全 文 ：19 9 4年 6月 河北师范大学学报 (自然科学版 )第18卷第2期
广~ 一~ 介. J t 二`~ 咬认色 .竺J
白芷悬浮培养细胞外21 K D钙调素
结合蛋白的鉴定及纯化
河北师范大学生物 来 唐 军 孙大业
摘要 利用生物素一 Ca M 凝胶覆盖技术 , 在白芷忿浮培养细胞外检侧一个
分子童为 Z I K D 的钙调素结合蛋 白 ( C a M b p ) , 并用 S e p h a d e x G 一 1 0 0凝胶过涟柱 ,
C M
一
se p ha or
s e 阳 离子交换柱层析将其纯化 .
关键词 钙调素结合蛋 白 ; 凝胶搜盖 ; 纯化
早在 1 9 8 4年 , iB or . 孙大业等在用放射免疫的方法研究燕麦胚芽鞘细胞中 C a M 的分
布情况时 , 意外发现细胞壁区离心提取液中含有钙调素 ( C al m od ul in , C a M ) , 而且若以单
位总蛋白量计算 , 在细胞各亚组份中 ,细胞壁 C a M 的含量最高 〔` , 。李家旭等用金标免疫电
镜的方法同样证明了细胞壁中 C a M 的存在 〔幻 。 叶正华等 〔 3 ,还从小麦胚芽鞘的细胞壁中分
离纯化了 C a M . 近年来 , 我室的系列工作还表明胞外 C a M 可以促进悬浮培养细胞 ,原生
质体的第一次分裂以及持续分裂〔“ 。 如果细胞外存在钙调素 ,而且有生理效应 , 那么其作
用机理是什么 ?是否也是通过 C a M 结合蛋白 ( aC M B P s )起作用 ?这是我们关心的问题 .
将进 入对数生长期的白芷 悬浮培养细胞 5 0 0 r /m in x s m in 离心 , 上清液经 滤纸 , .0
4 5拜m 微孔滤膜过滤 ,滤液为获取的无细胞培养介质 。离心沉淀下的细胞 ,用 d H ZO 洗涤两
次 ,每次 Zm in , s o o r丫m in X s m in 离心去上清液 。 得到的细胞用 0 . IM C a CI : 的预冷溶液在
落℃条件下处理 20 m in ,再按上述步骤离心过滤得到 0 . IM C a 1C 2的盐提溶液 . 分别在获取的
介质和盐提溶液中加入 2 . 5倍体积的预冷乙醇 , 终浓度为 70 % , 4℃下过夜 , l o 0 0 0 r /m in X
l o m in 离心得到 乙醇沉淀蛋白质 。 为了检测细胞破裂程度 , 分别测定了培养介质 , 盐提溶
液及各自的 70 % 乙醇沉淀物中 ,细胞质标记酶 6 一磷酸葡萄糖脱氢酶的活力 ,均未检测到该
酶的存在 ,表明在整个处理过程中细胞基本未破裂 ,得到的样品均来自胞外 。
样品按 L ea m m il 的方法 ,在 1 2 . 5%分离胶浓度下进行 S D S 一 P A G E , 继在 190 m A 条
件下 , 电转移到 0 . 2 拌m 20 的 N C 膜上 , N C 膜用 5%进 口脱脂奶粉封闭 , 然后用生物素标记
的 C a M 做探针 , 分别在 l m M C a Z十 , sm M EG T A 存在的条件下 ,对 N C 膜进行覆盖 ,再用辣
根过氧化物酶标记的亲和素检测系统显色 。结果表明在有 C a Z + 条件下 ,有一条分子量为
ZI K D 的主要条带 。 其中盐提样品中的更为明显 ,介质部分必须在上样总量很大的情况下
才 能检测到 。 在 E G T A 存在 (即无 C a +2 )的条件下 ,该条带明显减弱 ,表明 ZI K D 蛋白是
· 该文 19 9 4年 4月收到
1 2 2 河北师范大学学报 ( 自然科学版 ) 第1 8卷
Ca M b p
, 而且 和 C a M 的结合是依赖于 C a卜 的 。 按文献朗 , 提取 白芷 细胞的细胞 壁 , 用
。 . IM C a CI :进行同样的处理 , 也检测到该 2 1K D 的蛋白 , 表明 ZI K D 的 C , M b p , 至少存在
于细胞壁中 , 大部分处 于离子结合态 , 也有部分处 于游离状态 . 用 P A S卿方法对 SD S -
P A G E 进行糖蛋白检测 ,结果显示该ZI K D C a M b p 是一种糖蛋白 。
为了纯化此 ZI K D C a M饰 ,将得到的70 %乙醉沉淀用适量 p H S . 7的 s o m M 丙酸缓冲
液溶解并透析过夜 , 1 5 o o o r / m i n 离心 Z o m i n , 留上清液过 eS p h a d e x G一 1 0 0凝胶过滤柱 ( 1 .
6 x 7 6 e m )
,经 S D s 一 P A G E ,银染检测合并含 Z I K D C a M bp 的洗脱液收集管 ,再过经同样缓
冲液平衡的 C M 一 S eP h a or s e 阳离子交换柱 (l . 6 x sc m ) ,用平衡缓冲液充分洗脱后 ,换用含
。 . 02 M N a cl 的缓冲液洗脱 , 直至无蛋 白流出为止 , 再换用含。 . 04 M N a cl 的缓冲液洗脱 ,
收集流出液 , 浓缩 ,经 S D S 一P A G E 鉴定为一条带 ,薄层扫描表明纯度达 92 % . 经 aC M ge l
vo er la y 再次鉴定 ,确为需要的 2 1K D C a M b p ;而且该蛋白可以抑制依赖于 C a M 的 N A D K
酶的活性 , 抑制程度和该蛋白加入的量呈正相关 ,说明其具有 C a M bp 的一般特性 .
G or ck er 等亦曾报道在动物细胞外存在 C a M ,并促进淋巴细胞增殖 〔” , 但至今国内外
对胞外 C o M 的生理作用机理未见任何研究报道 。我们从白芷悬 浮培养细胞外检测出
ZI K D aC M bp 并成功地加以纯化 , 不仅进一步说明胞外 C a M 具有功能的现实性 , 而且为
研究其机理开辟了道路 。
参 考 文 献
1 iB or R L
.
S u n D a y e
, e t a l
.
P l a n t p h y s i o l
,
19 8 4
,
75
: 3 8 2~ 3 8 6
2 李家旭 , 孙大业 . C e l l R。 : ea cr h , 1 99 3 ( 3 ) : 1 1 ~ 2 0
3 叶正华 , 孙大业 ,郭季方 . 科学通报 ,一9 8 a , 53 ( s ) : ` 2弓~ 6 2`
4 李红兵 ,程刚 , 孙大业 . 科学通报 , 1 , 9 2 , 1 9 : 1 80 4~ 1 8 0 7
5 D a v id A st u a : t
,
Jao e Ph E V a m e r
.
P la n t P h y 。王0 1 , 1 9 8 0 , 6 6 : 7 8 7 ~ 7 9 2
6 G K o n a t
,
H o f f n e r
,
J M e lla h
.
E x Pe r i e , , t i a
,
1 9 8 4
,
4 0
:
3 0 3~ 3 0 4
7 G ocr k
e r G
, e t a l
.
B ico h
e , n
J
,
19 8 8
,
2 5 3
:
8 7 7~ 8 8 4
I通e 鲍止孟f i c 纽之旦Q联 纽n d P u r 直f i C a t i o n o f A 2 1 K D
E x tr 祝 d l u 夏器 C毓 m o d u l执一 b i n 翻亚9 P or t e执 in A n ge il a
D e h盯抚 a S us p e邺 i o n C u n ur e C el ls
T a n g J u n S u n D a y e
A b s t r a e t A Z I K D m a jo r C a M b p w a s d e t e e t e d i n t h e e x t r a e e l l u l a r a e r a o f A n g e l i a
d e h u r i e a s u s p e n o i o n e u l t u 代 e e l l s 一l s i n g b i o t i n y l a t e d C a M g e l o v e r l a y t e e h n iq u e s , a n d w a s
p u r i f i e d b y p
a s s i一、 g t h r o o g h a g e l f i lt e r e o l u m n a n d a e a t io n e x e l、 a n g e e o l u xn n e h r o m a t o g -
r a p h y
.
K o y w o r通。 C a M b p s ; g e l o v e r l a y ; P u r i if e a t i o n