全 文 ：0 引言
随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展，国
内外转基因抗病植物研究与产业化已取得突破性进
展,已经鉴定、分离、克隆出了许多抗真菌的病程相关
蛋白（PRs）[1]，大多数具有几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶
活性，能降解真菌细胞壁，这 2种酶共同作用真菌时，
具有很强的协同效应[2]。笔者用已克隆微管束特异表
达蛋白（BSP）基因启动子、几丁质酶基因和β-1,3-葡聚
糖酶基因，构建BSP基因启动子驱动的几丁质酶和
β-1,3-葡聚糖酶基因的双价植物表达载体。通过遗传
转化获得转基因野罂粟植株，为抗黄萎病育种创造新
的种质资源。基因转化多采用基因枪法[3]、农杆菌共
培养[4]等方法，但在野罂粟上，利用花粉管通道法[5-10]转
化的研究尚属首次。
1 材料与方法
1.1 材料
野罂粟花粉受体是由甘肃省农垦农业研究提供
野罂粟花粉受体。质粒PBLGC是由甘肃亚盛集团博
士后科研工作站提供。该基因表达载体含有几丁质
酶和β-1,3-葡聚糖酶标记基因。pBLGC4ml，用TE溶
液稀释至250 μg/ml，共16 ml，质粒寄主农杆菌菌株为
LBA4404。
基金项目：甘肃省科技厅项目“特色农作物生物技术育种创新团队”（098TTCH002）。
第一作者简介：魏玉杰，1967年出生，男，高级农艺师，在读博士，研究方向：药用植物。E-mail：gswwwyj67@163.com。
通讯作者：何庆祥，1964年出生，高级农艺师，研究方向：特色中药材新品种选育。E-mail：Cartman-he@163.com。
收稿日期：2009-08-03，修回日期：2009-08-10。
野罂粟花粉管通道法转双价抗真菌病
基因方法研究
魏玉杰 1，常 瑛 1，张梅秀 1，雒淑珍 1，陈凌娜 2，何庆祥 1
(1甘肃省农垦农业研究院，甘肃武威 733006；2甘肃亚盛集团博士后科研工作站，北京 100101)
摘 要：以野罂粟开放花蕾为受体，以载有几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因双价植物表达载体pBLGC的
质粒为供体，在11%浓度的蔗糖溶液中，加入花粉和含有目的基因的质粒DNA．得到药粉处理液。然
后辅以人工授粉的方法将花粉处理液滴注野罂粟柱头上获得种子，将种子经卡那霉素筛选和PCR检
测，有目的基因特异带出现。获得T1植物。实践证明：在野罂粟上，利用花粉管通道法进行几丁质酶
和β-1,3-葡聚糖酶基因转化方法可行，为特殊中药材转基因技术提供一个新方法。
关键词：野罂粟；花粉管通道法；基因转化
中图分类号：S336 文献标识码：A 论文编号：2009-1561
Pollen Tube Pathway Anti-Fungus Gene Transformation of Papaver nudicaule
Wei Yujie1, Chang Ying1, Zhang Meixiu1, Luo Shuzhen1, Chen Lingna2, He Qingxiang1
(1Gansu State Farms Academy of Agricultural Research,Wuwei Gansu 733006;
2Gansu Postdoctor Workstation of Yasheng Industrial Ltd, Beijing 100101)
Abstract: Plasmid DNA of pBILGC containing Chitinase and β-1, 3-glucanase gene and fresh pollen of Pa⁃
paver nudicaule were mixed in 11% sucrose solution, then the pollen suspension were pollinated on stigmas of
the Papaver nudicaule by artificial pollination. Transformed plants were primarily confirmed by PCR amplifica⁃
tion and kanamycin selection，trangenetic T1 plant were obtained.The experimental results indicated that exog⁃
enous gene could be transformed by the Pollen tube pathway Transformation, and the new breeding method of
Papaver nudicaule was provided.
Key words: Papaver nudicaule, pollen-mediated method, gene transformation
中国农学通报 2009,25(23):99-101
Chinese Agricultural Science Bulletin
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
pBLGC载体携带几丁质酶基因（Chi）和β-1,3-葡
聚糖酶基因（Glu），选取Glu基因合成引物，基因全长
1.27 kb，因基因全长扩增时耗时，根据Oligo6.0推荐引
物，选取基因59 bp，673 bp的位置合成引物，基因片段
634 bp。Upper Primer:5-GGG CTC AAT CGA TAG
GTG TT-3，碱基量 20，合成量 (OD)4，Lower Primer:
5-CGG GAA CCA TCT TGT ACC AC-3，碱基量20，合
成量(OD)4。
1.2 方法
1.2.1 质粒DNA的准备 质粒包含有几丁质酶和β-1,3-
葡聚糖酶基因和作为抗性选择的抗卡那霉素基因。用
碱裂解法制备大量DNA质粒，并用PCR Fragment Re-
covery Kit纯化质粒。
1.2.2 转化方法 前1天的19:00~21:00时标记第2天开
花的植株，在授粉24、36、48 h进行处理（设标记后第2
天开花的长势与处理株一致的植株作为CK）。由于
野罂粟花器官的特点是胚珠多、子房大、柱头多而大、
伤流液粘稠而量大，切柱头时第1刀要重，以便放出分
泌液，1~3 min后用已消毒的卫生纸巾拭去分泌液，紧
接轻切第2刀，1~3 min后用已消毒的卫生纸巾拭去分
泌液，立即用已处理好的质粒滴于已处理的柱头上。
处理的用具需保持清洁，微量注射器用后必须用 70%
的酒精清洗消毒，以免传染病害。为达到一定的基因
转化效率，外源质粒DNA的浓度应不低于 40 μg/L。
在处理柱头时质粒必须放在冰盒中进行。种子成熟后
单收称重统计分析。
1.2.3 β-1,3-葡聚糖酶基因Glu扩增条件 95℃ 7 min，
94 ℃ 45 s，1个循环，94 ℃ 45 s，54.1 ℃ 45 s，72 ℃
1 min，进行 35个循环；最后延伸 72℃ 10 min，4℃保
存。
1.2.4 Glu基因检测体系 Glu基因检测过程中，以所提
的基因组DNA为模板，用合成引物进行扩增，目的片
段大小634 bp，检测体系：Buffer3.0 μl，dNTPs1.5 μl，引
物 2.0 μl，基因组DNA2.0 μl，Taq每 1.0 μl，ddH2O0.5 μ
l，总量30.0 μl。
1.2.5 转基因植株的筛选方法 田间种植前1年已转化
的野罂粟种子，前期不进行间苗。待苗长至 7叶 1心
时，用 6.5 g/L的卡那霉素对其进行喷雾，连续喷雾 5
次，每天2次，9:00以后进行。喷雾后3天，对其出现黄
斑叶的小苗剔除；现蕾期，用 7.5 g/L的卡那霉素对其
进行再次筛选，采用涂抹的方法，连续涂抹 4次，涂抹
后3天，继续对叶片变黄的植株进行剔除；由于涂抹时
有遗漏的植株，间苗后再次用7.5 g/L的卡那霉素对其
进行涂抹，继续剔除叶片变黄的植株。后对未显症的
植株进行分子生物学检测。开花前进行套袋强制自
交。成熟后收获种子来年在病圃进行抗病性测定。
1.2.6 DNA的提取 取田间野罂粟叶片，用密封袋分装
后立即放在-80℃冰箱备用，采用CTAB法提取野罂粟
基因组DNA，用Oligo6.0设计引物，引物由北京奥科
生物公司合成。
2 试验结果
2.1 不同转化时间对野罂粟结籽率的影响
用琼脂 20 g+蔗糖 110 mg+硼酸 110 mg + Ca2 +
200 mg+赤霉素80 mg/L的处理液滴注在柱上头，从表
1~3可以看出，经LSD测定，处理48 h与自然授粉时差
异不显著，而与处理36、24 h差异显著，并达到了极显
著水平，说明野罂粟开花后48 h是利用花粉管通道进
行质粒转化的最佳时期，这时结籽率与自然授粉的相
当，但花后24、36 h利用花粉管通道进行质粒转化，成
熟后野罂粟结籽量小，转化效率低。
2.2 转基因野罂粟PCR检测电泳分析
经 PCR检测后，用琼脂糖凝胶电泳检测，检测结
果见图 1。检测重复 3次，结果：有目的基因转入的样
品有4株。另外，G1-P②电泳显示有弱的目的条带，但
条带太弱相机无法采集到。G1-W36②在3次检测中，
只有1次有带，怀疑扩增时有污染，可以留种以后再做
检测，说明花粉管通道法进行质粒转化在野罂粟植物
表1 不同转化时间的野罂粟籽重
处理
CK
48 h
36 h
24 h
单果均值/g
2.13
1.9733
1.2567
0.1867
显著水平
5%
a
a
b
c
1%
A
A
B
C
变异来源
区组间
处理间
误差
总变异
SS
0.1704
7.0609
0.3184
7.5497
DF
2
3
6
11
MS
0.0852
2.3536
0.0531
F值
1.606
44.354
P值
0.2763
0.0002
表2 方差分析表
表3 LSD法多重比较(下三角为均值差,上三角为显著水平)
No.
CK
48 h
36 h
24 h
均值
2.13
1.9733
1.2567
0.1867
CK
0.1567
0.8733
1.9433
48 h
0.4368
0.7167
1.7867
36 h
0.0035
0.0089
1.07
24 h
0.0001
0.0001
0.0013
·· 100
上是可行的。
3 讨论
花粉管生长到达胚珠时，切开柱头，此时胚珠内
正处于合子时期，花粉通道开张适合进行处理[11]，不同
的作物处理时间不同，通过试验，野罂粟花粉管通道
法进行质粒转化的理想时间是开花后48 h。几丁质酶
基因和β-1，3-葡聚糖酶基因（Glu）是抗真菌性基因，田
间检测结果与PCR检测的结果是一致的，说明在野罂
粟植物上完全可以用花粉管通道法导入外源基因，有
关后代遗传抗病等情况需要进一步研究。
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图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果
注：检测转基因G1样品共12个，另外一个阴性对照。无阳性对照。目的片段大小634 bp。点样孔从左到右：1为marker，条带分别为700、600、
500、400、300、200、100 bp，因位置有限只标注其中一部分，条带100 bp片段太小且弱相机无法采集；4、6、7、13为转基因阳性植株，检测到目的片段；
14为非卡那霉素抗性野罂粟植株（转基因植株涂抹卡那霉素后表现黄斑的植株）所做的阴性对照，无目的片段。

700bp 600bp 400bp 300bp 200bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
700 bp
600
400
300
200
魏玉杰等：野罂粟花粉管通道法转双价抗真菌病基因方法研究 ·· 101