全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１３（１０）：１００～１０２
第一作者简介：尹智慧（１９８７－），女，硕士，研究方向为植物基因工
程。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｙ＿ｗｈｌｙ＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ．
责任作者：郭长虹（１９６８－），女，博士，教授，现主要从事植物基因工
程等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｋａｋｕ２００８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ．
基金项目：黑龙江省杰出青年基金资助项目（ＪＣ２０１１０９）；黑龙江
省创新团队科研资助项目（２０１０ＴＤ１０）；哈尔滨师范大学创新团队
资助项目（ＫＪＴＤ２０１１０２）。
收稿日期：２０１３－０２－１０
大岩桐叶片再生体系的建立及卡那霉素敏感性研究
尹 智 慧，宋 丽 莉，司 　 亮，于 典 司，郭 长 虹
（哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院，黑龙江省分子细胞遗传与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨１５００２５）
　　摘　要：以大岩桐（Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ　Ｂｅｎｔｈ．）幼嫩叶片为外植体，研究了不同激素组合对大
岩桐叶片再生体系的影响及抗生素卡那霉素的敏感浓度。结果表明：不同激素组合对不定芽的
诱导效果差异显著，叶片不定芽的诱导和增殖的最佳培养基均为ＭＳ＋１．０ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ
ＮＡＡ，生根适宜培养基１／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ，大岩桐叶片对卡那霉素的敏感浓度为２００ｍｇ／Ｌ。
关键词：大岩桐；组织培养；卡那霉素
中图分类号：Ｓ　６８２．２＋９　文献标识码：Ａ　 文章编号：１００１－０００９（２０１３）１０－０１００－０３
　　大岩桐（Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ　Ｂｅｎｔｈ．）属苦苣苔科苦苣
苔属多年生草本植物，又名落雪泥，原产于巴西。叶对
生，全株密披绒毛，花冠钟形，花大艳美，常作为观赏花
卉广泛种植［１］。大岩桐自花不育，种子繁殖成本高，且
易造成品种退化，采用常规的块茎分割、枝插和叶插等
常规方法繁殖系数低，耗时长，因此研究大岩桐的组织
培养技术具有较高的实用价值［２］。近年来，转基因技术
在花卉植物中得到了广泛的应用，利用分子手段创造出
具有附加价值的新品种花卉已经成为近年来的研究
热点。
现采用不同的激素组合对大岩桐的再生体系进行
研究，同时对大岩桐叶片进行了卡那霉素敏感性进行筛
选，以期为后续遗传转化研究奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试大岩桐材料购自哈尔滨花卉市场。
１．２　试验方法
１．２．１　无菌材料的制备　种植在营养土中大岩桐，长至
４～６片叶时，取其幼嫩叶片，用流水冲洗３０ｍｉｎ，７５％酒
精浸泡３０～６０ｓ，用无菌蒸馏水冲洗１次，再用０．１％升
汞浸泡８ｍｉｎ，然后用无菌蒸馏水冲洗５～６次。用无菌
滤纸吸干后将叶片切成１ｃｍ×１ｃｍ的小块，近轴面朝下
接种于诱导培养基上。置于温度为（２４±２）℃，光照强度
为１　５００ｌｘ，光照时间为１６ｈ／ｄ的环境中培养。
１．２．２　不同激素组合对大岩桐不定芽的诱导　大岩桐
不定芽诱导培养基以ＭＳ为基本培养基（含蔗糖３０ｇ／Ｌ、
琼脂８ｇ／Ｌ、ｐＨ为５．８），采用浓度为０、０．５、１．０、１．５、
２．０ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ和浓度为０、０．１、０．３、０．５ｍｇ／Ｌ的
ＮＡＡ进行不同组合设计，每个处理接种３０个外植体，重
复３次。定期观察外植体的形态变化，４０ｄ后统计形成
不定芽的外植体数和诱导率。
１．２．３　不同激素组合对大岩桐不定芽增殖率的影响　
取大岩桐不定芽，切成１ｃｍ×１ｃｍ的小块，置于添加
６－ＢＡ（浓度为０、１．０、２．０ｍｇ／Ｌ）和ＮＡＡ（浓度为０、０．１、
０．５ｍｇ／Ｌ）不同组合的增殖培养基中，４０ｄ后对不定芽
的增殖系数进行统计。
１．２．４　不同浓度的ＮＡＡ对大岩桐组培苗生根的影响
　分别以１／２ＭＳ和ＭＳ为基本培养基，在培养基中分别
添加０．１、０．２、０．５ｍｇ／Ｌ的ＮＡＡ，选取高４～５ｃｍ的大
岩桐组培苗从其基部切下接种于生根培养基中，定期观
察生根情况，３０ｄ后统计生根数。
１．２．５　卡那霉素敏感试验　取大岩桐无菌苗的叶片，切
成１ｃｍ×１ｃｍ小块，背面朝上放入添加不同浓度的卡那
霉素（０、５０、１００、１５０、２００、３００ｍｇ／Ｌ）诱导培养基上进行
培养，定期观察。
２　结果与分析
２．１　不同激素组合对大岩桐叶片不定芽诱导的影响
由图１可知，接种于诱导培养基中的大岩桐叶片，
４ｄ左右叶片开始卷曲，８ｄ左右叶片的边缘开始膨大，
１７ｄ左右叶缘由深绿色变为浅黄色（图１ｂ），２５ｄ左右可
见浅绿色的幼芽形成（图１ｃ）。４０ｄ后对不同激素组合培
养基中的诱导情况进行调查，结果显示，在只添加６－ＢＡ
或ＮＡＡ的诱导培养基中，外植体也可以形成不定芽，且
００１
北方园艺２０１３（１０）：１００～１０２ ·生物技术·
诱导率随着６－ＢＡ和ＮＡＡ的浓度升高而升高，但最高诱
导率也仅为３３．３３％和２１．１１％，诱导效果不佳；在ＭＳ＋
１．０ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ培养基中诱导不定芽
的效果最佳，诱导率较高，可达９８．８９％（表１）。通过
ＳＰＳＳ软件分析，结果显示不同浓度激素组合对大岩桐
叶片不定芽诱导差异显著Ｐ＝０．０７２（＞０．０５）。因此确
定大岩桐叶片诱导的适宜培养基为 ＭＳ＋１．０ｍｇ／Ｌ
６－ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ。
表１　　不同激素组合对叶片诱导的影响
　　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｌｅａｖｅｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
６－ＢＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
ＮＡＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
接种数
／个
形成不定芽的
外植体数／个
诱导率
／％
差异显
著分析
０．５　 ０　 ３０　 ２．００　 ６．６７ ｇ
１．０　 ０　 ３０　 ３．００　 １０．００ ｇ
１．５　 ０　 ３０　 ６．００　 ２０．００ ｆ
２．０　 ０　 ３０　 １０．００　 ３３．３３ ｅ
０　 ０．１　 ３０　 １．００　 ３．３３ ｇ
０．５　 ０．１　 ３０　 １６．０　 ５３．３３ ｄ
１．０　 ０．１　 ３０　 ２９．６７　 ９８．８９ ａ
１．５　 ０．１　 ３０　 １６．００　 ５３．３３ ｄ
２．０　 ０．１　 ３０　 ２６．００　 ８６．６７ ｂ
０　 ０．３　 ３０　 １．３３　 ４．４４ ｇ
０．５　 ０．３　 ３０　 ５．６７　 １８．８９ ｆ
１．０　 ０．３　 ３０　 １１．３３　 ３７．７８ ｅ
１．５　 ０．３　 ３０　 ２１．６７　 ７１．１１ ｃ
２．０　 ０．３　 ３０　 ２８．６７　 ９５．５６ ａ
０　 ０．５　 ３０　 ６．３３　 ２１．１１ ｆ
０．５　 ０．５　 ３０　 ９．６７　 ３２．２２ ｅ
１．０　 ０．５　 ３０　 １４．００　 ４６．６７ ｄ
１．５　 ０．５　 ３０　 ２３．００　 ７６．６７ ｃ
２．０　 ０．５　 ３０　 ２８．００　 ９３．３３ ａｂ
图１　大岩桐组织培养
注：ａ：叶片边缘开始膨大；ｂ：叶缘由深绿色变为浅黄色；ｃ：诱导
产生不定芽；ｄ：组培苗。
Ｆｉｇ．１　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ　Ｂｅｎｔｈ．
２．２　不同激素配比对不定芽增殖率的影响
将不定芽接入到增殖培养基中４０ｄ后，对大岩桐不
定芽的增殖情况进行调查。结果显示，在只添加６－ＢＡ
的培养基中，不定芽的增殖速度较慢，增殖系数为３．４；
在只添加ＮＡＡ的培养基中，不定芽的增殖系数仅为
１．２；２种激素的组合的培养基中，诱导率提高，在 ＭＳ＋
１．０ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ培养基中大岩桐不定
芽的增殖速率最快，增殖系数达到４．６（表２）。通过
ＳＰＳＳ软件分析，结果显示，不同浓度激素组合对大岩桐
叶片增殖具有显著性差异Ｐ＝０．６３２（＞０．０５）。由此结
果可以看出，６－ＢＡ和ＮＡＡ对大岩桐丛生芽的增殖均起
到一定的作用，适当的配比可达到最佳结果。所以，根
据试验结果确定 ＭＳ＋１．０ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ
培养基为大岩桐不定芽的增殖培养基。
表２　不同激素配比对不定芽增殖率的影响
　　Ｔａｂｌｅ　２　　　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｏｎ
　　　　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
６－ＢＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
ＮＡＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
接种数
／个
增殖数
／个
增殖系数
差异显
著分析
０　 ０．５　 ３０　 ３６　 １．２ ｅ
１．０　 ０．０　 ３０　 １０２　 ３．４ ｄ
１．０　 ０．１　 ３０　 １３８　 ４．６ ａ
１．０　 ０．５　 ３０　 １１１　 ３．７ ｃ
２．０　 ０．１　 ３０　 １０２　 ３．４ ｄ
２．０　 ０．５　 ３０　 １２３　 ４．１ ｂ
２．３　ＮＡＡ对大岩桐生根的影响
由生根试验可以看出，不定芽的生根系数随着
ＮＡＡ浓度的升高而增大，在 ＭＳ和１／２ＭＳ培养基中，
平均生根系数差异不是很大，但在添加了０．５ｍｇ／Ｌ
ＮＡＡ的１／２ＭＳ培养基中，平均生根系数可达到３．４２，
对试验数据进行差异显著性分析，差异显著Ｐ＝０．１５３
（＞０．０５）。而且，在试验过程中发现，与 ＭＳ培养基相
比，１／２ＭＳ培养基生根较快，一般５～７ｄ即有萌动，且新
根比较粗壮。所以大岩桐无菌苗的适宜生根培养基为
１／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ。
表３ ＮＡＡ对大岩桐生根的影响
　　Ｔａｂｌｅ　３　　　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ＮＡＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｏｆ
　　　　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ　Ｂｅｎｔｈ．
基本培
养基
ＮＡＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
总接种数
／株
生根数
／株
平均生根
系数
差异显
著分析
１／２ＭＳ　 ０．１　 １２　 １４　 １．１６ ｄ
１／２ＭＳ　 ０．２　 １２　 １９　 １．５８ ｂ
１／２ＭＳ　 ０．５　 １２　 ４１　 ３．４２ ａ
ＭＳ　 ０．１　 １２　 １５　 １．２５ ｃｄ
ＭＳ　 ０．２　 １２　 １８　 １．５０ ｂｃ
ＭＳ　 ０．５　 １２　 ２０　 １．６７ ｂ
２．４　大岩桐叶片对卡那霉素敏感浓度的确定
对大岩桐叶片卡那霉素敏感浓度进行筛选，由图２
可知，Ｋｍ浓度小于２００ｍｇ／Ｌ时，对于诱导大岩桐叶片
再生不定芽没有太大影响。但是Ｋｍ浓度达到２００ｍｇ／Ｌ
后，虽然不影响大岩桐叶片的存活，但是影响再生芽的
生长。Ｋｍ浓度大于２００ｍｇ／Ｌ，对大岩桐的叶片的致死
１０１
·生物技术· 北方园艺２０１３（１０）：１００～１０２
率为１００％。最终确定大岩桐叶片对卡那敏感浓度为
２００ｍｇ／Ｌ。
图２　大岩桐叶片对卡那霉素敏感浓度筛选
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ
ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ　Ｂｅｎｔｈ．
３　讨论与结论
该试验结果表明，叶片诱导和不定芽增殖培养基均
为ＭＳ＋１．０ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ，最适生根培
养基１／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ。在叶片诱导阶段，６－ＢＡ
的含量在一定范围内增加，诱导生成的不定芽增多，含
量超过一定范围后，叶片只卷曲膨大形成不分化的愈伤
组织；ＮＡＡ的含量在一定范围内越多，生成的不定芽越
粗壮，超过一定范围会抑制芽的生长，导致只诱导生成
不定根。唐伟斌等［４］报道该培养基激素比有利于不定
芽的诱导。在生根阶段，ＮＡＡ含量越低幼苗生成的根
越细弱，且根少；ＮＡＡ含量过高会导致幼苗只长根，不
长叶，不利于大岩桐的植物组织培养。１／２ＭＳ比 ＭＳ培
养基生根快，根较多且粗壮，有利于组织培养。在试验
过程还发现，在较高激素水平上，再生不定芽会发生玻
璃化现象，降低激素水平可缓解该现象，所以，这可能是
由于高浓度的激素会导致植物细胞内的内源激素发生
较大的变化而造成的。卡那霉素敏感试验中卡那霉素
浓度在０～１５０ｍｇ／Ｌ时叶片正常诱导出大量不定芽；为
２００ｍｇ／Ｌ时，叶片只卷曲，不生成不定芽；超过２００ｍｇ／Ｌ
时，叶片会出现褐化的斑点，最终导致叶片死亡，所以认
为将叶片对卡那霉素的敏感浓度为２００ｍｇ／Ｌ。该试验
结果与宋俊芳等［１０］的结果一致，低于赵万苓等［７］的试验
结果。
该试验仅对大岩桐再生体系进行了研究，筛选了其
叶片对卡那霉素的敏感浓度，为遗传转化过程中对转基
因苗的筛选奠定了基础，但大岩桐的遗传转化工作正在
进行中。
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Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ　Ｂｅｎｔｈ．ａｎｄ
ｔｈｅ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｎ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ
ＹＩＮ　Ｚｈｉ－ｈｕｉ，ＳＯＮＧ　Ｌｉ－ｌｉ，ＳＩ　Ｌｉａｎｇ，ＹＵ　Ｄｉａｎ－ｓｉ，ＧＵＯ　Ｃｈａｎｇ－ｈｏｎｇ
（Ｋｅｙ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｂｉｎ　Ｎｏｒｍａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　１５００２５）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａｓｐｅｃｉｏｓａ Ｂｅｎｔｈ．ａｓ　ｅｘｐｌａｎｔｓ，ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｈｏｒｍｏｎｅ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ　Ｂｅｎｔｈ．ｌｅａｖｅｓ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ　ｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ
ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｌｅａｆ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ＭＳ　ｗｉｔｈ　１．０ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ　ａｎｄ　０．１ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ
１／２ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　０．５ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｒｏｏｔｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ　Ｂｅｎｔｈ．ｗｉｔｈ
２００ｍｇ／Ｌ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ　ｗｅｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ　Ｂｅｎｔｈ．；ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｋａｎａｍｙｃｉｎ
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