全 文 ：桫椤 atpB-rbcL序列 2种测序方法的比较分析
李 媛 1 , 侯可雷 1 , 张静 2 ,赵涛 3 , 刘志兵 3
(1.日照职业技术学院 ,山东日照 276826;2.山东省青岛市城市园林局浮山管理处 ,山东青岛 266200;3.山东省徂徕山林场 ,山东泰安 271000)
摘要　[目的 ]比较 2种方法进行桫椤 atpB-rbcL序列测定的测序效果。 [方法]通过 PCR产物直接测序和克隆测序对桫椤叶绿体atpB-
rbcL基因间隔序列进行测定与分析。 [结果]结果表明 ,桫椤 atpB-rbcL序列直接测序所得峰形紊乱 , PolyT后出现多重峰;克隆测序结果
峰形清晰 ,无干扰。 [结论]对于桫椤 atpB-rbcL序列测定 ,克隆测序优于直接测序。
关键词　桫椤;PCR产物直接测序;PCR产物克隆测序;atpB-rbcL非编码区
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)20-09405-02
TheComparativeAnalysisofatpB-rbcLSequenceinAlsophilaspinulosaObtainedbyDirectandClonedSequencing
LIYuanetal　(RizhaoPolytechnic, Rizhao, Shandong276826)
Abstract　 [Objective] TheresearchaimedtostudythesequencingefectsofatpB-rbcLsequenceofAlsophilaspinulosawithtwodiferentmeth-
ods.[ Method] TheresultsofdirectsequencingofPCRproductsorsequencingbycloningPCRproductsofatpB-rbcLuncodingregioninA.spin-
uosawerecomparedandanalyzed.[ Result] TheresultsshowedthattheprofileofdirectsequencingwasdisorderedandoverlappedafterPolyT.
Theprofileofclonedsequencingwasclearanddidnotoverlap.[ Conclusion] DirectsequencingofPCRproductswasbeterthansequencingby
cloningPCRproductsoftheatpB-rbcLsequenceinA.spinulosa.
Keywords　 Alsophilaspinulosa;SequenceanalysiswithPCRproducts;SequenceanalysiswithcloneofPCRproducts;atpB-rbcLnoncodingse-
quence
作者简介　李媛(1982-), 女 ,山东临沂人 ,硕士 , 助教 , 从事植物分
子生物学研究。
收稿日期　 2009-03-31
　　目前用于系统学研究的叶绿体基因间隔区主要有 atpB-
rbcL、trnC-rpoB、trnL-trnF非编码区等。间隔区不参加转录翻
译过程 ,在功能上限制较少 ,变异较自由 ,与相当长度的编码
区片段相比 ,这些非编码区能提供更多的具系统学意义的信
息位点 ,故多用于较低分类阶元及近期分化类群间的系统学
研究中 [ 1] 。近年来 ,叶绿体非编码区还被用来分析现存种群
的遗传多样性及地理亲缘关系 [ 2-7] ,其单亲遗传方式及快速
近中性的进化方式使之适用于种内地理亲缘模式的重建 [ 8] ;
同时 , DNA测序在技术上回避了 RELP及以 PCR为基础的
DNA指纹技术无法区分具相同长度但序列不同的片段的局
限性。
rbcL基因位于大单拷贝区上 ,编码 1, 5-二磷酸核酮糖羧
化酶 /氧化酶大亚基。 atpB基因位于 rbcL基因之后 ,长约
1 500 bp,编码 ATP合成酶(ATPSynthase)的 β亚基。在叶
绿体基因组中 atpB基因与 rbcL基因相邻(图 1),它们之间
有一段长度在 500 ～ 900 bp的基因间隔区相连 ,即 atpB-rbcL
非编码区。Chiang[ 9]设计了该间隔区的通用引物 ,将其用于
种群水平系统发育的分析 ,使之得到广泛的应用 [ 10] 。然而 ,
对桫椤 atpB-rbcL序列测定选择 PCR产物直接测序还是克隆
测序尚未有报道 ,鉴于此 ,笔者对相同样品 PCR扩增产物分
别进行直接测序和克隆测序 ,然后对得到的结果进行比较分
析 ,评价不同方法的测序结果。
1　材料与方法
1.1　材料　采集了分布在福建 、重庆 、贵州 、广西等地共 9
个种群 ,海南 1个种群 ,总共 10个桫椤种群的样品 。
1.2　方法
1.2.1　总 DNA提取。采用改进的十六烷基三甲基溴化胺
(CTAB)法 [ 11] 。测定紫外光吸收以确定 DNA浓度和纯度 ,
图 1　atpB-rbcL非编码区示意
Fig.1　Non-codingregionschematicdiagramofatpB-rbcL
琼脂糖凝胶电泳检查 DNA完整性 。
1.2.2　叶绿体 atpB-rbcL非编码区 PCR扩增 。经预试验优
化条件后确定 PCR反应程序为:94 ℃预变性 7 min, 94 ℃变
性 45s, 52℃退火 50 s, 72 ℃延伸 90s, 32个循环 , 72℃延伸
10min, 4 ℃保温。所有反应在 GeneAmpPCRSystem2400
(PerkinElmerCorporation)上进行 。反应体系:10×PCRBuf-
er(Mg2+)5 μl, dNTP(10 mmol/L)1.0 μl, Taq酶(5 U/μl)
0.25 μl, Pfu酶 1/3 Taq单位 , DEPC水 41.75 μl。atpB引物
(25μmol/L)0.75 μl, rbcL引物(25 μmol/L)0.75 μl,引物
atpB:ACATCKARTACKGGACCAATAA, 引物 rbcL:AACAC-
CAGCTTTRAATCCAA。引物由上海博亚生物技术有限公司
合成。 PCR产物用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 ,电泳后切胶
回收 ,利用 UNIQ-10柱式 DNA胶回收试剂盒纯化回收目的
片断。
1.2.3　atpB-rbcL非编码区直接测序。回收的目的片断在
ABI377自动测序仪进行正反双向测序 ,利用 BioEdit5.0软
件拼接得到全序列。
1.2.4　目的片断的克隆及测序 。回收所得 PCR产物与
PMD18-T载体连接 ,转化导入由大肠感菌 DH-5α所制的感
受态细胞中 ,采用蓝白斑筛选法获得克隆。应用质粒电泳和
酶切的方法确定阳性克隆。所得阳性克隆在 ABI377自动测
序仪上测序。
2　结果与分析
2.1　PCR产物直接测序　样 LD1回收产物直接测序 ,序列
中存在一个长度在 12 bp左右的 PolyT(或 PolyA), PolyT后
出现多重峰 ,如图 2所示。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(20):9405-9406 责任编辑　张彩丽　责任校对　卢瑶
图 2　直接测序结果
Fig.2　 Directsequencingresults
2.2　PCR产物克隆测序　样 LD1回收产物测序结果峰形
清晰 ,无干扰 ,如图 3所示。
图 3克隆测序结果
Fig.3Cloningsequencingresults
3　结论与讨论
用叶绿体 atpB-rbcL基因间隔序列对系统发育进行分
析 ,需要测定大量的序列 ,因而省时省力的直接测序法明显
优于耗时及步骤繁琐的克隆测序 [ 12] 。直接测序反应相对于
克隆测序有以下的优点:首先 , PCR产物直接测序可以反映
模板的真实情况。在 PCR过程中 ,由于 Taq聚合酶的特性 ,
在过程中会出现一定的错配 ,导致测序数据的错误 ,克隆测
序由于只是对单一分子的测序 ,如果含有错配碱基的某个分
子阳性克隆被挑取进行测序 ,则该错配被固定 ,成为代表该
样品的序列数据 ,解决办法之一是可以多挑选几个阳性克隆
测序后进行比对分析;直接测序是对所有扩增分子总体序列
状况的反映 ,其中在聚合反应时出现的低几率错配信号会被
大部分正确的信号覆盖 ,因此 , PCR产物直接测序可以反映
模板的原始状况 [ 13] 。其次 ,节省试验费用和时间。克隆测
序要经过 PCR扩增 、检测 、回收片段 、菌样感受态制备 、连接 、
转化 、培养 、PCR检测阳性克隆 、提取质粒等多个过程 ,花费
大量时间和经费;而直接测序只需前 3个步骤 ,费用很低 。
但并不适用于桫椤 atpB-rbcL序列扩增产物的测序。因为将
桫椤 atpB-rbcL序列扩增产物直接测序时发现序列中存在一
个多聚的 T(PloyT), PolyT后的测序结果出现套峰现象 ,峰形
较差。之所以出现这种现象可能是由于 Taq聚合酶进行聚
合反应时 ,由于 A或 T的连续 ,无法完全分辨每个 A(或 T),
造成测序结果紊乱 ,出现 “打滑现象 ”。由于桫椤叶绿体
atpB-rbcL序列自身的特点 ,需采用克隆测序。为提高克隆测
序的准确性 ,试验中挑选 3个阳性克隆测序后进行比对分
析。对于克隆测序 ,使用 Pfu高保真聚合酶进行反应(具有
3 -5外切酶校正活性 ,错误率约为 1.3×10-6 ,但其聚合效
率不如 Taq酶)。直接测序与克隆测序各有特点 ,直接测序
快速方便 ,而克隆测序繁琐费力 ,因此研究者往往都趋向于
采用 PCR产物直接测序 ,但当模板 DNA有限制时 ,克隆测序
又有其优势。
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