全 文 ：五唇兰（Doritis pulcherrima Lind1.）为兰科五唇
兰属植物， 产于中国海南岛， 亦分布于东南亚一些
国家， 属地生兰类型， 花期 7~8 月， 其花型和株
型都美观， 抗性较强， 是一种很有开发应用前景的
野生兰花 [1]（图 1-a）。 五唇兰的杂交亲和性好， 以
其直接为亲本在英国皇家园艺学会登录的杂交种有
268 个 [2]。 为提高其观赏价值和对环境的适应性，
利用现代生物技术进行遗传育种十分必要。 五唇
兰的无菌播种和组织培养虽有报道 [3-4]， 但并不是
有效的遗传转化体系， 也未见五唇兰遗传转化的
报道。
兰科植物的转基因已有较多研究， 主要研究种
类包括石斛兰、 蝴蝶兰、 文心兰和兰属植物等， 通
常使用的方法为农杆菌介导法和基因枪法， 但这些
方法均需建立在有效的转化体系的基础上， 而兰科
植物的转化体系通常难以建立， 因此兰科植物的转
基因研究进展缓慢 [5-7]。 花粉管通道法转基因是一
种操作简单的遗传转化方法， 已成功地应用于小
麦、 水稻、 玉米、 大豆、 棉花、 烟草、 油菜、 甜
菜、 番茄、 甜瓜、 西瓜等植物中， 但在兰科植物中
未见报道 [8-9]。 大多数兰科植物 1 个果荚中的种子
数量繁多， 利用花粉管通道法进行遗传转化有较大
热带作物学报 2013， 34（8）： 1498-1501
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2013-03-15 修回日期 2013-06-09
基金项目 国家自然科学基金项目（No. 31160400）。
作者简介 王 佳（1987 年—）， 女， 硕士研究生； 研究方向： 植物生物技术。 *通讯作者： 曾宋君， E-mail： zengsongjun@scib.ac.cn。
子房注射法转化五唇兰的初步研究
王 佳1, 2， 曾宋君1*， 陈之林3， 吴坤林1， 张建霞1， 段 俊1
1 中国科学院华南植物园华南农业植物遗传育种重点实验室， 广东广州 510650
2 中国科学院大学， 北京 100049
3 贵州园艺研究所， 贵州贵阳 550006
摘 要 采用子房注射法成功地将外源 DNA 导入五唇兰。 结果表明： 外源 DNA 在转化植株成熟果实中种子的
GUS 染色率达 6.7％， 无菌播种后经潮霉素筛选， 获得 18 株幼苗， 每株幼苗切取幼叶及幼根进行 GUS 检测， 均
为阳性； 随机挑选 7 株幼苗进行 PCR 检测， 均能扩增出 GUS 基因和潮霉素抗性基因条带， 说明外源基因已经
整合到植株基因组内。 子房注射法在兰科植物转基因中的成功应用， 可为兰科植物育种提供一种简单高效的
途径。
关键词 五唇兰； 子房注射法； 遗传转化； PCR
中图分类号 S682 文献标识码 A
Genetic Transformation of Doritis pulcherrima
（Orchidaceae）via Ovary-injection
WANG Jia1,2, ZENG Songjun1, CHEN Zhilin3, WU Kunlin1, ZHANG Jianxia1, DUAN Jun1
1 Key Laboratory of South China Agricultural Plant Genetics and Breeding, South China Botanical
Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong 510650, China
2 University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049, China
3 Horticultural Research Institute of Guizhou Province, Guiyang, Guizhou 550006, China
Abstract The method of ovary injection was first reported for Doritis pulcherrima Lind1. transformation in this
study. Results showed that the GUS staining rate of seeds from the mature fruit by ovary-injection was 6.7％ .
Eighteen hygromycin-resistance plants were gained after screening. Seven plants selected randomly were detected
by GUS assay and PCR analysis of GUS and Hyg, all of them were positive. The results showed the integration
and expression of foreign gene in hygromycin-resistance plants. The successful application of ovary injection for D.
pulcherrima transformation provides a simple and efficient method for the Orchidaceae breeding.
Key words Dendrobium nobile Lindl.； Ovary-injection； Genetic transformation； Polymerase chain reaction
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.08.016
第 8 期 王 佳等： 子房注射法转化五唇兰的初步研究
优势， 但由于大多数兰花的花朵完成授粉后需要
1~3 个才能完成受精作用 [1]， 采用传统的花粉管通
道法易造成 DNA 降解。 因此， 本研究采用子房注
射法结合花粉管通道技术在五唇兰受精时， 直接在
子房中注射外源 DNA， 利用双受精时卵细胞处于
最佳感受态时， 外源 DNA 易于进入和整合的特点
从而完成转化。
1 材料与方法
1.1 材料
受体为五唇兰（Doritis pulcherrima Lind1.）， 种
植于中国科学院华南植物园的温室大棚。 供体为含
有携带 GUS 基因 （gusA）和潮霉素抗性基因 （hpt）
的质粒 pCAMBIA1301。
1.2 方法
1.2.1 子房注射转化 将质粒 DNA 溶于 TE×
buffer 溶液（浓度为 400 μg/mL）。 在温室中对五唇
兰进行人工自花授粉， 在授粉 45 d 后受精时期 [1]。
选择发育较好的子房， 利用微量注射器在垂直于子
房长度的方向将菌液注射入子房内部， 每次注射
25μL， 共注射 12个果荚。
1.2.2 无菌播种 采集授粉后 180 d 的成熟蒴果，
用 75％酒精擦洗果荚， 然后放入 0.1％升汞中浸泡
消毒， 10 min后取出果荚， 用无菌水冲洗 3 次， 再
用消毒后的手术刀将果荚剖开， 取出种子， 将种
子放入灭菌的三角瓶内， 加 0.6％次氯酸钠浸泡
18 min， 用无菌水冲洗 3 次， 过滤后将种子悬浮
播于本实验室发明的 N16 号培养基 [花宝 1 号
（Hyponex I）1 g/L+花宝2号（Hyponex II）1 g/L+蛋白
冻（peptone）2 g/L+活性碳（activated carbon）1.5 g/L+B5
培养基的维生素 +萘乙酸 （NAA）1.0 mg/L +蔗糖
（sucrose）15 g/L+椰子汁 （coconut milk）50 mL/L] [10]，
放于温度28 ℃， 光照时间16 h/d， 光照强度1 600~
2 000 lx的培养室进行培养。 每个果实播 5 瓶。 采
用划线法计数， 每瓶约播种 2 000粒种子。
1.2.3 原球茎的抗性筛选 将种子萌发 60 d 时形
成的原球茎转接至含 30 mg/L 潮霉素的选择培养基
上培养， 30 d后将存活的原球茎转接至潮霉素浓度
为 40 mg/L 的培养基上继续培养， 30 d 后再将存活
的原球茎转接至潮霉素浓度为 50 mg/L 的培养基上
培养， 再过 30 d 将存活的原球茎转至无潮霉素的
N16培养基上培养[11]。
1.2.4 GUS 组织化学检测 将转化处理的材料、
未转化对照材料浸入适量的 GUS 染液中， 37 ℃暗
处保温 12 h 后， 进行无水乙醇脱色 1~2 d 后观察
并拍照。
1.2.5 抗性植株的 PCR 检测 采用十六烷基三甲
基溴化铵（CTAB）法[9]分别提取抗性和对照植株基因
组 DNA， 以 pCAMBIA1301 质粒为阳性对照， 非转
基因植株为阴性对照 。 根据 hpt 基因设计引物 ：
HPTL 5′-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3′ ； HPTR
5′-GTGCTTGACATTGGGGAGT-3′， 根据 gus 基因
设计引物： GUSL 5′-GTGAATCCGCACCTCTGG-3′；
GUSR 5′-ATCGCCGCTTTGGACATA-3′。 20 μL 体
系 ： 植物基因组 DNA 1μL； PCRMix（2×）10 μL；
引物 L 1 μL； 引物 R 1 μL； Taq 酶 0.2 μL， 补加水
至 20μL。 反应条件： 95℃ 5 min； 95℃ 30 s， 58 ℃
30 s， 72 ℃ 1 min， 35 个循环； 72 ℃ 10 min， 4 ℃
保存。 产物经 w=0.8％琼脂糖凝胶电泳检测， 于
UVP凝胶成像系统观察照相。
2 结果与分析
2.1 转化植株种子 GUS组织化学染色检测
未经注射的 3 个果实发育良好， 注射过外源
DNA 的 12 个果荚中， 最终得到成熟果荚 7 个， 注
射导致了一些果荚的败育。 在播种的同时， 每个果
荚留出一竖条带胎座的种子进行 GUS 染色检测，
其中 3 个成熟果荚的种子有 GUS 染色反应， 在每
个果荚检测的约 500 粒种子中， 种子 GUS 平均染
色率为 6.7％（图 1-b）。 另外 4 个果荚中的种子无
GUS染色反应。
2.2 无菌播种
对子房注射处理后的果荚仅对其果皮进行消毒
后， 采用注射部位的种子培养时， 100％的种子被
污染， 而未经注射处理的对照中的种子基本上无污
染。 在对子房注射处理后的果荚经消毒后再对种子
进行消毒后播种， 材料污染情况可有一定程度的降
低， 但仍有 40％~50％的种子染菌， 而对照的果荚
同样处理染菌率仅为 5％。
用本实验室发明的 N16 号固体培养基培养，
对照种子萌发率可达到 66.11％。 而子房注射处理
的种子萌发率仅为 21.85％， 推测子房注射在一定
程度上影响了种子的发育。 子房注射法处理的种子
在萌发 60 d 后形成原球茎， 由于污染率较高， 仅
得到 85个未污染的原球茎。
2.3 幼苗的 GUS 组织化学染色及转化植株分子
检测
经过 3轮潮霉素筛选后， 得到 18株抗性幼苗。
1499- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
a： 五唇兰植株； b： 经 GUS 染色的种子； c： 抗性植株幼根 GUS 染色呈蓝色； d： 对照材料 GUS 染
色无反应； e： 抗性植株幼叶 GUS 染色呈蓝色； f： 经 PCR 检测， 抗性幼苗 GUS 基因及 Hyg 基因均具目
的条带， -： 阴性对照， +： 阳性对照， 1~7： 抗性植株， M： DL2 000 marker。
图 1 五唇兰转化及检测图谱
由于幼苗植株革质化且较厚， 以整株为材料时，
酒精脱色难彻底 ， 影响 GUS 染色效果 ， 且抗性
幼苗GUS 染色反应较微弱， 故切取抗性植株幼叶
及幼根部位进行 GUS 检测 ， 结果显示均为阳性
（图 1-c， e）； 随机挑选 7 株幼苗进行 PCR 检测，
发现均能扩增出 GUS 基因和潮霉素抗性基因条
带， 说明已将外源基因成功整合到植株基因组内
（图 1-f）。
3 讨论与结论
利用花粉管通道法导入外源基因通常有 3种方
法， 分别为子房注射法、 柱头滴加法和花粉粒携带
法， 根据不同的受体植株特点应选择不同的方法以
获得最佳的转化率 [8-9]。 大多数兰科植物具有果实
较大， 子房内有较大空腔， 授粉和受精时间间隔较
长等特点， 适于使用子房注射法对兰科植物进行转
化； 同时， 大多数兰科植物 1个果实中， 种子数量
巨大， 一般 1个果荚中种子量在数万至数十万个以
上， 应用花粉管通道法进行遗传转化时， 即使转化
效率较低， 也能获得较多的转化植株。 花粉管通道
法转化成功与否决定于经花粉管进入胚囊的外源
DNA能否参与受精, 因而确定适宜的导入时间最为
关键[12]。 本研究采用的实验材料五唇兰的受精时间
为授粉后 45 d[1]， 胚胎双受精时卵细胞处于最佳感
受态此时易于外源 DNA 的进入和整合。 本实验也
获得了较高的遗传转化率， 其中成熟果实中的种子
的 GUS染色率达 6.7％。
利用子房注射法得到的兰花种子在无菌播种时
需要采用双重消毒处理， 若种子消毒不彻底， 污染
率较高， 而五唇兰种子萌发较慢， 如果材料带菌太
多， 种子难以萌发形成原球茎和随后的生长发育；
若消毒方式太过强烈， 有可能伤害种子并导致种子
萌发率降低。 本实验中， 由于对消毒方法未进行系
统的研究导致污染过高。 在后续实验中， 可选择合
适的消毒剂和消毒时间进行消毒， 并在播种培养基
中加上广谱抗生素， 及时清理污染材料等方法来控
制污染以降低污染损失。 另外， 本实验采用潮霉素
筛选方式导致死亡的原球茎中， 部分材料 GUS 染
色反应呈阳性， 可能由于原球茎发育初期抗性差所
致， 也可能是在目的基因整合于受体基因组时， 目
的基因发生了断裂， 转入了 GUS 基因的种子未转
入潮霉素抗性基因， 但由于原球茎太小， 难以进行
PCR 检测。 因此， 以后在初次筛选时， 可采用抗
生素浓度不迅速致死幼苗， 同时又可抑制非抗性幼
苗生长为宜， 再逐渐增加筛选浓度， 以获得更多的
抗性幼苗。
本实验中 ， 通过对抗性植株的 PCR 检测 ，
GUS 基因和潮霉素抗性基因均呈阳性， 说明外源
基因可能整合到了基因组内， 至于是否能稳定遗
传， 需要对实验植株的下一代进行进一步的验证。
综上所述， 子房注射法操作简单， 不需要建立兰
科植物的再生转化体系， 它在兰科植物转基因中
1500- -
第 8 期
的成功应用， 可为兰科植物育种提供一种简单高
效的途径。
参考文献
[1] 唐源江， 叶秀麟， 陈泽濂. 五唇兰雌配子体发育和胚胎发生的
研究[J]. 热带亚热带植物学报， 1998， 6（4）： 289-292.
[2] The International Orchid Register， 2012[EB/OL]. [2012-12-31].
http：//apps.rhs.org.uk/horticulturaldatabase/orchidregister/orchidre
gister.asp.
[3] 伍成厚， 叶秀粦， 梁承邺. 五唇兰种子离体培养的研究[J]. 广
西植物， 2005， 25（2）： 149-151
[4] 陈喜蓉， 陈显臻， 钟剑峰， 等. 五唇兰的组织培养和快繁技术
研究[J]. 热带林业， 2006， 34（2）： 34-36.
[5] Teixeira da Silva J A， Chin D P， Van P T， et al. Transgenic
orchids[J]. Scientia Horticulturae， 2011， 130（4）： 673-680.
[6] Hossain M M， Kant R， Van P T， et al. The application of
biotechnology to orchids [J]. Critical Review in Plant Science，
2013， 32（1）： 69-139.
[7] 丁秋露， 赵旵军. 兰花组织培养和分子生物学研究进展[J]. 生
物学杂志， 2010， 27（2）： 76-79.
[8] 简纯平 ，李开绵 ，欧文军 . 花粉管通道法转基因育种研究进
展 [J]. 热带作物学报， 2012， 33（5）： 956-961.
[9] Yang S L， Li G L， Li M G， et al. Transgenic soybean with
low phytate content constructed by Agrobacterium transformation
and pollen-tube pathway[J]. Euphytica， 2010， 177（3）： 375-
382.
[10] Zeng S J， Chen Z L， Wu K L， et al. Asymbiotic seed
germination，induction of calli and protocorm -like bodies，and
in vitro seedling development of the rare and endangered
Nothodoritis zhejiangensis Chinese orchid[J]. HortScience， 2011，
46（3）： 460-465.
[11] 陈之林， 段 俊， 曾宋君， 等. 原球茎为转化受体的农杆菌介
导石斛遗传转化 [J]. 中山大学学报： 自然科学版， 2007， 46
（1）： 86-90.
[12] Sanghai -Maroof M A， Soliman K M， Jorgensen A， et al.
Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley：Mendelian
inheritance， chromosomal location，and population dynamics [J].
Proceedings of the National Academy of Sciences USA， 1984，
81（24）： 8 014-8 018.
责任编辑： 黄东杰
王 佳等： 子房注射法转化五唇兰的初步研究 1501- -