全 文 ：＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｉｙａｈｕｉ＠ｎｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
收稿日期：２０１４－０５－２４；修回日期：２０１４－１１－２８
基金项目：农业部“十二五”公益性行业（农业）重大科研专项“草
原主要毒草发生规律与防控技术研究”（２０１２０３０６２）；陕西省教育厅
重点实验室科研计划项目（１４ＪＳ０９９）
作者简介：周攀（１９９０－ ），男，陕西省榆林市人，在读硕士研究
生，从事毒害草生态研究，参与申请专利１项，Ｅ－ｍａｉｌ：７５８５８１５４＠
ｑｑ．ｃｏｍ．
文章编号：１６７３－５０２１（２０１５）０１－００３８－０７
人居和荒漠草原生态条件下小花棘豆叶片蛋白质表达谱分析
周　攀１，吴道长１，王德军２，李国中３，尉亚辉１，＊
（１．西北大学生命科学院西部资源与现代生物技术省部共建教育部重点实验室／陕西省生物技术重点实验室，
陕西　西安　７１００６９；２．内蒙古阿拉善左旗腾格里额里斯动物卫生监督站，内蒙古　７５０３１４；３．内蒙古阿拉善左旗
动物卫生监督所，内蒙古　７５０３００）
摘要：利用双向电泳技术，对比两种生境下（Ａ地为公园，Ｂ地为荒漠草原）小花棘豆的蛋白质差异表达谱，选取
其中的差异蛋白点进行 ＭＡＤＬＩ－ＴＯＦ－ＭＳ鉴定，获得的ＰＭＦ数据经 Ｍａｓｃｏｔ软件在ＮＣＢＩ　ＮＲ数据库上检索分析后
确认蛋白种类，结果表明：相对Ａ地，Ｂ地小花棘豆光合作用相关调控酶类表达下调，而光合作用结构蛋白如叶绿素
球蛋白表达上调；Ｂ地小花棘豆光合速率下降，可能是受光合调控酶表达下调的影响；Ｂ地 ＡＴＰ合成相关蛋白的表
达上调，说明在干旱、高盐、氮磷含量偏低的环境下生长可能需要消耗更多能量。另外，Ｂ地小花棘豆中发现一些与
胁迫相关蛋白出现上调或者特异性表达，这些蛋白的表达可能跟小花棘豆能够适应逆境有着密切的关系。
关键词：人居生态条件；荒漠生态条件；叶片；蛋白质；表达谱
中图分类号：Ｑ９４８．１１２　　　文献标识码：Ａ
　　小花棘豆［Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａ（Ｌａｍ．）ＤＣ．］是豆
科棘豆属的一种多年生草本植物，在我国内蒙古、陕
西、甘肃、青海、西藏等省区广泛分布［１］。它的主根
粗大，具有耐盐、耐寒、耐旱等特点，种子成熟后可随
动物粪便或者借助风力传播，在土壤中保存５年依
然可以萌发［２］。小花棘豆与内生菌共生能够产生毒
素苦马豆素，牲畜一旦误食轻则影响生长繁殖，重则
引起死亡，并且具有成瘾性［３］。其对马的毒性最强，
其次是山羊、绵羊，再次为牛［４］。有调查表明，草场
上小花棘豆覆盖率达１０％～７０％时放牧死亡率达
５％～５０％［５］，仅阿拉善左旗２００５年就有１７７８头
（只）牲畜因为吃了以小花棘豆为主的毒草中毒死
亡［６］。在发生严重区域小花棘豆常呈片状分布，使
当地草地植物多样性减少，植物群落抗逆性变差。
同时，由于小花棘豆重灾区无法放牧，加重了其他优
质草场的负担，形成恶性循环，加速了荒漠化［７］。
双向电泳技术作为蛋白质组学的核心技术之
一，在植物应答非生物胁迫的研究中已经有了广泛
的应用：Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ等［８］运用双向电泳技术研究了
干旱胁迫下西瓜蛋白质组的变化；Ａｇｈａｅｉ等［９］分析
了盐胁迫下大豆蛋白质表达谱；Ｊｅｌｏｕｌｉ等［１０］研究
了盐胁迫下葡萄叶片、茎和根部的蛋白质表达谱；
Ｊｏｒｇｅ等［１１］比较了干旱胁迫下圣栎幼苗蛋白质组的
差异。本研究利用双向电泳 （２－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＥ）技术，对比了生长在公园人居环
境和荒漠草原环境下小花棘豆叶片蛋白表达的差
异，通过质谱分析差异点，得到小花棘豆在多重逆境
胁迫下蛋白质表达的差异，以期为探寻小花棘豆在
逆境影响下的蛋白表达变化规律，研究小花棘豆的
抗逆机理及特异性抗逆蛋白表达奠定初步基础。
１　材料与方法
１．１　材料
供试材料是２０１３年７月生长在内蒙古阿拉善
左旗公园人居环境（Ａ地）和荒漠草原（Ｂ地）的小花
棘豆。采用背身抛石块的方式随机选取两地的小花
棘豆各５株，从这５株棘豆上随机采摘健康的叶片
各１０片放入干冰盒带回实验室，在－８０℃冰箱保
存。由于阿拉善左旗县城周围被荒漠草原包围，采
样地Ａ与Ｂ的距离大约５ｋｍ，所以两地的海拔、光
照、温度等环境因子差异不大，影响两地小花棘豆生
长的主要因素是水土环境的差异。
１．２　土壤指标测定
对Ａ地和Ｂ地小花棘豆生长土壤样本进行采
样，带回实验室分析其成分差异。在距离采样植
株主根１０ｃｍ处先铲出一个２０ｃｍ断面，再平行于
—８３—
第３７卷　第１期
Ｖｏｌ．３７　Ｎｏ．１
　　　　　　　　　
中　国　草　地　学　报
Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ
　　　　　　　　　
２０１５年１月
Ｊａｎ．２０１５
断面用不锈钢取土器采土。取土深度及取土量均
匀一致，上层与下层的土样比例相同，采集土壤混
匀装袋标记封存。对两地土壤分别进行土壤含水
量、土 壤 ｐＨ、可 溶 性 盐 含 量、溶 解 性 总 固 体
（ＴＤＳ）、土壤电导率（ＥＣ）、全氮、速效氮、速效钾、
速效磷等指标的测定，测定方法参考《土壤农化分
析手册》［１２］。
１．３　光响应曲线测定
分别对两地的５株小花棘豆进行光响应测量，仪
器是Ｌｉ－６４００便携式光合仪，用红蓝光源叶室进行。
叶室内部有效辐射（ＰＡＲ）在０～１８００μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ
间，梯度为０、２０、５０、１００、１５０、２００、４００、６００、８００、
１０００、１２００、１６００、１８００，参 比 室 的 ＣＯ２ 浓 度 为
５００μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ，按照规定程序测量净光合速率
（Ｐｎ）。
１．４　总蛋白的提取和定量
小花棘豆总蛋白提取采用三氯乙酸 （ＴＣＡ）／丙
酮沉淀法［１３］，蛋白质的定量采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法。
１．５　双向电泳
第一向等电聚焦采用１８ｃｍ的ｐＨ值为３～１０
的胶条，每次上样蛋白２００μｇ左右，加入３５０μｌ泡
涨液（２４ｇ尿素，１ｇ　ＣＨＡＰＳ，加入微量溴酚蓝后用
双蒸水溶解并定容到５０ｍｌ，分装成１ｍｌ小份备用，
每１ｍｌ使用前加入５ｍｇ　ＤＴＴ和５μｌ　ＩＰＧ　Ｂｕｆｆｅｒ，
－２０℃保存），均匀铺在等电聚焦槽底，放好胶条
然后在上面覆盖一层硅油，胶条槽按照标示的正
负极放在电极板上，按照操作手册设置电泳参数
进行第一向电泳。电泳结束取出胶条，清洗胶条
上的硅油，然后将胶条放入装有１０ｍｌ平衡液
［１．５ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．８）６．７ｍｌ、尿素７２．０７ｇ、
甘油（８７％ｖ／ｖ）６９ｍｌ、４ｇ　ＳＤＳ、微量溴酚蓝，用双
蒸水溶解并定容到２００ｍｌ，１０ｍｌ每份分装，－２０℃
保存］的塑料槽中，加入ＤＴＴ　１００ｍｇ，在摇床中摇
１５ｍｉｎ。取出胶条反复清洗，再放入装有１０ｍｌ平
衡液的塑料槽，加入４００ｍｇ碘乙酰胺，再在摇床中
摇１５ｍｉｎ。第二向电泳为ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，采用美
国 ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＳＥ６００Ｒｕｂｙ垂 直 系 统 进 行。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶液凝固后，将ＩＰＧ胶条转移至胶面
顶端，用少量的琼脂糖封顶液（０．５％琼脂糖，
０．００２％溴酚蓝，加ＳＤＳ电泳缓冲液）将ＩＰＧ胶条
封固。电泳开始采用恒定电流，初始电流设置为
２０ｍＡ，３０ｍｉｎ后待溴酚蓝指示完全进入下层胶体
将电流调至４０ｍＡ，直到溴酚蓝指示带跑至凝胶底
部结束，时间大概为５ｈ。等电泳结束后取下胶条，
转移至凝胶固定液（２５ｍｌ醋酸、１００ｍｌ甲醇、１２５ｍｌ
去离子水）中。蛋白质银染用南京凯基生物银染
试剂盒进行。
１．６　凝胶的图像采集与分析
用ＵＭＡＸ　ＰｏｗｅｒＬｏｏｋ　２１００ＸＬ扫描仪对银染
后的２Ｄ胶进行图像采集，在３００ＤＰＩ的分辨率下转
换为 ＴＩＦＦ格式的图像文件。利用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ
２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ５．０软件对图像文件进行分析，通过点
选工具选择 Ｍａｘ≥３．０的点（点为３倍差异点），得
到３倍差异点报告，按照图谱分析结果在超净台切
取差异蛋白凝胶块。
１．７　差异蛋白的质谱分析
对差异蛋白凝胶块要进行胰蛋白酶水解才能进
行质谱分析，参照 Ｋａｔａｙａｍａ等［１４］方法进行酶解。
质谱鉴定和数据库检索委托北京华大生物科技有限
公司进行。采用ＢＲＵＫＥＲ公司Ａｕｔｏｆｌｅｘ，ＭＡＬＤＩ－
ＴＯＦ／ＴＯＦ质谱仪，激光源波长为３３７ｎｍ，加速电压
为２５ｋｖ，采用正离子和自动获取数据的模式。肽质
量指纹图谱（ＰＭＦ）质量扫描范围为７００～４０００Ｄａ，
图谱用ＢＲＵＫＥＲ专用ｐｅｐｔｉｄｅ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｓｔａｎｄａｒｄ
ＩＩ进行外标校正。将得到的差异蛋白肽指纹图谱
数据 用 ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ　ＭＡＳＣＯＴ 数 据 库 Ｇｒｅｅｎ
Ｐｌａｎｔｓ　Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ　ｓｐ．进行检索，做同源分析，以
可信度Ｐ＜０．０５为结果可信。
２　结果与分析
２．１　两地的土壤条件
Ａ地跟Ｂ地的土壤ｐＨ 都是７．９左右，属于
碱性 土 壤。可 溶 性 盐 含 量、溶 解 性 总 固 体
（ＴＤＳ）、土壤电导率（ＥＣ）三个指标的主要影响因
素都是可溶性盐含量，Ｂ地的３个指标值接近 Ａ
地的２．５倍，说明Ｂ地土壤含盐量更大。Ａ地土
壤含水量是Ｂ地的２倍，说明Ｂ地比 Ａ地更干
旱。Ａ地的氮含量是Ｂ地的１．５倍，磷含量是Ｂ
地的３倍，钾含量Ｂ地是 Ａ地的１．５倍，但是两
地 Ｋ含量都较高，没有实质影响。根据《土壤农
化分析手册》中盐土分级指标判定Ｂ地属中度盐
化土壤，Ａ地未见盐化（盐分含量在２～４ｇ／ｋｇ的
土壤属中度盐化土，含量在１～２ｇ／ｋｇ属轻度盐
化土）。综上指标表明，Ｂ地比 Ａ地更干旱，盐分
含量更高，并且营养元素（主要指 Ｎ和Ｐ）更加匮
乏，所以生长在Ｂ地的小花棘豆与 Ａ地的相比处
—９３—
周　攀　吴道长　王德军等　　　　人居和荒漠草原生态条件下小花棘豆叶片蛋白质表达谱分析
于多重逆境下。
表１　土壤分析结果
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｏｉｌ
项目
Ｉｔｅｍｓ
Ａ组
Ｇｒｏｕｐ　Ａ
Ｂ组
Ｇｒｏｕｐ　Ｂ
酸碱度ｐＨ　 ７．９２　 ７．９
总盐浓度（×１０－６） １２４　 ３１１
电导率（ｕｓ） ２５４　 ６２１
可溶性盐含量（ｇ／ｋｇ） ０．８５　 ２．１６
含水量（％） １３．９４　 ６．５６
全氮（％） ０．０５９５　 ０．０３３１
碱解氮（ｍｇ／ｋｇ） ４４．２１　 １２．９６
速效钾（ｍｇ／ｋｇ） １５２．３１　 ２３２．９３
速效磷（ｍｇ／ｋｇ） １．２５　 ０．４０
２．２　两地小花棘豆生长光响应曲线
根据所测得的小花棘豆净光合速率（Ｐｎ）和光
合有效辐射（ＰＡＲ）数据，以ＰＡＲ为横坐标，Ｐｎ为
纵坐标，利用Ｅｘｃｅｌ作图得到两地小花棘豆的光响
应曲线（图１）。通过Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ　６．０软件计算得到Ａ地
的最大净光合速率为８．７６μｍｏｌＣＯ２／ｍ
２·ｓ，Ｂ地为
５．８６μｍｏｌＣＯ２／ｍ
２·ｓ；光补偿点Ａ地为２３．７μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ，
Ｂ地为４４．７μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ。
图１　小花棘豆叶片光响应曲线
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｐｈｏｔｏｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａｌｅａｖｅｓ
２．３　两地小花棘豆叶片蛋白２－ＤＥ图谱分析
对两种环境下小花棘豆蛋白应用双向电泳技术
进行分离后染色，３次生物学重复后能够得到完好
清晰的双向电泳图谱（图２）。用ＰＤ　Ｑｕｅｓｔ　８．０软
件对图谱进行分析比对，以表达量增加或者降低３．０
倍以上，并且通过单因素方差分析（Ｐ＜０．０５）的蛋
白点作为差异表达蛋白。发现在图 Ａ中有９个蛋
白点相对Ｂ图上调或特异性表达，Ｂ图中有１１个蛋
白点相对Ａ图上调或特异性表达。
图２　两地小花棘豆群体叶片蛋白双向电泳图谱
Ｆｉｇ．２　Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａｌｅａｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ
２．４　两地小花棘豆叶片差异蛋白的质谱鉴定
选取图谱中的２０个差异蛋白点（图２）进行
ＭＡＤＬＩ－ＴＯＦ－ＭＳ鉴定，将获得的 ＰＭＦ 数据经
Ｍａｓｃｏｔ软件在ＮＣＢＩ　ＮＲ数据库上检索分析，并结
合双向电泳图谱中表现的分子质量、大概的等电点
等信息确定蛋白的具体种类，鉴定结果见表２。在
Ａ地蛋白表达谱中质谱检测了９个相对Ｂ地蛋白
表达谱上调３倍或特异表达蛋白点，主要可分为三
大类：（１）光合作用相关蛋白：核酮糖－１，５－二磷酸羧
化酶／加氧酶大亚基（１号蛋白和８号蛋白为此酶的
—０４—
中国草地学报　２０１５年　第３７卷　第１期
两个不同修饰形式）、丙糖磷酸异构酶、果糖１，６二
磷酸醛缩酶、铁氧还蛋白－ＮＡＤＰ还原酶、细胞色素
Ｂ６－ｆ复合铁硫亚基；（２）代谢相关蛋白：尿苷转移
酶；（３）抗酶解蛋白、蛋白酶抑制物２０。在Ｂ地蛋白
表达谱中质谱检测了１１个相对Ａ组上调３倍以上
或特异表达的蛋白点，主要为四大类：（１）抗胁迫相
关蛋白：过氧化物酶体（Ｓ）２羟基酸氧化酶、蛋白激
酶家族蛋白、抗坏血酸过氧化物酶；（２）能量代谢相
关蛋白：ＡＴＰ合酶β亚基、ＡＴＰ合酶 ＣＦ１α亚基、
ＮＡＤＨ 脱氢酶Ｆ亚基；（３）光合作用相关蛋白：叶绿
体球蛋白、ＰＳⅠ反应中心Ⅱ亚基２０ＫＤａ、蓝光受体
蛋白；（４）功能不确定蛋白：低分子量麦谷蛋白、ＯＳ－
ＪＮＢｂ０００３Ｂ０１．１３。
表２　两地小花棘豆叶片差异表达蛋白鉴定
Ｔａｂｌｅ　２　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａ
编号
Ｎｏ．
登录号
Ａｃｃｅｓｉｏｎ　Ｎｏ．
分数
Ｓｃｏｒｅ
质量
Ｍａｓｓ
蛋白名称
Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ
差异类别
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ
物种
Ｏｒｇａｎｉｓｍ
１ ｇｉ｜７２４０２９７　 ４８７　 ５２２７０
Ｒｉｂｕｌｏｓｅ－１，５－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ
核酮糖－１，５－二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基
Ａ组３× 刺枝树科
２ ｇｉ｜３９１３００８　 １００６　 ３８５９９ Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｌｄｏｌａｓｅ果糖二磷酸醛缩酶 Ａ组３× 大豆
３ ｇｉ｜７３９２０６５３　 ４３６　 ４４４８１ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ抗酶解蛋白 Ａ组ｃｈｙ 大豆
４ ｇｉ｜１８３９４４１４　 １６５　 ３１４４６ Ｕｒｉｄｙｌｙ　ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ尿苷转移酶 Ａ组３× 拟南芥
５ ｇｉ｜１１９９０５　 ９３７　 ４０４５４ Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ－ＮＡＤＰ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ铁氧还蛋白－ＮＡＤＰ还原酶 Ａ组３× 大豆
６ ｇｉ｜２２００１３４９　 １６２　 ２３７３９ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　２０蛋白酶抑制物２０ Ａ组ｃｈｙ 蒺藜苜蓿
７ ｇｉ｜１３６７０７　 ５９７　 ２４６８３
Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ６－ｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｒｏｎ－ｓｕｌｆｕｒ　ｓｕｂｕｎｉｔ细胞色素Ｂ６－
ｆ复合铁硫亚基（叶绿体）
Ａ组３× 大豆
８ ｇｉ｜１６９５６３　 １０５　 ５３３７１ Ｒｉｂｕｌｏｓｅｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ核酮糖二磷酸羧化酶 Ａ组３× 马铃薯
９ ｇｉ｜１５２２６４７９　 ３０７　 ３３５５３ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ／ｔｒｉｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ丙糖磷酸异构酶 Ａ组３× 拟南芥
１０ ｇｉ｜６２９００６２８　 ６４０　 ３８３７９ Ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－１，ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ叶绿体球蛋白 Ｂ组３× 大豆
１１ ｇｉ｜９１２１４１４８　 １３９２　 ５５７７６ ＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ＣＦ１ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ＡＴＰ合酶ＣＦ１α亚基 Ｂ组３× 大豆
１２ ｇｉ｜５８５３１９８０　 ４７　 １Ｅ＋０５ ＯＳＪＮＢｂ０００３Ｂ０１．１３ Ｂ组３× 未知
１３ ｇｉ｜７４３１４２８　 ６９６　 ４０３４５
（Ｓ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－ａｃｉｄ　ｏｘｉｄａｓｅ过氧化物酶体（Ｓ）２羟基酸氧
化酶
Ｂ组ｃｈｙ 大豆
１４ ｇｉ｜３３４１４０５０　 ３５０　 ３５８８１ Ｃｌａｓｓ　Ｉｂ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ低分子量麦谷蛋白 Ｂ组ｃｈｙ 山羊豆
１５ ｇｉ｜７７０８３１５　 １１３　 ５３３７９ ＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｂｅｔａ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ＡＴＰ合酶β亚基 Ｂ组３× 大豆
１６ ｇｉ｜１３３６０８２　 ３４６　 ２７１８０ Ａｓｃｏｒｂａｔｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　２抗坏血酸过氧化物酶２ Ｂ组ｃｈｙ 大豆
１７ ｇｉ｜１３１１６７　 １０８　 ２２４６７
ＰｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍⅠ２０ｋＤａ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ＰＳ Ⅰ 反应 中 心 Ⅱ 亚 基
２０ＫＤａ
Ｂ组３× 大豆
１８ ｇｉ｜１５２４０２８０　 ２１　 ９５０８５ Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ蛋白激酶家族蛋白 Ｂ组ｃｈｙ 拟南芥
１９ ｇｉ｜２０７９７０９２　 ３４　 ８１９４２ Ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｂｌｕｅ　ｌｉｇｈｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ蓝光受体蛋白 Ｂ组３× 绿藻
２０ ｇｉ｜３９５９８８５０　 ３０　 ５０４５５ ＮＡＤＨ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｆ　ＮＡＤＨ脱氢酶Ｆ亚基 Ｂ组３× 拟南芥
　　注：ｃｈｙ表示在该组别中对应蛋白是特异性表达，另一组中未发现此蛋白；３×表示在该组别中对应蛋白表达量是另一组的３倍以上。
Ｎｏｔｅ：ｃｈｙ　ｍｅａｎｓ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｇｒｏｕｐ；３×ｍｅａｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｑｕａｎｔｉｔｙ
ｉｓ　ｔｈｒｅｅ　ｔｉｍｅｓ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｇｒｏｕｐ．
３　讨论
在逆境下植物生长会受到内外多种因素综合调
控，相对于顺境下生长会出现不同的生理生化变化，
而这些变化会体现在蛋白表达谱的变化中。本文研
究了Ａ地和Ｂ地两种生境下小花棘豆的蛋白，Ａ地
是人居公园环境，Ｂ地是荒漠草原，且两地相距很
近，海拔、温度、光照等环境因子基本相同，影响它们
生长的主要制约因素是土壤。通过土壤指标分析可
以确认Ｂ地相对Ａ地处于一种干旱、高盐和氮磷缺
乏的状态，所以将 Ａ地小花棘豆视为对照组，Ｂ地
作为多重胁迫影响组。
３．１　Ａ地相对Ｂ地上调或特异表达蛋白功能分析
Ａ地生长的小花棘豆相对Ｂ地共９个蛋白上
调或特异性表达，其中６个与植物的光合作用有密
切的关系，１个与代谢相关，另外２个功能不明确。
３．１．１　光合相关蛋白
核酮糖－１，５－二磷酸羧化酶（Ｒｕｂｉｓｃｏ）主要位于
叶绿素基质中，作为关键酶参与光合作用过程中
ＣＯ２ 的固定和参与植物光呼吸代谢途径［１５］，酶的主
要活性位点在大亚基。Ｋｏｍａｔｓｕ 等［１６］已经发现
Ｒｕｂｉｓｃｏ大、小亚基在干旱胁迫下会出现下调现象，
本研究中Ｂ地相对Ａ地更加干旱，而Ａ地小花棘豆
Ｒｕｂｉｓｃｏ表达量是Ｂ地的３倍，这与Ｋｏｍａｔｓｕ等［１６］
—１４—
周　攀　吴道长　王德军等　　　　人居和荒漠草原生态条件下小花棘豆叶片蛋白质表达谱分析
的研究相吻合。
铁氧还蛋白－ＮＡＤＰ还原酶主要作用是与铁氧
还蛋白一起作为氧化还原中心，将 ＮＡＤＰ＋还原为
ＮＡＤＰＨ，为光合反应提供还原力。陶配林［１７］研究
发现，在低磷、铁条件下玉米叶片的铁氧还蛋白－
ＮＡＤＰ还原酶表达下调，影响光合作用还原力的正
常供应，降低光合速率。本研究中，Ａ地土壤磷元素
含量正常，Ｂ地处于一种低磷胁迫，而铁氧还蛋白－
ＮＡＤＰ还原酶在Ａ地较Ｂ地更多表达，验证了低Ｐ
胁迫影响铁氧还蛋白－ＮＡＤＰ还原酶的表达。
丙糖磷酸异构酶与果糖１，６二磷酸醛缩酶都是
光合作用卡尔文循环的重要酶，在核酮糖二磷酸再
生阶段，磷酸二羟丙酮在丙糖磷酸异构酶的催化下
转化为３－磷酸甘油醛，之后在果糖１，６二磷酸醛缩
酶催化下转化为果糖１，６二磷酸。细胞色素Ｂ６－ｆ
复合铁硫亚基是细胞色素ｂ６－ｆ复合体的重要组成
部分，主要功能是参与了光系统Ⅰ和Ⅱ之间的电子
传递。这三个蛋白都在Ａ地小花棘豆中３倍表达，
说明小花棘豆为了适应不同环境可能会通过调控光
合作用关键酶的表达来影响光合速率变化。
通过光合仪测量表明，Ａ地小花棘豆的最大净
光合速率为８．７６μｍｏｌＣＯ２／ｍ
２·ｓ，远大于Ｂ地；光
补偿点 Ａ地为２３．７μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ，远小于Ｂ地。光
补偿点更低说明 Ａ地小花棘豆能够更好地利用光
能合成有机物。这与研究发现 Ａ地光合调控蛋白
表达上调相符，进一步验证了小花棘豆为了适应环
境，通过调控光合作用关键酶的表达影响其光合速
率的变化。
３．１．２　代谢相关蛋白
尿苷酸转移酶的表达也发生上调，它的主要作
用是催化尿苷酸转移至寡核苷酸或多核苷酸３′－ＯＨ
上，在Ｕ６ｓｎＲＮＡ的３′端形成长度不一的尿苷酸残
基片段，但它在 Ａ 地表达量高的影响因素还不清
楚。
３．１．３　功能未知蛋白
另外还有两个特异表达的蛋白：抗酶解蛋白和
蛋白酶抑制物２０，这两个蛋白在小花棘豆中的作用
需要进一步的研究。
３．２　Ｂ地相对Ａ地上调或和特异性表达蛋白功能
分析
Ｂ地相对 Ａ地上调和特异性表达的蛋白主要
分为四大类：（１）抗逆性相关蛋白；（２）能量代谢相关
蛋白；（３）光合相关蛋白；（４）功能未知蛋白。
３．２．１　抗逆性相关蛋白
蛋白激酶家族普遍存在于真核生物，是催化蛋
白质磷酸化的酶，它能把 ＡＴＰ上的γ－磷酸转移到
蛋白质分子的氨基酸残基上，在植物体内主要参与
胁迫应答过程，对不同胁迫其应答机理也不同。在
拟南芥中研究蛋白激酶家族基因发现，大部分蛋白
激酶家族基因都能被高盐、干旱、紫外等胁迫因子激
活，从而介导蛋白磷酸化，提高植物应对胁迫能
力［１８］。它在Ｂ地小花棘豆中３倍表达，可能是小花
棘豆在多重逆境胁迫下，通过上调蛋白激酶家族的
表达，激活体内应对胁迫的磷酸化反应，从而更好地
适应逆境。
过氧化物酶体（Ｓ）２羟基酸氧化酶能够催化乙
醇酸生成乙醛酸，可能还可以氧化乙醛酸成为草酸。
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ［１９］在研究甜菜等植物时发现，羟基酸氧
化酶能氧化乙醛酸生成草酸；王炜军等［２０］研究菜心
叶片发现，羟基酸氧化酶不仅能氧化乙醇酸为乙醛
酸，还能氧化乙醛酸为草酸，是一个双功能酶；而草
酸及其代谢现在被认为和耐低磷胁迫的生理现象相
关［２１］。Ｂ地小花棘豆处于低磷胁迫下，其羟基酸氧
化酶的特异性表达说明它可能跟低磷胁迫有密切关
系。
抗坏血酸过氧化物酶是一种末端氧化酶，能够
清除植物体内的活性氧分子（过氧化氢、羟基、超氧
阴离子等），保护植物免受氧化性损伤［２２］。Ｂ组蛋
白中发现抗坏血酸过氧化物酶相对 Ａ组特异性表
达，这可能与Ｂ组小花棘豆在逆境胁迫下产生的活
性氧分子清除有关。
３．２．２　能量代谢相关蛋白
ＡＴＰ合酶β亚基、ＡＴＰ合酶 ＣＦ１α亚基都是
ＡＴＰ合酶的组成部分，Ｂ组相对Ａ组上调表达这两
蛋白，说明在逆境胁迫下小花棘豆需要消耗更多的
ＡＴＰ去维持生命活动。ＮＡＤＨ 脱氢酶Ｆ亚基是
ＮＡＤＨ脱氢酶的重要组成部分，ＮＡＤＨ 脱氢酶是
线粒体氧化磷酸化的关键酶，它也与 ＡＴＰ的合成
紧密相关。这进一步验证了在逆境下，小花棘豆可
能需要合成更多的ＡＴＰ。
３．２．３　光合相关蛋白
叶绿体球蛋白是叶绿体的重要组成蛋白，ＰＳⅠ
反应中心Ⅱ亚基２０ＫＤａ光合反应中心是ＰＳⅠ的组
成亚基，蓝光受体蛋白是光的受体蛋白，３个蛋白是
光合作用过程的重要结构蛋白。虽然根据光合指
标，Ａ地小花棘豆光合效率高于Ｂ地，但是光合结
—２４—
中国草地学报　２０１５年　第３７卷　第１期
构蛋白的表达却是Ｂ地更高。这可能是小花棘豆
的一种生存竞争策略，虽然在逆境下调控酶的表达
偏低，影响了光合效率，但通过增加叶绿素球蛋白等
光合结构蛋白，增加光合反应的场所来弥补效率上
的不足。
３．２．４　功能未明确蛋白
低分子量麦谷蛋白、ＯＳＪＮＢｂ０００３Ｂ０１．１３的功
能现在并不明确，还需要进一步的研究。
４　结论
４．１　小花棘豆在逆境下生长，光合作用相关酶的表
达受到了明显的影响，这直接表现在影响了它的净
光合速率。但是，光合结构蛋白如叶绿体球蛋白的
表达反而会增加，这可能是小花棘豆应对胁迫的一
种适应机制。
４．２　在逆境下，小花棘豆体内ＡＴＰ合成相关酶表
达量增加，说明适应逆境可能会需要更多的能量。
４．３　小花棘豆能够在逆境下较好生长可能与其体
内一些抗胁迫蛋白［抗坏血酸过氧化物酶、过氧化物
酶体（Ｓ）２羟基酸氧化酶、蛋白激酶家族蛋白］的表
达有关，然而逆境下小花棘豆生长具体受到某种胁
迫与相关功能蛋白表达的确切关系仍没有明确，还
需要在分子生物学水平上进行更进一步的研究。
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（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｃｈｉｎａ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｓｈａａｎｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｘｉ’ａｎ７１００６９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｅｌｉｓｉ　Ｔｅｎｇｒｉ　Ａｌｘａ　Ｌｅｆｔ　Ｌｅａｇｕｅ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｂａｙａｎｈｏｔｅ
７５０３１４，Ｃｈｉｎａ；３．Ａｌｘａ　Ｌｅｆｔ　Ｌｅａｇｕｅ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ，Ｂａｙａｎｈｏｔｅ　７５０３００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｗｏ　ｈａｂｉｔａｔｓ　ｏｆ　Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａ，ｐａｒｋ（ｐｌａｃｅ　Ａ）ａｎｄ　ｄｅｓｅｒｔ　ｓｔｅｐｐｅ（ｐｌａｃｅ　Ｂ），ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔ－
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ｓａｍｐｌｅ　ｉｎ　ｐｌａｃｅ　Ａ．Ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ　ａｎｄ　ｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｗｅｒｅ　ｕｐ－
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ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐｌａｃｅ　Ｂ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｉｎ　ｄｒｏｕｇｈｔ，ｈｉｇｈ　ｓａｌｉｎｉｔｙ，ｌｏｗ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ａｎｄ
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ｔｈａｔ　ｓｏｍｅ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｃｅ　Ｂ　ｗｅｒｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ
ｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｍａｙ　ｅｎａｂｌｅ　Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａｔｏ　ｌｉｖｅ　ｉｎ　ａｄｖｅｒｓｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌｉｖｉｎｇ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Ｄｅｓｅｒｔ　ｇｒａｓｓｌａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Ｌｅａｖｅｓ；Ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ
—４４—
中国草地学报　２０１５年　第３７卷　第１期