全 文 ：基因组学与应用生物学，2013年，第 32卷，第 2期，第 212-215页
Genomics and Applied Biology, 2013, Vol.32, No.2, 212-215
研究报告
Research Report
基于 cpDNA atpB-rbcL非编码序列分析桫椤种群遗传结构和遗传多样
性，以贵州赤水桫椤国家级自然保护区为例
杨明照 1,2* 应站明 3 喻君生 4
1广州卫生学校,广州, 510450; 2广州医学院卫生职业技术学院,广州, 510450; 3萍乡高等专科学校,萍乡, 337000; 4中山大学,广州, 510275
*通讯作者, mzyang712@163.com
摘 要 以 PCR产物克隆后测序的方法测定了贵州赤水桫椤国家级自然保护区 3个种群 59个个体的叶绿
体 DNA (cpDNA) atpB-rbcL非编码区序列。序列长度介于 727~732 bp之间，具长度多态性，A+T百分比含量
较高，介于 63.27%~63.89%之间。遗传多样性水平较低，表现出较高的单倍型多样性(h=0.639)和低的核苷酸
多样性(Dij=0.000 28)并存的特征，提示现有种群可能源自一个有效群体规模较小的种群的快速扩张，扩张时
间尚短，不足以形成更为复杂的遗传结构。种群间的高基因流 Nm、低遗传分化度 FST、AMOVA分析以及
DNA歧异度结果一致显示各种群间无明显的遗传分化。
关键词 桫椤,叶绿体 DNA atpB-rbcL非编码序列,遗传结构,遗传多样性
Genetic Structure and Differentiation in the Populations of Alsophila
spinulosa Revealed with cpDNA atpB-rbcL Noncoding Sequences, an
Example of Asphole National Nature Reserve in Chishui of Guizhou
Yang Mingzhao 1,2* Ying Zhanming3 Yu Junsheng4
1 Guangzhou Health School, Guangzhou, 510450; 2 College of Health Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou, 510450; 3 Pingxiang
College, Pingxiang, 337000; 4 Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510275
* Corresponding author, mzyang712@163.com
DOI: 10.3969/gab.032.000212
Abstract Chloroplast DNA (cpDNA) atpB-rbcL noncoding sequence of Alsophila spodophylla, collected from
three populations distributed at Asphole National Nature Reserve in Chishui of Guizhou province were sequenced.
Sequence length varied from 726~732 bp, showing length polymorphism, with high A+T content between 63.27%
and 63.89%. High level of haplotype diversity (h=0.639) and a low nucleotide diversity (Dij=0.000 28) were detected
in the populations of Alsophila spinulosa. This suggested rapid demographic expansion from a small effective
population, and, since then, there has been insufficient time to form a more complicated population structure.
Observed high gene flow Nm, low FST, AMOVA analysis and DNA divergence data consistently indicated that no
genetic differentiation should occur at the population level.
Keywords Alsophila spinulosa, cpDNA atpB-rbcL noncoding sequence, Genetic structure, Genetic differentiation
基金项目：本研究由国家自然科学基金资助项目(30771763, 30170101)资助
桫椤(Alsophila spinulosa (Wall.ex Hook.) Tryon)
属桫椤科(Cyatheacea)桫椤属(Alsophila)，是古老的
冰川孑遗植物，有“活化石”之称，国家濒危保护植
物。在距今 1.8亿年前的中生代侏罗纪时期桫椤已
经存在，且分布范围很广，十分繁盛，经第四纪冰川
的侵袭后，其生存受到严重的影响，现今其分布区
己大大缩小(Tryon, 1970)，仅分布在热带、亚热带地
区(Lucansky, 1974; Willis and McElwain, 2002)，在我
国，桫椤自然种群主要分布在广东、广西、台湾、福
建、海南、贵州、四川和云南等地区(夏群, 1989,植物
分类学报, 27(1): 1-16)。
桫椤是研究物种形成与植物地理分布关系，地
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
质学及古生物学的理想材料，尽管近些年在生态、形
态、人工繁殖和物候等方面对其有不同程度的研究，
遗传学方面的研究也取得了一定进展，但其分子群
体研究仍嫌不足。
目前用于系统学研究的叶绿体基因间隔区主要
有 atpB-rbcL、trnC-rpoB、trnL-trnF等非编区，其单亲
遗传及快速近中性的进化方式使之适用于种内地理
亲缘模式的重建(Ferris et al., 1998)，同时 DNA测序
在技术上回避了 RFLP及以 PCR为基础的 DNA指
纹技术无法区分具相同长度但序列不同的片段的局
限性。atpB-rbcL间隔区的通用引物被设计出后，这一
非编码区被广泛用于种群水平系统发育的分析
(Schaal et al., 1998; Huang et al., 2001; Chiang et al.,
1998; Trewick et al., 2002; Lu et al., 2002; Hwang et
al., 2003)。贵州赤水桫椤国家级自然保护区属中亚
热带湿润季风气候，河谷具有类似南亚热带气候特
征，冬无严寒，夏无酷暑，湿度大，达 90%，年降水量
1 200~1 300 mm，云雾雨日多，是全国日照最少地区
之一，河谷全年不足 650 h，山顶也未超过 1 000 h，是
桫椤生长的理想之地。
本研究以保护区内三个种群为材料，通过分析
cpDNA atpB-rbcL非编码序列，检测其遗传多样性及
分化水平，探讨与桫椤种群遗传结构形成有关的因素，
为桫椤的研究和保护提供分子遗传学方面的依据。
1结果与分析
1.1 DNA提取和 PCR产物
提取的桫椤总 DNA 片段大小约为 20 kb 位置
(图 1)，除个别条带有一定程度的降解外，其它条带
带型较好。紫外分光光度测定的 DNA的 A260/A280的
值均在 1.785~2.203之间，显示总 DNA的浓度及纯
度符合实验要求。PCR扩增后，回收产物经过电泳检
测显示条带清晰，无杂带(图 2)，可用于测序。
1.2种群遗传结构及遗传多样性
样品的 cpDNA atpB-rbcL非编码区序列长度介
于 727~732 bp之间，具长度多态性，A+T百分比含
量较高，介于 63.27%~63.89%之间。59个个体共检测
到 9个单倍型，单倍型多样性(h=0.639)较高，核苷酸
多样性(Dij=0.000 28)低，且各种群差别不大(表 1)。
基于桫椤 cpDNA atpB-rbcL非编码区序列变异
计算出种群间基因流 Nm 较高，介于 5.52~6.64 之
间，种群分化度 FST较低，介于 0.000 0~0.034 48 之
间(表2)。AMOVA分析显示有 85.16%的遗传变异来
自种群内(p＜0.001)。从种群间 DNA歧异度角度来分
析，核苷酸差异平均数和每位点核苷酸替换平均数均
较低，分别介于 0.154~0.250之间和 0.000 21~0.000 34
之间(表 3)。
2讨论
研究表明，桫椤种群间有较高的基因流 Nm，考
虑到桫椤种群现代生境的片断化，桫椤科植物孢子
有限的迁移能力以及孢子自身脆弱的生命力(程志英
等, 1990)，推测统计上的高基因流并不一定表示种群
间能够实现高效的基因流，也可能是选择压力相同
造成的。桫椤种群的遗传多样性水平低，表现出较高
的单倍型多样性和低核苷酸多样性并存的特征，这
种式样提示现有种群源自一个有效群体规模较小的
种群的快速扩张(Avise, 2000)。地质研究表明在更新
世形成了寒冷的冰期和温暖的间冰期的多次交替
图 1桫椤总 DNA
Figure 1 Total DNA of Alsophila spinulosa
图 2桫椤 atpB-rbcL回收产物检测
Figure 2 Reclaimed atpB-rbcL frgment of A. spinulosa
种群
Population
Total
LCH
HSG
ZHG
样本数
Sample size
59
19
20
20
单倍型
Haplotype
9
5
6
4
单倍型多样性(h)
Haplotype diversity (h)
0.639±0.058
0.713±0.077
0.632±0.113
0.595±0.098
核苷酸多样性(Dij)
Nucleotide diversity (Dij)
0.000 28±0.000 12
0.000 14±0.000 13
0.000 41±0.000 26
0.000 26±0.000 15
表 1 cpDNA atpB-rbcL非编码序列单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(Dij)
Table 1 Haplotype diversity (h) and nucleotide diversity (Dij) of cpDNA atpB-rbcL noncoding sequence
213
(Bennett, 1990)，冰期种群的缩小，间冰期种群的增
长，能够消除过去积累的核苷酸多样性，但又能快速
导致少数碱基位点的变异，单个碱基的变异可以生
成新的单倍型，但对核苷酸多样性的影响有限，从而
使单倍型多样性相对高，但核苷酸多样性的积累还
需更长时间，奠基者效应和瓶颈效应可能是影响桫
椤种群遗传结构的一个重要原因。桫椤种群间低的
遗传分化度 FST、AMOVA 分析以及 DNA 歧异度结
果一致显示，基于 cpDNA atpB-rbcL非编码区序列
分析，各种群之间无明显的遗传分化。
根据桫椤种群遗传结构和遗传多样性水平，建
议对保护区内桫椤进行就地保护，重视分布点内尽
可能多个体的保护，防止人为的砍伐和生境的退化，
采取策略促进这些群体内的幼苗更新，建立在不同
生态序列内的桫椤种群永久观察点，定期观察与研
表 3种群间核苷酸差异平均数(对角线上)和每位点核苷酸替
换平均数(对角线下)
Table 3 Average number of nucleotide differences (above diago-
nal) and average number of nucleotide substitution per site (be-
low diagonal) between populations of A. podophylla
种群
Population
LCH
HSG
ZHG
LCH
-
0.000 28
0.000 21
HSG
0.230 00
-
0.000 34
ZHG
0.154
0.250
-
表 4桫椤样品采集资料
Table 4 Sampling details of Alsophila spinulosa
种群
Population
两岔河
LCH
葫市沟
HSG
紫黄沟
ZHG
经纬度
Coordinate
E106°01′ N 28°25′
E106°01′ N 28°29′
E105°59′ N 28°25′
海拔(m)
Height (m)
470~557
555~602
459~546
实验用样
Sample size
19
20
20
生境
Habitat
溪边树林,竹林
Woods and bamboo forest beside the stream
溪边竹林,山崖下
Bamboo forest beside the stream, under the cliff
溪边竹林,山崖下
Bamboo forest beside the stream, under the cliff
究桫椤种群的动态发展。在迁地保护、取样以及育种
时，应在较大群体中尽可能多取样，最大限度地保护
桫椤的遗传多样性。
3材料和方法
3.1实验材料
样品采自贵州赤水桫椤自然保护区内 3 个种
群，采样树高 0.6~5.0 m不等，每个种群选取个体之
间距离大于 20 m，将采集的叶片编号，置于硅胶中密
封保存。采样种群分布如表 4所示。
3.2实验方法
3.2.1总 DNA提取
DNA 的提取采用改进的 CTAB 法(苏应娟等 ,
1998; 张岳峰等, 2008)，琼脂糖电泳检测所提取总
DNA片段的大小及质量，紫外分光光度计检测 DNA
样品的浓度和纯度，稀释至 50 ng/μL，用做 PCR 扩
增的模板。
3.2.2 PCR扩增与回收
每 50 μL反应体系含 50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L
MgCl2，10 mmol/L 的 Tris-HCl，0.1% TritonX-100，
dNTP各 0.1 mmol，模板 50 ng，Taq 酶 1.25 U，Pfu
酶 0.3 U，引物 atpB：BACATCKARTACKGGACAA
TAA；rbcL：AACACCAGCTTTRAATCCAA。
引物序列由上海英骏生物技术有限公司合成。
PCR扩增程序 94℃预变性 7min，94℃ 45 s，52℃ 50 s，
72℃ 90 s，32个循环，72℃延伸 10 min。扩增产物在
1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，并在上样孔两端
加入与 PCR产物检测等量的 100 bp DNA Ladder与
目的片段对照。产物经浓缩，电泳分离后回收。
3.2.3克隆测序
回收产物与 pMD18-T载体连接，转入感受态
DH5-α细胞中，于含有 50 ng/mL Amp的平板培养
基于 cpDNA atpB-rbcL非编码序列分析桫椤种群遗传结构和遗传多样性，赤水桫椤国家级自然保护区为例
Genetic Structure and Differentiation in A. Spinulosa Revealed with cpDNA atpB-rbcL Noncoding Sequences
表 2根据 cpDNA atpB-rbcL非编码区比较桫椤种群间的 Nm
(对角线上)和 FST (对角线下)
Table 2 Pairwise comparisons of Nm (above diagonal) and FST
(below diagonal) between populations of A. podophylla based on
cpDNA atpB-rbcL noncoding sequences
种群
Population
LCH
HSG
ZHG
LCH
-
0.000 00
0.034 48
HSG
9.49
-
0.021 05
ZHG
5.52
6.64
-
214
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
基上采用蓝白筛选的方法获得克隆，PCR扩增后电
泳检测 T载体中插入片段的大小，确定阳性克隆，应
用载体两端通用引物 M13F和 M13R 在 3730 自动
测序仪上测序。
3.2.4数据分析方法
用 DNAstar 将阳性克隆测定的正反向序列拼
接，切除两端引物，经 Clustal X比对后，用 DNasp分
析各种群的单倍型多样性 h，核苷酸多样性 Dij，基因
流 Nm和种群分化度 FST。用 Arlequin软件进行分子
变异分析(AMOVA)，求算种群间及种群内的变异方
差分布。
作者贡献
杨明照负责实验的设计，具体实施，数据处理及
论文的撰写；喻君生负责实验材料的采集，参与实验
的操作；应站明负责实验材料的采集和论文的修改。
致谢
感谢国家自然科学基金(30771763, 30170101)对
本研究的资助，感谢贵州赤水桫椤国家级自然保护
区的大力支持，感谢中山大学苏应娟教授的指导，感
谢王伯荪教授对桫椤的鉴定。
参考文献
Avise J.C., ed., 2000, Phylogeography, Harvard University Press,
Cambridge, pp.5-10
Bennett K.D., 1990, Mlankovitch cycles and their effects on
species in ecological and evolutionary time, Paleobiology,
16(1): 11-21
Cheng Z.Y., Tao G.D., and Xu Z.F., 1990, A study on the biolog-
ical characteristics and the endangering factors of Alsophila
spinulosa, Yunnan Zhiwu Yanjiu (Acta Botanica Yunnani-
ca), 12(2): 186-190 (程志英,陶国达, 许再富, 1990, 桫椤
濒危原因的探讨,云南植物研究, 12(2): 186-190)
Chiang T.Y., Schaal B.A., and Peng C.I., 1998, Universal
primers for amplification and sequencing a noncoding spac-
er between atpB and rbcL genes of chloroplast DNA, Bot.
BullAcad. Sinica, 39: 245-250
Ferris C., King R.A., Vainola R., and Hewitt G.M., 1998, Chloro-
plast DNA recognizes three refugia sources of european
oaks and suggests independent eastern and western immi-
grations to Finland, Heredity, 80: 584-593
Huang S., Chiang Y.C., Schaal B.A., Chou C.H., and Chang T.
Y., 2001, Organelle DNA phylogeography of Cycas taitun-
gensis, a relict species in Taiwan, Mol. Ecol., 10 (11):
2669-2681
Hwang S.Y., Lin T.P., Ma C.S., Lin C.L., Chung J.D., and Yang
J.C., 2003, Postglacial population growth of Cunninghamia
konishii (Cupressaceae ) inferred from phylogeographical
and mismatchanalysis of chloroplast DNA variation, Mol.
Ecol., 12: 2689-2695
Lucansky W., 1974, Comparative studies of the nodal and vascu-
lar anatomy in the neotropical CyatheaceaeⅡ . Squamate
genera, Amer. Jour. Bot., 61: 472-480
Lu S.Y., Hong K.H., Liu S.L., Cheng Y.P., Wu W.L., and Chiang
T.Y., 2002, Genetic variation and population differentiation
of Michelia formosana (Magnoliaceae ) based on cpDNA
variation and RAPD fingerprints: Relevance to post-Pleis-
tocene recolonization, Journal of Plants Research, 115 (3):
203-216
Schaal B.A., Hayworth D.A., Olsen K.M., Rauscher J.T., and
Smith W.A., 1998, Phylogeographic studies in plants: Prob-
lems and prospects, Mol. Ecol., 7(4): 465-474
Su Y.J., Wang T., Yang W.D., Huang C., and Fan G.K., 1998,
DNA extraction and RAPD analysis of Podocarpus, Zhong-
shan Daxue Xuebao (Journal of Sun Yat-sen University), 37
(4): 13-18 (苏应娟,王艇,杨维东,黄超,范国宽, 1998,罗
汉松属植物 DNA的提取和 RAPD分析,中山大学学报,
37(4): 13-18)
Trewick S.A., Morgan-RichardsM., Russell S.J., Derson S., Rurn-
sey F.J., Pinter I., Barrett J.A., Gibby M., and Vogel J.C.,
2002, Polyploidy, phylogeography and Pleistocene refugia
of the rockfern Asplenium ceterach: Evidence from chloro-
plast DNA, Mol. Ecol., 11: 2003-2012
Tryon R.M., 1970, The classification of Cyatheaceae, Contrib
Gray Herb, 200: 3-53
Willis K.J., and McElwain J.C., eds., 2002, The evolution of
plants, Oxford University Press, New York, pp.22
Zhang Y.F., Wan L.X., Xu M., and Hou D.B., 2008, A modified
CTAB extraction and inspection for genome of aconitum
carmichael, Hubei Nongye Kexue (Hubei Agricultural Sci-
ences), 47(1): 12-14 (张岳峰,万里翔,徐敏,侯大斌, 2008,
乌头 DNA的改良 CTAB提取和 ISSR检测,湖北农业科
学, 47(1): 12-14)
215