霜霉病品种研究”。
第一作者简介：魏玉杰，男，1967年出生，甘肃通渭人，甘肃省农垦农业研究院特种药材作物研究所所长，高级农艺师，在读博士，主要从事特用植物
生物技术育种研究,承担《用RNAi技术创新特种药材新品种研究》、《甘肃省啤酒花脱毒种苗丰产技术试验与丰产示范》等多项科研课题。发表科技
论文20余篇。通信地址：733006甘肃省武威市黄羊镇新镇路234号，E-mail:gswwwyj67@163.com。
通讯作者：何庆祥，男，1964年出生，甘肃秦安人，甘肃省农垦农业研究院院长，副研究员，主要从事农作物育种。
收稿日期：2010-03-02，修回日期：2010-05-05。
花粉介导法将萝卜抗菌肽基因导入野罂粟的影响因素研究
魏玉杰 1，张金文 2，何庆祥 1
（1甘肃省农垦农业研究院，甘肃武威 733006；2甘肃农业大学，兰州 730070）
摘 要：以野罂粟开放花蕾为受体，载有萝卜抗菌肽AFP(antifungal protein)基因的质粒pBIAFP为供体，
在不同浓度的蔗糖溶液中，加入新鲜花粉与含有目的基因的质粒DNA，应用SKH250LH型超声波震荡
器进行震荡处理得到花粉处理液，在不同的时间用带有Coolsnap的OLYPUS光学显微镜下观察野罂粟
花粉萌发情况；在不同授粉时间后，辅以人工授粉的方法将花粉处理液滴注野罂粟柱头上，套袋后获得
种子,测定其结实率。实验证明：利用花粉介导法进行萝卜抗菌肽基因转化，以蔗糖浓度 11%,处理后
10-15 h后的野罂粟花粉萌发最好；在蔗糖浓度8%的溶液中，以5 h的结籽量较好。后代经卡那霉素筛
选和PCR检测，初步证明外源AFP基因整合到野罂粟基因组中,并获得转基因T1代。为特殊中药材育
种提供一个新方法。
关键词：野罂粟；花粉介导法；基因转化
中图分类号：S336 文献标志码：A 论文编号：2010-0556
Study on the Influence Factors about Transferring Radish Peptide
Gene to Wild Opium Poppy Using Pollen-mediated
Wei Yujie 1, Zhang Jinwen2 , He Qingxiang1
(1Agricultural Research Institute Farm in Gansu Province, Wuwei Gansu 733006;
2Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)
Abstract: Selecting opening Papaver nudicaule bud as receptors , plasmid pBIAFP containing the radish
peptide AFP (antifungal protein) gene as donor, in different concentrations of cane sugar solution, adding fresh
pollen and plasmid DNA containing the target gene , shocking with SKH250LH-type ultrasonic oscillator for
treatment pollen processing fluid. After all these process, we observed its pollen germination under OLYPUS
light microscope with Coolsnap at different times. After different pollination time, dropping the pollen on wild
poppy stigma supplemented with artificial method, bagging for seed and measuring seed-setting rate. The
results show that, after transformation of radish peptide with pollen-mediated method, 11% sucrose
concentration and 10-15 h treatment is best for wild poppy pollen germination, when the sucrose solution
concentration is 8%, 5 h can get better seed-setting rate. After future kanamycin selection and PCR detection,
we verified that exogenous AFP genes integrate into the genome of wild poppy initially and obtained transgenic
T1 generation. It provide a new approach for special Chinese herbal medicine breeding.
Key words: Papaver nudicaule; pollen-mediated method; gene transformation
魏玉杰等：花粉介导法将萝卜抗菌肽基因导入野罂粟的影响因素研究
育种培育野罂粟高抗霜霉病品种就显得十分必要。抗
菌肽是一类对细菌、真菌等微生物有抑制或杀灭作用
的小分子肽，它能被细菌、真菌或物理的、化学的刺激
所诱导，有些抗菌肽甚至在植物体内能形成组成性的
表达。它不仅能抗多种细菌，而且可以抑杀真菌、病毒
等，因而在植物育种基因工程领域中具有广阔的应用
前景[1]。抗菌肽基因工程在农业上的应用，主要是用
于转化农作物，培养抗病品种。抗菌肽基因工程在
模式植物烟草与马铃薯抗青枯病研究中首先获得成
功 [2]，随后又用于水稻白叶枯病菌和细条病菌、苹果的
梨火疫病、菊花和辣椒等的细菌、真菌病，均取得了一
定效果，但对特殊中药材野罂粟抗霜霉病的相关研究
还未见报道；同时，基因转化多也采用基因枪法、花粉
管通道法 [3-4]、农杆菌介导法 [5]等多种方法，花粉介导
法[6]的应用也越来越广泛，但在野罂粟上，利用花粉介
导法转化的研究尚属首次。
1 材料与方法
1.1 材料
野罂粟花粉受体材料由甘肃省农垦农业研究院提
供，pBIAFP质粒由甘肃亚盛集团博士后科研工作站提
供。pBIAFP质粒包含有萝卜抗菌肽基因和卡那霉素
抗性标记基因。
1.2 方法
1.2.1 质粒DNA的准备 采用碱裂解法大量制备质粒，
并用Bio-radAurum质粒纯化试剂盒纯化质粒，纯化后
质粒经电泳检测、紫外分光光度计测定浓度，用 pH
8.0 TE溶液稀释至工作浓度 250 μg/mL。萝卜抗菌肽
基因长度240个碱基，编码79个氨基酸。
1.2.2 转化方法 在野罂粟盛花期，前 1天 19:00~21:00
时，将第2天要开放的花蕾人工去雄，然后挂牌标记并
套袋以备处理用，同时选取第 2天将开放的主枝花序
进行套袋，以备取花粉用。次日5:00~8:00时取当天开
花的套袋植株的花粉，悬浮在设计好的介质溶液（一定
浓度的蔗糖溶液）中，采用功率250 W、声强为40 KHZ
的超声波处理溶液，处理时间10 s，间隔时间8 s，连续
振动3次，处理后用140目尼龙滤网过滤，除去杂质，置
于 4℃的冰箱中保存以待授粉用，第 1次超声波处理，
目的是使花粉粒形成小孔，此时加入50 μg(即200 μL)
质粒DNA，二次超声时加入 100 μg(即 400 μL)质粒
DNA。质粒与花粉粒的混合比例为 1:(10000~
20000)。然后用处理过的花粉授于前1天去雄的植株
柱头上（要求在正午13:00~15:00时授粉），自授粉之日
起，5~6天后去袋，使处理的授粉株充分发育。为达到
一定的基因转化效率，外源质粒DNA的浓度应不低于
40 μg/L。所用工具必须消毒，质粒必须放在冰盒中进
行。
1.2.3 转化植株的卡那霉素筛选 田间种植转化野罂粟
种子，生长期间不进行间苗。待苗长至7叶1心时，用
6.5 g/L的卡那霉素对其进行喷雾，连续喷雾5次，每天
2次，时间在 9:00以后。喷雾后 3天，对其出现黄斑叶
的小苗剔除；现蕾期，用 7.5 g/L的卡那霉素对其进行
再次筛选，采用涂抹的方法，连续涂抹 4次，涂抹后 3
天，继续对变黄的植株进行剔除；由于涂抹时有遗漏的
植株，间苗后再一次用7.5 g/L的卡那霉素对其进行涂
抹，继续剔除叶片变黄的植株。后对未显症的植株进
行分子生物学检测。开花前进行套袋强制自交，成熟
后收获种子。
1.2.4 PCR检测
(1)引物设计
田间取野罂粟叶片，用密封袋分装后立即放
在-80℃冰箱备用，用CTAB法提取植株基因组DNA。
用Oligo6.0设计引物，引物由北京奥科生物技术有限
责任公司合成。根据目的基因序列设计引物。引物序
列从（5至 3）, AFP Upper: 5-ATG GCT AAG TTT
GCT TCT ATC-3,碱基数 21，合成量（OD）4; AFP
Lower: 5-TTA ACA TGG GAA ATA GCA G-3，碱基数
19，合成量（OD）4。
(2)PCR扩增体系
Buffer 3.0 μL，引物 2.0 μL，dNTPs 1.5 μL，基因组
DNA 2.0 μL，Taq E 1.0 μL，ddH2O 20.5 μL，总计30.0 μL。
(3)PCR扩增的条件
94℃ 7 min，94℃ 45 s，54.5℃ 45 s，72℃ 50 s，从第
2步到第4步进行35个循环，72℃ 10 min，4℃保存。
1.2.5 试验设计 采用裂区设计，A因素蔗糖浓度为主
处理，共 7个水平（A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7分别代
表CK、8%、9%、10%、11%、12%、13%），B因素时间为
副处理，共 4个水平（B1、B2、B3、B4分别代表 5、10、
15、20 h），每处理重复3次。
2 试验结果
2.1 野罂粟萌发率的方差分析
对野罂粟的萌发情况通过方差分析（固定模式）从
表 1中可知，不同蔗糖浓度和萌发时间对野罂粟花粉
萌发有较大影响，差异性达到极显著水平，F值分别为
171.2737、70.031，P值 0.0001。不同蔗糖浓度和不同
花粉萌发时间之间存在交互作用，对野罂粟花粉发萌
有较大影响，差异性达到极显著水平（P值0.0001）。
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2.2 野罂粟萌发率多重比较
2.2.1 不同蔗糖浓度间多重比较(LSD法) 表2说明，蔗
糖浓度以 11%最佳，蔗糖浓度过高或过低均不利于野
罂粟的花粉萌发。
2.2.2 不同萌发时间的多重比较 从表 3可知，野罂粟
花粉萌发的时间以 15~20 h最佳，与萌发时间 5、10 h
之间存在显著差异，达到极显著水平。
2.2.3 交互作用间的多重比较
a主处理1中各个副处理比较
表4说明，在不加蔗糖的灭菌水中，以20 h的萌发
率最好，与其它时间之间存在显著差异，并达到极显著
水平，随着时间越长，野罂粟的萌发率越高。
b主处理2中各个副处理比较
表5说明，在蔗糖浓度8%的溶液中，以15~20 h的
萌发率最好，与其它时间之间存在显著差异，并达到极
显著水平。
c主处理3中各个副处理比较
表6说明，在蔗糖浓度9%的溶液中，以10~20 h的
萌发率最好，与5 h之间存在显著差异，并达到极显著
水平。
d主处理4中各个副处理比较
表 7说明，在蔗糖浓度 10%的溶液中，以 10~15 h
的萌发率最好，与5 h之间存在显著差异，并达到极显
著水平，但萌发时间20、15、10 h与5 h之间存在一定差
异，达到5%显著水平。
e主处理5中各个副处理比较
表 8说明，在蔗糖浓度 11%的溶液中，以 15~20 h
的萌发率最好，与 5~10 h之间存在显著差异，并达到
极显著水平,但萌发时间 20 h、15 Hp之间存在一定差
异，达到5%显著水平；10 h与5 h之间不存在差异性。
表1 方差分析表(固定模型)
变异来源
区组
因素A
误差
因素B
AxB
误差
总和
平方和
77.8637
11428.13
133.4491
2749.062
981.7821
549.5714
15919.86
自由度
2
6
12
3
18
42
83
均方
38.9318
1904.689
11.1208
916.354
54.5435
13.085
F值
171.273
70.031
4.168
p值
0.0001
0.0001
0.0001
处理
A5
A4
A7
A3
A6
A2
A1
均值
66.25
51.5
47.9917
47.4333
42.65
33.5583
27.4583
5%显著水平
a
b
c
c
d
e
f
1%极显著水平
A
B
B
B
C
D
E
表2 不同蔗糖浓度间多重比较(LSD法)
表3 不同萌发时间的多重比较(LSD法) 表4 a主处理1中萌发时间的多重比较(LSD法)
表5 b主处理2萌发时间的多重比较(LSD法)
处理
B4
B3
B2
B1
均值
51.181
49.4667
43.8762
36.5286
5%显著水平
a
a
b
c
1%极显著水平
A
A
B
C
B4
B3
B2
B1
均值
39.1333
30.9333
25.5667
14.2
5%显著水平
a
b
c
d
1%极显著水平
A
B
C
D
处理
B3
B4
B2
B1
均值
42.0333
41.3333
28.8
22.0667
5%显著水平
a
a
b
c
1%极显著水平
A
A
B
C
处理
B3
B4
B2
B1
均值
53.2
50.8
50.0333
35.7
5%显著水平
a
a
a
b
1%极显著水平
A
A
A
B
表6 c主处理3中萌发时间的多重比较(LSD法)
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魏玉杰等：花粉介导法将萝卜抗菌肽基因导入野罂粟的影响因素研究
f主处理6中各个副处理比较
表9说明，在蔗糖浓度12%的溶液中，各处理时间
之间的萌发率不存在差异性。
g主处理7中各个副处理比较
表10说明，在蔗糖浓度13%的溶液中，以15~20 h
的萌发率最好，与5 h之间存在显著差异，并达到极显
著水平，但萌发时间20 h与10 h之间存在一定差异，达
到5%显著水平；10 h与5 h、20 h与15 h之间不存在差
异性。
2.3 野罂粟结籽率的方差分析
在野罂粟上，采用花粉介导法转化外源基因后，用
不同的蔗糖浓度，在不同时间处理后的野罂粟的蒴果
的结籽情况通过方差分析（固定模式）从表11中可知，
不同蔗糖浓度对野罂粟花粉结籽有较大影响，差异性
达到极显著水平，F值分别为15.657，P值0.0001；不同
处理时间之间的差异不显著，P值0.0997>0.05；不同蔗
糖浓度和不同处理时间之间存在交互作用，对野罂粟
结籽率有较大影响，差异性达到极显著水平（F值为
处理
B2
B3
B4
B1
均值
55.4
53.9
51.9
44.8
5%显著水平
a
a
a
b
1%极显著水平
A
A
AB
B
处理
B4
B3
B2
B1
均值
77.3333
70.3333
60.4667
56.8667
5%显著水平
a
b
c
c
1%极显著水平
A
A
B
B
处理
B4
B3
B2
B1
均值
46.2
42.3667
41.1333
40.9
5%显著水平
a
a
a
a
1%极显著水平
A
A
A
A
处理
B3
B4
B2
B1
均值
53.5
51.5667
45.7333
41.1667
5%显著水平
a
ab
bc
c
1%极显著水平
A
A
AB
B
表7 d主处理4萌发时间的多重比较(LSD法) 表8 e主处理5萌发时间的多重比较(LSD法)
表9 f主处理6萌发时间的多重比较(LSD法) 表10 g主处理7萌发时间的多重比较(LSD法)
表11 方差分析表(固定模型)
变异来源
区组
因素A
误差
因素B
AxB
误差
总和
平方和
0.7264
66.191
8.4554
5.4159
74.2759
34.1309
189.1955
自由度
2
6
12
3
18
42
83
均方
0.3632
11.0318
0.7046
1.8053
4.1264
0.8126
F值
15.657
2.222
5.078
P值
0.0001
0.0997
0.0001
处理
A2
A4
A1
A5
A6
A7
A3
均值
3.5317
3.1175
3.0892
2.7617
2.25
1.925
0.6933
5%显著水平
a
ab
ab
bc
cd
d
e
1%极显著水平
A
AB
AB
ABC
BC
C
D
表12 不同蔗糖浓度间多重比较(LSD法) 5.078，P值为0.0001）。
2.4 野罂粟结籽率多重比较
2.4.1 蔗糖浓度间的效应(LSD法) 表 12说明，蔗糖浓
度以8%最佳，蔗糖浓度过高或过低均不利于野罂粟结
籽。
2.4.2 处理时间之间的效应 表13说明，用花粉介导法
转外源基因以对花粉处理后5 h效果最好，与20 h之间
存在差异性，但在1%上不显著。
2.4.3 蔗糖与时间的交互作用
a主处理1中各个副处理比较
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表 14说明，在不加蔗糖的灭菌水中，以 15 h的结
籽量最多，与5 h存在差异性，与10 h之间存在显著差
异，并达到极显著水平，15 h与20 h之间不存在差异显
著性。
b主处理2中各个副处理比较
表15说明，在蔗糖浓度8%的溶液中，以5~15 h的
结籽量较，以 5 h的结籽量最多，达到每蒴果 5.52 g,与
20 h存在显著差异，达到极显著水平。
c主处理3中各个副处理比较
表16说明，在蔗糖浓度9%的溶液中，以15 h的结
籽量最多，与5 h存在显著差异性。
d主处理4中各个副处理比较
表 17说明，各处理之间的差异不显著，表明在蔗
糖浓度 10%的溶液中加入野罂粟花粉，通过介导处理
后，其处理时间的长短不影响与结籽量。
e主处理5中各个副处理比较
表 18说明，各处理之间的差异不显著，表明在蔗
糖浓度 11%的溶液中加入野罂粟花粉，通过介导处理
后，其处理时间10 h野罂粟的结籽量最高平均达到每
果3.6533 g，与处理时间15 h之间存在明显差异。
f主处理6中各个副处理比较
表19说明，在蔗糖浓度12%的溶液中加入野罂粟
花粉，通过介导处理后，其处理时间5 h野罂粟的结籽
量最高平均达到每果 3.3333 g，与处理时间 15 h之间
存在明显差异，达到极显著水平。
g主处理7中各个副处理比较
表20说明，在蔗糖浓度13%的溶液中加入野罂粟
花粉，通过介导处理后，其处理时间之间野罂粟的结籽
量差异不显著。
从以上实验说明，组合A5B3或A5B4表现最佳，即
在野罂粟上，用花粉介导法转化萝卜抗菌肽基因时，以
蔗糖浓度11%，处理后10~15 h后的野罂粟花粉萌发最
处理
B1
B3
B2
B4
均值
2.8681
2.4643
2.4367
2.1557
5%显著水平
a
ab
ab
b
1%极显著水平
A
A
A
A
处理
B3
B4
B1
B2
均值
4.2067
3.2933
2.8433
2.0133
5%显著水平
a
ab
b
c
1%极显著水平
A
A
A
B
处理
B1
B3
B2
B4
均值
5.5167
4.42
4.06
0.13
5%显著水平
a
ab
b
c
1%极显著水平
A
A
A
B
处理
B3
B2
B4
B1
均值
1.35
0.6633
0.59
0.17
5%显著水平
a
ab
ab
b
1%极显著水平
A
A
A
A
表13 不同萌发时间多重比较(LSD法) 表14 a主处理1时间的多重比较(LSD法)
表16 c主处理3时间的多重比较(LSD法)表15 b主处理2时间的多重比较(LSD法)
处理
B1
B4
B3
B2
均值
3.6133
3.5433
3.0133
2.3
5%显著水平
a
a
a
a
1%极显著水平
A
A
A
A
处理
B2
B4
B1
B3
均值
3.6533
3.3333
2.7333
1.3267
5%显著水平
a
a
ab
b
1%极显著水平
A
A
AB
B
表17 d主处理4时间的多重比较(LSD法) 表18 e主处理5时间的多重比较(LSD法)
表19 f主处理6时间的多重比较(LSD法)
处理
B1
B2
B4
B3
均值
3.3333
2.2667
2.2667
1.1333
5%显著水平
a
ab
ab
b
1%极显著水平
A
AB
AB
B
处理
B2
B4
B1
B3
均值
2.1
1.9333
1.8667
1.8
5%显著水平
a
a
a
a
1%极显著水平
A
A
A
A
表20 g主处理7时间的多重比较(LSD法)
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魏玉杰等：花粉介导法将萝卜抗菌肽基因导入野罂粟的影响因素研究
好。但在田间处理过程中，以组合A2B1最佳，即在蔗
糖浓度8%的溶液中，处理野罂粟花粉5 h后，用花粉介
导法转化萝卜抗菌肽基因结籽量最多。
2.5 转基因野罂粟PCR检测电泳分析
对后代植株，用卡那霉素筛选，用经PCR检测鉴
定后，有4株表现有目的基因特异带（如图1）。
点样孔从左到右：1为marker，条带分别为 700 bp、600
bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp，因位置有限
只标注其中一部分；2为 pBIAFP质粒所做的阳性对
照；检测转基因材料共15个，另外一个阳性对照，两个
阴性对照。
3 讨论
利用花粉作为载体介导外源基因转化，避免了传
统的基因枪法和农杆菌转化所要求的组织培养技术，
转化方法简单、易操作，具有很强的实用性。在该方法
应用的过程中，蔗糖是很好的碳源和调节渗透压的物
质，但不同作物种类对蔗糖的浓度要求不同，观察花粉
萌发的时间也不相同，通过试验，11%的蔗糖浓度是花
粉介导法进行野罂粟基因转化的花粉萌发的理想介
质，以萌发时间10~15 h最佳，它不会对花粉的萌发能
力造成重大影响，同时花粉粒的破损率比较小。但在
田间进行转化时，8%的蔗糖浓度是花粉介导法在野罂
粟上进行萝卜抗菌肽基因转化的理想介质，同时以花
粉萌发5 h快速进行转化时，野罂粟的结实率最高，结
籽量最多。花粉萌发与田间结实率不一致的主要原因
是由于转化过程中的时间所致，花粉处理液滴注在野
罂粟柱头上时，花粉还存在一定的后续萌发时间，所以
以低蔗糖浓度和短时间快速处理效果最好。以萝卜抗
菌肽基因是一种广谱抗真菌基因，转化植株经田间涂
抹卡那霉素检测结果与 PCR检测结果是一致。该研
究为在野罂粟植物上探讨花粉介导法导入外源基因可
行提供一定依据，但有关后代遗传抗病、结实等情况需
要进一步研究。
参考文献
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图1 琼脂糖凝胶电泳检测
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