全 文 ：　 狗舌草提取物诱导淋巴细胞性白血病 L1210
细胞分化的研究
陈进军1 , 王建华2
(1. 广东海洋大学 农学院 , 广东 湛江　524088;2.西北农林科技大学 动物科技学院 , 陕西 杨凌　712100)
　　摘要:以单猪屎豆碱(MO)、槲皮素(QU)和环磷酰胺(CY)为参照 ,观察了狗舌草 600 mL /L
乙醇提取物(EX)对淋巴细胞性白血病 L1210细胞体外试验的形态变化;利用流式细胞术 ,从 DNA
分子水平上检查了 EX对 L1210细胞各周期相的影响 ,探讨 EX 对 L1210细胞的分化机理 。结果
发现 ,EX能够使 L1210细胞向淋巴细胞方向发展;经 EX作用 24 h后 , L1210细胞G 0 +G1 期的百
分比较对照组明显升高。提示 EX对 L1210细胞增殖的抑制作用可能是由于 G 1 期的阻滞所致。
关键词:狗舌草提取物;淋巴细胞性白血病 L1210细胞;流式细胞术;细胞分化
中图分类号:S 942. 23:R 73. 733　文献标识码:A　文章编号:1000-6419(2005)11-0892-03
Study on in vitro differentiation of L1210 cells induced by
extract from Tephroseris kiri lowii
CHEN Jin-jun1 , WANG Jian-hua2
(1. Collegeo f Agriculture , Guangdong Ocean University , Zhanj iang 524088 , China;2. Collegeo f Animal Science
and Technolog y , Northwest S ci-Tech University o f Agriculture and Forestry , Yangling 712100 , China)
　　Abstract:Effect o f the 600 mL /L of ethanal solution ex t ract f rom Tephroseris k iri lowii on in v it ro
dif ferentiation of L1210 cells w as observed w ith a reference systems composed of monocro taline , que rcetin
and cyclophospham ide , and ef fect of the ex tract on molecular mult iplicative division of L1210 cells at dif-
ferent cyclic stages w as examined by the f low cy tometry method. Resul ts w ere as fo llow s. The ex t ract w as
able to make L1210 cells transfer into lymphocytes. The proport ion of G 0 +G 1 cells was enhanced signifi-
cantly in comparison w ith that of the contro l. The results show ed that the inhibi ting effect of the ex t ract to
L1210 cells w as at tributed presumably to that G1 cells had been retarded by the ext ract.
Key words:Tephroseris k iri lowii ex t ract;L1210 cell line;f low cy tome try;cellular dif ferentiation
　　据报道 ,狗舌草 (Tephroseris k iri lowi i)除了
具有解痉 、抗溃疡作用之外 ,对白血病细胞 、恶性网
状细胞肉瘤及皮肤癌有较强的抑制作用[ 1 ～ 3] 。淋巴
细胞性白血病 L1210细胞是用甲基胆蒽诱发 DBA /
2小鼠而获得的 1株淋巴性白血病细胞[ 4] 。研究发
现 ,狗舌草 600 mL /L 乙醇提取物(EX)具有抗淋巴
性白血病 L1210细胞的效果[ 5] 。笔者通过本试验
研究了 EX对 L1210 细胞的分化机理 ,以为深入研
究狗舌草的药理作用积累资料 。
1　材料与方法
1. 1　狗舌草提取物及其他试剂
试验用狗舌草(经中国科学院西北植物研究所
鉴定)于秋季采自陕西省陇县关山牧场 ,将其阴干 ,
粉碎 ,贮存于干燥阴凉处。称取 100 g 狗舌草粉 ,用
600mL /L 的乙醇1 000 mL在 56 ℃温浸 12 h ,过滤。
对滤液先减压回收乙醇后浓缩 ,加适量蒸馏水 ,于 4
℃静置过夜后滤去叶绿素等沉淀物 ,再浓缩 ,冰冻干
收稿日期:2005-07-06
基金项目:教育部留学回国人员科研启动基金项目[ 教外司留(2003)406 号] ;国家杨凌农业高新技术产业示范区科技专
项(1999KG13)
作者简介:陈进军(1967 ), 男 ,宁夏中宁人 , 副教授 ,博士。
中国兽医科技　2005 , 35(11):892-894
Chinese Journa l of Veterinary Science and Techno log y
DOI牶牨牥牣牨牰牰牭牰牤j牣issn牣牨牰牱牫牠牬牰牴牰牣牪牥牥牭牣牨牨牣牥牨牨
燥成粉末 ,即为 EX。单猪屎豆碱(monocro taline ,
MO)为兰州大学化学系程东亮教授惠赠;槲皮素
(quercetin ,QU)为北京化工厂产品 ,批号 960911。
注射用环磷酰胺(CY)为江苏恒瑞医药股份有限公
司产品 ,批号 0101082 。RPMI 1640完全培养液 、胎
牛血清为 GIBCO产品。淋巴性白血病 L1210细胞
由第四军医大学实验动物中心细胞室提供。碘化丙
啶(PI)为 Sigma 公司产品 。RNA 酶 A 为华美公司
产品 。Triton X-100为 Biomol公司产品 。TRIS 碱
为 Promega公司产品。ELITE ESP 型流式细胞仪
为美国 Coulter 公司产品 。
1. 2　体外试验对 L1210细胞的形态学影响
将 L1210细胞培养在 RPM I 1640 完全培养液
中 ,取对数生长期的 L1210细胞适量 ,稀释成含细
胞数 0. 5×105 /mL 的悬液 ,接种于 24孔细胞培养
板中 ,同时分别加 EX 、MO 、QU 、CY ,使终浓度分别
为 1. 0 、0. 1 、1. 0和 10. 0 μg /mL。3 d后收集细胞 ,
以 1 000 r /min离心 5 min ,弃上清液 ,涂片 ,干燥后
甲醇固定 3min 。先用瑞氏染液染色1 min ,水洗 ,吸
干水分 ,再用姬姆萨染液染色 11 min ,水洗 ,直立于
铁架上 ,待冷风吹干后在油镜下观察 ,按 L1210 细
胞分化成熟程度分类 、拍照。
1. 3　流式细胞术检测 L1210细胞的周期动力学
1. 3. 1　细胞培养及处理 　将 L1210细胞接种于
RPM I 1640完全培养液 ,在 37 ℃50 mL /L CO 2培
养箱培养 。收集对数生长期细胞 ,按1. 0×105 /mL
浓度接种于 100 mL 培养瓶内 ,培养 24 h后 ,试验组
加入不同药物 ,对照组加入等体积生理盐水。
1. 3. 2　样品制备　将加药后培养 24 h 的细胞约
5×105收集于离心管内 ,以 1 000 r /min离心 5 min ,
弃上清液 , 用 PBS 洗涤 1 次(800 r /min 离心 5
min),在沉淀中加 PBS 0. 1 mL ,轻轻混匀 ,加 700
mL /L 冷乙醇 2 mL ,用吸管将细胞吹打分散均匀 ,
置 4 ℃冰箱固定过夜。
1. 3. 3　L1210细胞周期检测　将固定的 L1210细
胞用 PBS 洗涤 2次 ,在沉淀中加入 100μL PBS ,混
匀 ,再加入含 10 g /L 的 RNA 酶 A 、1. 0 g /L Triton
X-100和 50μg /mL 的 PI(以 pH 7. 5 的 TRIS缓冲
液配制)荧光染色液 500 μL ,室温避光放置 15 min
后即上机检测。每一样品测定 20 000个细胞 ,对细
胞中的 DNA 含量做单参数测定 , 经 PHOEN IX
M ulticy cle 3. 11软件处理 ,计算出加不同试剂细胞
周期时相的百分比 。
2　结果
2. 1　L1210细胞的形态学变化
L1210细胞在体外加 EX及其他试剂后染色镜
检 ,结果如图 1。其中对照组 L1210细胞没有自然
分化的现象。EX组(1. 0 μg /mL)的 L1210细胞有
明显向淋巴细胞方向发展的趋势 。MO 组(0. 1
μg /mL)和 CY组(10. 0μg /mL)细胞均表现明显的
细胞受损 ,胞浆外溢。QU 组(1. 0μg /mL)有极少
细胞胞浆漏出 ,多数细胞有不同程度的胞浆和胞质
结构 、颜色和比例变化 。详见图 1。
2. 2　L1210细胞周期动力学检测
经 EX(1. 0 μg /mL)作用 24 h 后 , L1210 细胞
G 0 +G 1 期的百分比较对照组明显升高 ,提示 EX
对L1210细胞增殖的抑制作用可能是由于G 1期的
图 1　体外试验对 L1210细胞形态的影响 　1 000×
Fig. 1　Effect of the extract on in vitro morphological characteristics of L1210 cells
1. C on t rol;2. EX;3. MO;4. QU;5. CY
893第 11 期　 　　　　　陈进军等:狗舌草提取物诱导淋巴细胞性白血病 L1210 细胞分化的研究
阻滞所致 。经 MO(0. 1μg /mL)作用 24 h 后 , L1210
细胞的各周期时相百分比与对照组相比变化不明
显 ,提示 MO 对 L1210细胞增殖的抑制作用可能是
由其细胞毒性作用[ 5] 所致 ,而对 L1210细胞周期的
影响很小 。QU(1. 0μg /mL)作用 24 h 后 , L1210细
胞G 0 +G 1 期的百分比较对照组明显升高 ,提示 QU
对 L1210细胞增殖的抑制作用可能是由于细胞 G 1
期的阻滞所致。CY(10. 0 μg /mL)作用 24 h 后 ,
L1210细胞的各周期时相百分比与对照组相比基本
没有变化 ,提示 CY对 L1210 细胞增殖的抑制作用
可能是由其细胞毒性作用所致 ,而对 L1210细胞周
期不产生明显影响。结果见表 1 。
表 1　供试药物对 L1210细胞周期时相的影响
Table 1 　Effects of used reagents on L1210 cellular cycle
examined by FCM
细胞周期
C ellu lar cy cle
各组细胞周期时相百分比 /%
Percen tage of cyclic ap pearan ces in dif feren t groups
EX MO QU CY SW对照组 Cont rol
G 0 +G 1 47. 4 29. 9 51. 4 25. 8 23. 2
S 30. 7 41. 6 22. 9 46. 3 45. 8
G 2 +M 21. 9 28. 5 25. 7 27. 9 31. 0
3　讨论
在体外 L1210细胞形态学观察中 ,将每种供试
药物分别配制 5个浓度梯度 ,进行对 L1210细胞分
化的影响试验。结果发现 EX 、MO 、QU 和 CY的药
物浓度分别在 1. 0 、0. 1 、1. 0和 10. 0μg /mL 时 ,对
L1210细胞具有组内相对较好的诱导分化作用。在
供试药物之间 ,其分化诱导效果有明显差异 , 其中
EX和 QU 的分化诱导效果较好 ,而 MO 和 CY 的
分化诱导作用不足而细胞毒性作用有余 。这与
L1210细胞曲线测定及细胞活力检查结果[ 5]一致。
真核细胞的细胞周期分为 G 1 期(DNA 合成前
期)、S 期(DNA 合成期)、G 2 期(DNA 合成后期)和
M 期(细胞分裂期)及 G 0 期。细胞进入 G 1 期后 ,有
3种趋向:一是进入增殖周期 ,处于连续分裂状态 ,
称周期中细胞;二是离开细胞周期 ,进入休眠态(G 0
期);三是向终端分化方向发展 ,行组织特异功能 ,分
裂能力趋向减弱 。处于细胞周期以外的 G 0 期细胞
暂时停止增殖 ,但始终保持有丝分裂的潜能 ,它们与
G 1 、G 2 期之间的转变是可逆的 。肿瘤细胞的细胞周
期动力学特点是细胞群主体分布于 DNA 合成活跃
的 S期 ,而分化细胞群主体分布于 DNA 合成静止
的G 1 /G 0 期 。抗肿瘤药及分化诱导剂可使细胞周
期动力学发生明显变化[ 6 , 7] 。利用流式细胞术检测
供试药物对 L1210 细胞周期动力学的影响 ,表明
EX和 QU对 L1210细胞增殖的抑制作用可能是由
于 G1 期的阻滞所致;MO和 CY 对 L1210细胞增殖
的抑制作用可能是由其细胞毒性作用所致 , 而对
L1210细胞周期的影响很小。L1210细胞形态学观
察和流式细胞术检测结果表明 , EX抗淋巴性白血
病的机理之一是使 L1210 细胞 DNA 代谢发生障
碍 ,细胞阻滞在 G1 /G0 期 ,然后通过内源性(如周期
蛋白)和外源性(如生长因子)细胞周期调控因子而
发挥作用 ,延缓了细胞分裂周期进程 ,进而使 L1210
细胞的分化方向发生改变 ,增殖减慢 。
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